Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12-41
Глава I - БАКТЕРИАЛЬНАЯ ЗАГРЯЗНЕНГОСТЬ ПИЩЕШХ ПРОДУКТОВ 12 Глава 2 - МЕТОДІ ОБНАРУЖЕНИЯ ЬНТЕРОІЮКШВ, СТАФИЛОКОККОВ
И ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ В ИССЛЕДУЕМОМ МАТЕРИАЛЕ 27
Глава 3 - ШШЮЛЮМИНЕСЦЕНГШЙ МЕТОД КАК ОДИН
ИЗ МЕТОДОВ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ 36
Глава 4 - МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИ ИССЛЕДОВАНИЯ 42-61
Микробные культуры 42
Бактериологическое обследование
молочных продуктов: 43
4.3. Идентификация выделенных
из продуктов культур 45
Идентификация энтерококков 45
Идентификация стафилококков 46
Идентификация энтеробактерий 46
4.4. Серологические метоЦцы исследования 47
4.4.1. Приготовление иммунных
сывороток против энтерококков 47
Приготовление моноспецифических антистафилококковых сывороток 49
Серотипирование энтеробактерий 50
4.5. Иммунолюминесцентный метод
исследования 55
4.6. Статистическая обработка данных 60
Стр.
ДАННЫЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 62-144
Глава 5 - ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНМШОККОВЭЙ
КОНТАМИНАЦИИ ТВОРОГА И СМЕТАНЫ 62-93
Новая дифференциально-диагностическая среда для ускоренного определения фекальных стрептококков 62
Динамика развития энтерококков
в процессе выработки творога
атор
в лаборных условиях 68
5.3. Подбор оптимальной среды
для определения протеолитических
свойств у энтерококков 71
Упрощенная схема идентификации энтерококков ?2
Исследование творога и творожных
изделий на наличие энтерококков 75
5.6. Исследование энтерококкового
обсеменения сметаны на разных стадиях
ее промышленного производства 76
5.7. Применение иммунолюминесцентного
метода для ускоренного выявления
энтерококков ЬО
Глава 6 - ИЗУЧЕНИЕ ОДЕРЖАННЯ СТАФИЛОКОККОВ В СМЕТАНЕ 94-113
6.1. Исследование стафилококкового
загрязнения сметаны разного срока
хранения 94
6.2. Обнаружение стафилококков
в сметане в процессе ее производства 102
Стр. 6.3. Иммунолюминесцентная диагностика
стафилококков 108
Глава 7 - ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИЙ КИШЕЧНОЙ ГРУПШ
В СМЕТАНЕ II4-I44
7.1. Обнаружение бактерий кишечной группы
в сметане в процессе ее производства 114
7.2. Возможности бактериологического
выявления патогенных
энтеробактерий в сметане 118
7.3. Высеваемость возбудителей острых
кишечных инфекций, внесенных
в сметану, приготовленную
из стерильных сливок 123
Апробация метода иммунолюминесцентной микроскопии для количественного учета энтеробактерий в молочных продуктах 126
Экспериментальное изучение развития популяции патогенных энтеробактерий
в сметане 128
Воздействие микрофлоры заквасок разного видового состава на интенсивность размножения патогенных бактерий 134
Влияние исходной кислотности среды на развитие стафилококков и
патогенных энтеробактерий 138
7.8. Возможность изменения биологических и
культуральных свойств патогенных
энтеробактерий при совместном
культивировании их с микрофлорой закваски
в процессе приготовления сметаны 141
Стр.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 145
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 159
швода 161
ПРИЛОЖЕНИЕ 163
СПИСОК ИСГОЛЬЗОВАНЮй ЛИТЕРАТУРЫ 167
\
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИИ. Проблема выпуска пищевых продуктов, безопасных в эпидемиологическом отношении, является чрезвычайно важной в плане охраны здоровья населения. Наибольшую опасность представляет загрязнение продуктов переработки молока условно патогенными микроорганизмами - энтерококками, стафилококками и патогенными энтеробактериями. По действующему положению лаборатории предприятий, производящих молочные продукты, не могут проводить стандартную идентификацию патогенных и условно патогенных микроорганизмов, выделяемых из исследуемого материала, в связи с опасностью распространения инфекции. Применяемые методы бактериологического контроля не позволяют давать быстрое заключение о качестве продуктов. Результаты бактериологического исследования поступают уже после регламентируемого срока их реализации. Экспресс-методы оценки микробного загрязнения пищевых продуктов в настоящее время практически не используются. Существующая ситуация чрезвычайно обостряет необходимость разработки комплексной схемы микробиологического обследования молочных продуктов для обнаружения энтерококков, патогенных стафилококков и наиболее распространенных видов возбудителей острых кишечных инфекций.
