Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Химико-токсикологическая характеристика ПХБ 9
1.2 Метаболизм ПХБ микроорганизмами-деструкторами 12
.1.3 Детоксикация почв, загрязненных ПХБ, с помощью физико-химических методов 13
.1.4 Микробная деградация ПХБ в почве 15
1.4.1 Активизации естественной микрофлоры почвы 16
1.4.2 Интродукции штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ в почву 17
1.4.3 Выделение микроорганизмов-деструкторов ПХБ из почв 18
1.4.4 Изучение безопасности микроорганизмов-деструкторов ПХБ для теплокровных животных 20
1.4.5 Технологии биоремедиации почв, загрязненных ПХБ 21
1.5 Заключение 22
2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы и методы исследования 25
2.1.1 Отбор почвенных образцов и их обработка 25
2.1.2 Определение ПХБ в пробах методом газожидкостной хроматографии 26
2.13. Состав питательных сред 26
2.1.4 Идентификация выделенных микроорганизмов-деструкторов ПХБ 31
2.1.5 Изучение характеристик комплекса почвенных микроорганизмов дерново-подзолистой почвы 31
2.1.6 Определение безопасности штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ 33
2.1.7 Определение токсичности почвы с помощью дафний 34
2.1.8 Определение морфологических, биохимических и иммунологических показателей крови крыс 37
2.1.9 Статистическая обработка результатов 37
3. Выделение новых природных штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ 38
3.1. Оценка безопасности выделенных штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ для теплокровных животных 46
3.2. .Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ 48
4. Основные технологические параметры культивирования выделенных микроорганизмов-деструкторов ПХБ 52
5. Выявление оптимальных параметров деструкции пхб в почве 54
6. Характеристика микробного сообщества дерново-подзолистой почвы, загрязненной пхб 61
7. Влияние микроорганизмов-деструкторов пхб на естественную почвенную микрофлору 66
8. Изменение количества микроорганизмов-деструкторов пхб в почве в процессе биоремедиации 68
9. Деструкция пхб микроорганизмами в почве (полевые испытания) 69
9.1. Оценка интегральной токсичности почвы в процессе ее санации 76
9.2. Установление хронической токсичности санированной почвы для теплокровных животных 85
Заключение 95
Выводы 99
Список литературы 101
- Химико-токсикологическая характеристика ПХБ
- Микробная деградация ПХБ в почве
- Определение ПХБ в пробах методом газожидкостной хроматографии
- Оценка безопасности выделенных штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ для теплокровных животных
Введение к работе
Поколение людей, живущих на Земле сегодня, не должно удовлетворять свои нужды за счет лишения будущих поколений возможности жить на чистой планете. Люди в своей хозяйственной деятельности все больше и больше используют различные вещества, искусственно созданные ими - ксенобиотики, которые вследствие деятельности человека непрерывно поступают в окружающую среду, загрязняя ее.
Одними из самых опасных веществ искусственного происхождения являются стойкие хлорорганические соединения. В природных условиях они практически не подвергаются распаду из-за своей высокой устойчивости к химическому, биологическому и фотолитическому разложению. Распространяясь по планете благодаря их широкому использованию в промышленности, сельском хозяйстве и вследствие своих физико - химических свойств эти стойкие органические соединения наносят ущерб здоровью людей даже там, где они не применялись. Контроль над распространением этих загрязнителей, их запрет, и уничтожение являются одной из приоритетных задач мирового сообщества.
Полихлорированные бифенилы (ПХБ) относятся к токсичным хлорорганическим соединениям, диоксиноподобным веществам первой группы опасности /7,54/. Они входят, по списку UNEP, в "черную дюжину" наиболее стойких и опасных органических загрязнителей, угрожающих окружающей среде планеты.
ПХБ производились с 30-х годов и нашли свое применение, в основном, в электротехнической промышленности. Естественного образования их в окружающей среде не установлено /36/. ПХБ, вследствие своей токсичности и сспособности к биоаккумуляции, с 1978 года запрещены к широкому применению в промышленности, за исключением эксплуатации уже выпущенных трансформаторов и конденсаторов.
ПХБ - политропные яды, поражающие практически все органы и системы организма, данные ВОЗ свидетельствуют, что наиболее чувствительным к ним является человек. Поэтому с начала 80-х годов производство этих опасных соединений свернуто. Сейчас ведутся работы по их планомерному уничтожению, но проблема ПХБ, попавших в окружающую среду, так и остается нерешенной ввиду их очень высокой химической и биологической инертности /36, 54/.
В настоящее время очистка почв, загрязненных ПХБ, ведется физико-химическими методами, что приводит к неблагоприятному изменению свойств почв и к возникновению их вторичных загрязнений /36,54/. Альтернативным способом является метод микробной деградации ПХБ, который позволяет не только понизить концентрацию ПХБ в почве, но и свести к минимуму ущерб для окружающей среды.
Целью исследования является разработка метода микробной деструкции полихлорбифенилов в загрязненных почвах in situ.
Для достижения этой цели в работе были поставлены следующие задачи:
Выделить из загрязненных почв и идентифицировать штаммы микроорганизмов, разлагающие полихлорбифенилы.
Провести токсикологические испытания выделенных штаммов микроорганизмов на безопасность для теплокровных животных.
Найти оптимальный температурный интервал и определить наиболее эффективную концентрацию вносимой микробной суспензии при проведения микробиологической деструкции ПХБ в почве.
4. Изучить динамику содержания микроорганизмов- деструкторов ПХБ в почве и их взаимоотношение с естественной почвенной микрофлорой.
Провести полевые испытания разработанного метода биоремедиации на участках почвы, подвергшихся длительному и массированному загрязнению ПХБ.
Сравнить токсичность почвы, загрязненной ПХБ, до и после проведения биоремиднации, для теплокровных животных и дафний.
На защиту выносится: Система мероприятий по экологически безопасной санации in situ загрязненной полихлорированными бифенилами почвы с помощью микроорганизмов-деструкторов.
Научная новизна:
Разработан метод санации почвы in situ с помощью микроорганизмов-деструкторов ПХБ Alcaligenes latus TXD-13 и HansenuUa califomica AT.
Впервые показано, что для деструкции ПХБ могут быть использованы дрожжи HansenuUa califomica, способные активно разлагать эти ксенобиотики.
В полевых условиях изучено взаимоотношение микроорганизмов-деструкторов ПХБ и аборигенной почвенной микрофлоры.
Предложена методика определения токсичности почв в процессе микробиологической санации с помощью животных-биотестов.
Практическая ценность: 1. Организован музей микроорганизмов-деструкторов ПХБ. Штаммы Alcaligenes latus TXD-13 и HansenuUa califomica AT Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номерами В 75-05 и Y-
2284. На них получены две международные патентные заявки PCT/RU 98/00036 и PCT/RU 98/00037 соответственно и оформляются два патента Российской Федерации.
2. На основании исследований в лабораторных и полевых условиях разработаны практические рекомендации по применению метода in situ для детоксикации почв, загрязненных ПХБ.
Работа проводилась по контракту с Японской корпорацией Toyta Motors, а также в рамках научных исследований по проекту № 228 Международного Научно-технического Центра, совместно с фирмами Heuro. GR - Германия, Osis Project - США, Biotec Engineering LTD -Великобритания.
Материалы, изложенные в диссертации, доложены на конгрессах, научных и научно-практических конференциях в России, США, Германии, Швейцарии, опубликованы в итоговом сборнике "Труды научно-практической конференции, посвященной 50-летию Федерального Управления Медбиоэкстрема", журнале "Токсикологический вестник", оформлены в виде международных патентных заявок РСТ, патентов Российской Федерации, 2 лабораторных регламентов, отчетов к проекту № 228, методик. Всего по теме диссертации опубликовано 16 работ.
Автор сердечно благодарит академика РАСХН, профессора, доктора биологических наук М.С. Соколова, профессора, доктора ветеринарных наук Р.В. Боровика за помощь в разработке направлений исследований и обсуждении концепции диссертации. Автор благодарит кандидата биологических наук СП. Рыбалкина с сотрудниками, кандидата биологических наук А.И. Марченко, научных сотрудников В.А. Блохина, В.Н. Алдобаева, сотрудников НИЦТБП, оказавших методическую помощь в выполнении отдельных этапов исследований.