Вопрос о загрязняющей микрофлоре готовой сметаны, особенно о содержании в ней энтерококков и стафилококков, не изучен. Планомерные исследования по оценке микробной обсемененности продукта на разных этапах приготовления сметаны и по характеристике выделяемых культур также не проводились. Таким образом,исследование бактериального загрязнения сметаны является одной из актуальных задач санитарной микробиологии.
Наконец, весьма важной представляется оценка процесса приготовления кисломолочных продуктов с точки зрения лопуляционной микробиологии, включая вопросы межвидовых отношений основной культуры и "засорителей" (по терминологии Н.С.Печуркина, 1978), влияния на постороннюю микрофлору величины и качества вносимой закваски, воздействия'
7 прогрессивно развивающегося закислення среды на "засорителей" и процесса вторичного заселения экологической ниши, освобождающейся после пастеризации сырья.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью исследования было определение популяционной характеристики микрофлоры сметаны и творога, включая молочнокислые бактерии, входящие в состав заквасок, а также микроорганизмы, наиболее часто загрязняющие эти продукты; решение научной задачи микробиологического обоснования эффективного лабораторного контроля бактериальной обсемененности молочных продуктов; определение количества и свойств наиболее распространенных микроорганизмов, выявляемых в молочных продуктах в процессе их производства.
Для достижения этих целей необходимо было решить следующие задачи:
создать новую схему микробиологического обследования молока и молочных продуктов, позволяющую в короткие сроки получать основные данные о загрязнении исследуемого материала энтерококками, стафилококками, энтеропатогенными кишечными палочками (ЭПКП) и шигеллами Зонне. Для этого следовало разработать дифференциально-диагностическую среду для выявления энтерококков в первичных посевах и получить качественные иммунные препараты для люминесцентно-микроскопического обнаружения патогенных стафилококков, энтерококков и ЭПКП, а также провести оценку чувствительности этого метода;
дать количественную оценку обсеменения продукта энтерококками, стафилококками и патогенными энтеробактериями на разных этапах промышленного изготовления сметаны и творога;
исследовать биологические свойства культур, выделяемых из сырого молока и кисломолочных продуктов в процессе их производства;
определить закономерности развития микробных популяций патогенных и условно патогенных микроорганизмов в условиях запустевшей экологической ниши после пастеризации сырья, а также при совместном
8 выращивании с микрофлорой заквасок и нарастающей кислотности продукта.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
Предложена новая схема бактериологического анализа молочных продуктов, значительно сокращающая сроки обследования и дающая возможность количественной оценки микробного загрязнения путем посева на новую плотную среду - конго-сорбитный агар - для обнаружения энтерококков и применения усовершенствованных иммунологических препаратов для иммунолюминесцентной микроскопии патогенных стафилококков, энтерококков и микробов кишечной группы.
Пастеризация сырья практически ликвидировала его массивное первичное микробное загрязнение, после чего происходила вторичная контаминация, приводящая к накоплению большого числа микроорганизмов, причем различие в свойствах выделяемых культур одного вида свидетельствовало о множественности источников микробного загрязнения продукта. В исследованных образцах отсутствовали патогенные виды микробов кишечной группы.