Химико-токсикологическая характеристика ПХБ
Общемировой объем произведенных полихлорбифенилов составил 1,5 миллиона тонн и к концу 60-х годов в окружающей среде, оказалось, от 300 до500 тыс. тонн ПХБ /36/. В среднем годовой выброс их составляет 2000 тонн. Попадание ПХБ в окружающую среду связано с авариями оборудования и систем их содержащих, а также со сжиганием отходов на свалках. Аварии, с последующим возгоранием ПХБ в трансформаторах, приводит к их пиролизу с образованием диоксинов. Они многократно происходили в странах Европы и Северной Америки, вызывая значительные загрязнения почв и отравления людей /19/.
В почву ПХБ попадают при сбросе неочищенных производственных стоков с предприятий, использующих его в производственном цикле (как в примере с заводом "Конденсатор"), при использовании иловых отложений с полей орошения, или при выпадении с осадками из атмосферы. В связи с высокой липофильностью, полихлорированные бифенилы в почве мало подвижны. Обладая высокой способностью к адсорбции и малой способностью к разложению, ПХБ накапливаются в почве и донных осадках. Там они локализуются в поверхностном слое от 2 до 10 см./36,54/. Почвенный слой, накопивший в течение многих лет значительное количество ПХБ, является источником загрязнения воздуха /55/.
Россия являлась крупнейшим производителем и потребителем ПХБ, поэтому в ряде районов Российской Федерации сложилась критическая ситуация с загрязнением окружающей среды полихлорбифенилами /54/. Ярким примером этой ситуации является загрязнение ПХБ окружающей среды в городе Серпухове Московской области. В результате систематического нарушения технологии производства Серпуховским заводом "Конденсатор", в почву и в реки Ока и Нара попало громадное количество полихлорбифенилов. При этом пострадало местное население, нанесен значительный ущерб окружающей среде /3,54/. В тех случаях, когда полихлорированные бифенилы попадали во внешнюю среду в результате аварий оборудования, происходило массовое отравление людей и загрязнялась внешняя среда. В марте 1968 года в Японии произошел прорыв ПХБ из системы охлаждения предприятия. Они попали в рисовое масло, в результате чего заболело 1000 человек, из них 24 умерло. При этом симптомы отравления очень напоминали интоксикацию диоксином.
Химические и технические свойства ПХБ, в некотором роде, являются уникальными. Они мало растворимы в воде, плохо растворимы в органических растворителях, не окисляются кислородом воздуха, устойчивы к действию сильных кислот и оснований. Низко хлорированные ПХБ разлагаются под воздействием ультрафиолетового излучения /36/.
Коммерческие ПХБ- это обычно светлые маслянистые жидкости (ди -, три -, и тетра-хлорбифенил) или тяжелые медоподобные жидкости (пента-хлорбифенил). Изготовители продавали ПХБ под различными торговыми марками: "Aroclor" (Monsanto, США); "Phenoclor", и "Pyralene" (Prodelec S.A., Франция); "Clophen" (Farbenfabriken Bayer AG, Германия); и "Kanechlor" (Kanegafuchi Ltd). Изготовители также обозначили числами свои изделия, которые обычно отражали степень хлорирования chlorines/biphenyl или процент хлора в смеси. Например, Aroclor 1242 (12 атомов углерода и 42 % хлора), Clophen 30 (3 chlorines/ biphenyl), и Kanechlor 300 (3 chlorines/biphenyl) 42 % хлорирования. Аналогично, Aroclor 1260 и Clophen 60 (6 chlorines/ biphenyl) 60% хлорирования /54/.
От количества замещенных атомов водорода атомами хлора зависят свойства конгенеров (растворимость в воде, агрегатное состояние, летучесть, вязкость). В состав полихлорированных бифенилов входят 209 конгенеров, то есть изомеров с определенным количеством атомов хлора, Степень токсичности ПХБ определяется количеством атомов хлора в молекулах и изомерным составом. Чем больше атомов водорода замещено атомами хлора, тем выше токсичность данного полихлорбифенила. Устойчивость в объектах внешней среды, с увеличением хлорированности их, повышается /33/.