Стафилококки и энтерококки, участвующие во вторичном заполнении экологической ниши в процессе приготовления сметаны и творога, в отличие от микробов, формирующих первичное обсеменение сырья, относились в основном к биологически малоактивным формам - эпидер-мальным стафилококкам и Si. fuLeclusn.
Снижение уровня вторичного загрязнения может быть достигнуто широким внедрением закрытых циклов приготовления сметаны и применением увеличенных концентраций заквасок.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Создана новая схема микробиологического анализа молочных продуктов, отличающаяся существенным сокращением сроков обследования и возможностью конкретной оценки загрязнения продукта определенными видами микроорганизмов. Для этого:
разработана новая дифференциально-диагностическая плотная
9 среда "конго-сорбитный агар" (КСА) для выявления $и других энтерококков;
предложен новый способ получения поливалентной иммунной сыворотки для иммунолюминесцентного выявления и серологической идентификации патогенных стафилококков, отличающийся тем, что с целью упрощения способа, иммунизацию животных проводят одним штаммом стафилококка (вместо четырнадцати), обладающим одновременно признаками патогенности, вирулентности и антигенной общностью со всеми штаммами стафилококков международной коллекции;
впервые приготовлен очищенный препарат иммуноглобулина О- для серологической и иммунолюминесцентной диагностики энтеропатогенных кишечных палочек 0124, отличающийся повышенной специфичностью.
Впервые детально исследовано загрязнение сметаны энтерококками и стафилококками и дана развернутая характеристика выделенных микроорганизмов. Установлено, что стафилококки и энтерококки, участвующие во вторичном заполнении экологической ниши после пастеризации сырья в процессе приготовления сметаны, в отличие от микробов, обсеменяющих исходный продукт, относятся в основном к биологически малоактивным формам.
В экспериментальных популяционных моделях получены данные о том, что патогенные энтеробактерии в пастеризованных сливках размножаются с максимальной интенсивностью; при совместном культивировании с микроорганизмами закваски их размножение существенно огра- ч ничено, а в готовой сметане энтеробактерии практически не размножаются и отмирают в течение коротких сроков.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Предложенные схемы индикации и идентификации находящихся в молочных продуктах энтерококков, стафилококков и микробов кишечной группы могут широко применяться в бактериологических лабораториях. Они отличаются от применяемых схем
10 обнаружения этих микроорганизмов значительным сокращением сроков исследования. Обосновано применение дополнительных мер по предупреждению бактериального загрязнения сметаны после пастеризации сырья вплоть до сквашивания продукта.
По материалам работы составлены и утверждены инструкции:
"Экспресс-метод определения S. &i/Zu$ в молоке и сметане с использованием люминесцирующих антител" (1978);
"Экспресс-метод определения энтеропатогенных кишечных палочек в сметане с использованием люминесцирующих антител" (1980).
Полученные в работе данные использованы при составлении "Изменений к инструкции по приготовлению и применению заквасок для кисломолочных продуктов на предприятиях молочной промышленности" (1980).
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на конференции Эстонского отделения Всесоюзного микробиологического общества (Таллин, 1978), на научной конференции отдела микробиологии и иммунологии научно-исследовательского института экспериментальной медицины АМН СССР (1982) и на научных конференциях кафедры микробиологии Ленинградского государственного университета имени А.А.Жданова (1982, 1983). Материалы исследований использованы при проведении семинарских занятий для врачей-бактериологов и сотрудников Кировской и Петроградской Районных санитарно-эпидемиологических станций г.Ленинграда (1977, 1978).
ПУБЛЖАЩИ. По теме диссертации опубликовано 8. печатных работ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, главы, посвященной методам исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, указателя цитируемой литературы, включающего 137 отечествен-
62 ных и иностранных источников. Основной текст диссертации изложен
на 129 страницах. Работа иллюстрирована 38 таблицами и 10 рисунками.