Циркулируя во внешней среде, полихлорбифенилы из загрязненной почвы попадают в растения. Наибольшей аккумулирующей способностью, в отношении ПХБ, среди сельскохозяйственных растений обладают клубнеплоды и корнеплоды. Надземная часть растений загрязняется пылью, содержащей ПХБ, в результате ветровой эрозии почвы. Употребление загрязненных ПХБ растительных кормов ведет к накоплению полихлорированных бифенилов в организме сельскохозяйственных животных и человека. Высокая липофильность этих соединений способствует их накоплению в жировой ткани и печени животных, где концентрация яда может достигать того же уровня, что и в почве. Количество полихлорбифенилов в тканях рыб и ракообразных коррелирует с содержанием ПХБ в донных осадках и планктоне /3/. Однако, наибольшую опасность представляет накопление ПХБ в молоке теплокровных животных и человека, яйцах птицы. Попадая по пищевым цепям в организм человека, ПХБ кумулируются в жировой ткани и в печени. При хронической интоксикации у животных поражаются система репродукции, нервная система, печень, кожные покровы. Кроме общетоксического действия на организм теплокровных животных и человека, ПХБ вызывает развитие иммунодефицита, однако, менее выраженного, чем при ВИЧ-инфицировании. Для них характерны эмбрио-и гонадотоксичность, а также тератогенные эффекты /52/.
Микробная деградация ПХБ в почве
В естественных условиях микроорганизмы играют важнейшую роль в процессах деструкции различных ксенобиотиков в почве, в том числе и ПХБ. Микробиологическая деструкция их не вызывает в почве необратимых физико-химических и биологических изменений.
Известно, что чем больше ксенобиотик отличается от природных соединений, тем меньше вероятность широкого распространения микроорганизмов, способных его утилизировать. Сказанное относится и к ПХБ /12/. Процессы деструкции полихлорированных бифенилов в почве могут продолжаться десятки лет, так как количество микроорганизмов-деструкторов в почвах очень мало и активность их недостаточно велика. Наиболее эффективная концентрация микроорганизмов, разлагающих различные ксенобиотики, для бактерий обычно составляет 10б-104 кл/см3 /11/.
Проведение микробиологической деструкции ПХБ в загрязненных почвах основывается на двух подходах: - активизации естественной микрофлоры почвы; - интродукция штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ в почву.
Активизации естественной микрофлоры почвы Наиболее простой и экономичный метод деструкции полихлорбифенилов в почве - это активизация естественной микрофлоры почвы. В ФРГ, Нидерландах, Великобритании в настоящее время уже разработаны соответствующие способы очистки почв от ПХБ. Ее проводят на месте путем использования простейших приемов, активизирующих деятельность почвенных микроорганизмов. Почву увлажняют, рыхлят, вносят органические вещества, минеральные удобрения и. т.д. Грунты с плохой структурой смешивают с древесными остатками, что улучшает водопроницаемость и аэрацию, сокращая таким образом сроки очистки почвы. Метод носит название land farming /18/. Путем активизации аборигенной аэробной микрофлоры проводились работы по детоксикации иловых отложений реки Гудзон / 48 /.
Данный метод страдает существенным недостатком - он применим только к почвам с невысоким содержанием ПХБ.
Из данных литературы известно, что в лабораторных исследованиях используются штаммы микроорганизмов -деструкторов ПХБ для санации почв. В США была показана возможность использования микроорганизмов в полевых условиях при очистке от ПХБ речных отложений. /39,48/. Интродукция штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ в почву наиболее перспективна, так как при этом в почву вносятся наиболее эффективные микроорганизмы разрушители ПХБ. Это значительно повышается скорость и уровень разложения ксенобиотика.
При этом используют как природные микроорганизмы выделенные из объектов внешней среды, так и полученные способами генной инженерии.
Микроорганизмы, способные активно разлагать ПХБ, выделяют из почв, длительное время подвергавшихся загрязнению полихлорбифенилами. В результате многолетней селекции в таких почвах накапливаются микроорганизмы разлагающие ПХБ в высоких концентрациях. Путем глубинного культивирования наращивают культуру микроорганизмов-деструкторов ПХБ, готовят препаративную форму и вносят в загрязненную почву, вследствии чего концентрация ПХБ снижается /39,54/. Трудозатраты при данном способе обработки и затраты на производство микробной суспензии относительно невелики, поэтому данный способ можно применять на больших площадях.
Для получения микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков из объектов внешней среды в основном используется метод накопительных культур, который позволяет выделять микроорганизмы-деструкторы из почв, подвергшихся длительному воздействию ПХБ и метод непосредственного, прямого высева почвенных микроорганизмов на минимально-солевые питательные среды содержащие в качестве единственного источника углерода полихлорированные бифенилы. /12,39/.
Методы основаны на способности микроорганизмов-деструкторов использовать некотрые ПХБ в качестве единственного источника углерода в минимальной-солевой среде. Если на данную питательную среду высеять суспензию смеси микроорганизмов из соответствующих объектов внешней среды, то на среде вырастут только микроорганизмы, способные усваивать ПХБ. Повышая концентрацию ксенобиотика в питательной среде, молено добиться выделения высокоустойчивых к ПХБ микроорганизмов-деструкторов, так как деструкция ксенобиотика в почве связана не столько с концентрацией микроорганизма-деструктора, сколько с его деструктивной активностью /11/.
Определение ПХБ в пробах методом газожидкостной хроматографии
Образцы почв с загрязненных ПХБ территорий отбирали в соответствии с методическими указаниями/10/. Отбор образцов осуществляли с глубины 5-10 см, так как основное количество ПХБ локализовано именно в этом слое почвы /36,54/.
Сначала удаляли верхний дерновый слой, затем отбирали монолит толщиной 3 см. Вес образца составлял около 0,5 кг. Пробы отбирали методом "конверта" из пяти точек, тщательно смешивали в стерильном мешке и брали усредненный образец весом 1 кг, который затем помещали в бумажный пакет. Пакет этикетировали (с указанием места, даты и время отбора пробы).
Пробу обрабатывали в течение 2-3 часов со времени ее взятия, что позволяло наиболее полно выделить микроорганизмы, составляющие естественный педомикробиоценоз. Хорошо перемешанную почвенную пробу раскладывали ровным слоем и из нее удаляли посторонние включения. Из разных мест отбирали небольшие порции и на технических весах взвешивали 1 г. усредненного образца.
Для разрушения почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с почвенных частиц почву увлажняли 0,5 мл воды и полученную смесь растирали 5 мин стерильным резиновым пестиком в фарфоровой чашке. Растертую почвенную массу разбавляли 100 мл физиологического раствора и переносили в колбу. Колбу с почвенной суспензией озвучивали на ультразвуковой установке "Fritsch" (22 кГц, 0,4 А, в течение 2 мин.), с целью увеличения полноты десорбции микроорганизмов из пробы /10/.
Таким образом, исходная суспензия исследуемого материала была разведена в 100 раз. Образец титровали методом стандартных десятикратных разведений в физиологическом растворе до1:104, с последующим высевом на плотные питательные среды.
Определение полихлорбифенилов в исследуемых образцах было проведено методом газо-жидкостной хроматографии /34/ на хроматографе "Кристалл - 2000 М" (Россия) с детектором электронного захвата и капиллярной колонкой ВИТОКАП А-1-0,3.
Для проведения газохроматографического анализа почв на полихлорбифенилы была разработана методика подготовки проб, которая включает в себя: - высушивание образцов почвы до воздушно-сухого состояния, освобождение от чужеродных включений (стекло, камни, куски древесины, трава и т.д.) и отбор навески методом квартования; - экстрагирование ПХБ из почвы ацетоном. Для этого навеску почвы помещали в фильтр-патрон из фильтровальной бумаги, кипятили 30 минут в ацетоне в колбе с обратным холодильником, затем оставшиеся в почве ПХБ экстрагировали гексаном в аппарате Сокслета в течение 4 часов. Условия хроматографирования: Т колонки — 180 С, Т испарителя — 300 С; Т детектора — 300 С.
Для выделения наиболее полного спектра микроорганизмов из почвенных проб и их идентификации использовали следующие стандартные питательные среды /8,9,10/:
1. Мясопептонный агар (МЛА) в десятикратно разведенный водопроводной водой. Универсальная среда для роста групп коринеподобных, грамотрицательных неспороносных и спорообразующих бактерий.
2. Ферментативный гидролизат рыбной муки, ФГРМ, изготовленный на НПО "Питательные Среды" г. Махачкала, соответствует ФС42-224ВС-86 (среда используется как базовая);
3. ФГРМ с добавлением метилового красного в количестве 150 мкг/мл среды для ингибирования роста бацилл.
4. ФГРМ с добавлением 3% глицерина. Эта среда выявляет флуоресцирующий пигмент псевдомонад, который виден в проходящем ультрафиолетовом свете (длина волны 254 нм).
5. Картофельный агар для бактерий рода Alcaligenes: Очищенный кортофель -200 г Глюкоза - 20 г Агар - 20 г Вода водопроводная - 1 л 6. Почвенный агар Локхида : К2НР04 - 0,2 мг Агар -15 г Почвенный экстракт - 1л 7. Мальт - агар 5% - фирма "Fluca" каталог 8. Ацетатная среда для спорулирования дрожжей: ацетат натрия - 0,14 %
Оценка безопасности выделенных штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ для теплокровных животных
Для проведения дальнейших работ с выделенными из почвы наиболее активными штаммами микроорганизмов-деструкторов ПХБ необходимо было установить их безопасность. Работы по определению LD50, токсичности, токсигенности и определению диссеминации штаммов во внутренних органах экспериментальных животных проводили в соответствии с методическими рекомендациями на белых мышах и крысах/16/.
Определение LDsn исследуемых штаммов. В результате наблюдения за животными была отмечена гибель одной мыши, внутрибрюшинно зараженной штаммом Bacillus AT- 8 в дозе 108 кл., на второй день после введения. Далее, на протяжении 30-дневного срока наблюдения гибели животных не было.
Таким образом, LD50 исследуемых штаммов превысила 107 кл. при внутрибрюшинном введении и 108 кл. при внутрижелудочном, что по данному показателю позволило считать их непатогенными и явилось основанием для продолжения исследований по определению безопасности.
Определение токсичности исследуемых штаммов. В течение первых суток эксперимента была отмечена гибель мышей, которым была введена прогретая культура штамма Bacillus AT- 8. При этом от дозы 108 кл. погибло 3 животных, 109 кл — 5 и 1010 кл — все 6 мышей. Гибели животных в других группах не было.
Таким образом, поскольку показатель токсичности штамма Bacillus AT- 8 превысил 109 кл. на животное, он является потенциально опасным для человека и не мог быть рекомендован для применения в биотехнологии. Исследование трех других штаммов было продолжено.
Определение токсигенности исследуемых штаммов. В результате эксперимента не было отмечено гибели животных, в какой-либо из групп, что свидетельствовало об отсутствии у штаммов Hansenula AT, Pseudomonas ТХД 12 и Alcaligenes ТХД- 13 токсигенных свойств.
Определение диссеминации штаммов во внутренних органах экспериментальных животных.
Рост специфических культур был отмечен в следующих случаях: штамм Pseudomonas ТХД- 12 — при внутрибрюшинном заражении у мышей из селезенки, у крыс - из селезенки и почек; штамм Alcaligenes ТХД- 13 — специфический рост отсутствовал; штамм Hansenula AT — специфический рост отсутствовал.
Ввиду наличия диссеминации во внутренних органах, штамм Pseudomonas ТХД- 12 не мог быть использован для биотехнологических целей.
Таким образом, проведенными токсикологическими исследованиями по определению безвредности экспериментальных штаммов было установлено отсутствие патогенных свойств штаммов Hansenula AT и Alcaligenes ТХД-13 по показателям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации во внутренних органах, что позволило использовать названные штаммы для дальнейших работ, при условии соответствия их необходимым микробиологическим характеристикам.
Для дальнейших работ по культивированию штаммов-деструкторов ПХБ необходимо было идентифицировать микроорганизмы деструкторы ПХБ до вида.
Видовая идентификация дрожжей рода Hansenula. Дрожжи рода Hansenula имели следующие культурально-морфологическими признаки: - рост на 5%-ном мальт-агаре; - после 3-х дней инкубации при 25С клетки имели слегка сферическую форму с размерами 2,4 - 6,2x3,0 - 8,1 мкм. - колонии белые, матовые, округлой формы; - на жидких средах на 3-5 сутки культура образовывала тонкую пленку, на ацетатной среде на 5-7 сутки культура образовывали аскоспоры сатурновидной формы, от 1 до 4-х спор в аске. Аски часто зиготического происхождения.
