Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 2
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
Глава 1. КРИОБИОСФЕРА КАК СРЕДА ОБИТАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. 5
Вечная мерзлота: определение, строение, физико-химические условия. 5
Криопэги как часть криосферы Земли и модель для астробиологии. _ Глава 2. МИКРОБНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВЕЧНОМЕРЗЛЫХ ПОРОД. 10
Численность бактерий в вечномерзлых грунтах. 11
Разнообразие культивируемых микроорганизмов. 12
Прокариоты. 12 2.2.1.1 Характеристика рода Psychrobacter 14
Эукариоты. 17
2.3 Изучение микробного разнообразия вечномерзлых грунтов методами
молекулярной экологии. 17
2.4 Метаболическая активность in situ. 20
Глава 3. АДАПТАЦИЯ ПРОКАРИОТ К ЖИЗНИ ПРИ НИЗКОЙ
ТЕМПЕРАТУРЕ. 23
Физиологические группы бактерий по отношению к температуре. 23
Кинетика роста при низких температурах. 24
Ответ на холодовой шок как начальный этап адаптации клетки к низкой температуре. 26
3.3.1 Сенсорные системы клетки. 27
Мембрана. 27
Трансляционный аппарат. 28
ДНК и структурирующие ее белки. 29
Трехстадийная модель ответа на холодовой шок. 29
Белки холодового шока: структура и функция. 30
Холодовой шок психрофильных и психротрофных бактерий. 31
3.4 Роль компонентов клетки при адаптации к низкой температуре. 33
3.4.1 Механизмы адаптации мембраны прокариотической клетки к низкой
температуре. 33
Стратегии изменения жирнокислотного состава. 33
Состав полярных групп липидов. 36
Состав белков мембраны. 36
Состав каротиноидов. 36
3.4.2 Холодоактивные ферменты. 37
3.4.3 Криопротекторы: белки и органические осмолиты. 38
3.5 Геномы пспхрофильных и психротрофных бактерий. 39
Заключение по обзору литературы. 41
Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 43
Объекты исследования. 43
Районы исследования. 43
Гидрохимические характеристики криопэгов. 45
Микроорганизмы. 45
Методы учета численности бактерий. 45
Состав сред для культивирования. 46
Методы контроля чистоты культур. 48
Микроскопические методы исследования. 48
Определение параметров роста микроорганизмов. 49
Изучение культуральиых и физиолого-биохимических свойств. 50
4.5 Аналитические методы. 50
Определение летучих жирных кислот, спиртов и метана. 50
Определение лактата. 51
Определение глюкозы. 51
Определение сероводорода. 52
Определение белка биомассы. 52
Определение десульфовиридина. 52
Определение ионов двухвалентного железа. 53 4.4.10 Анализ жирных кислот липидов мембран. 53
4.6 Анализ внутриклеточного полисахарида Clostridium algoriphilum. 53
Количественное определение полисахарида. 53
Получение чистого препарата полисахарида. 54
Определение способности полисахарида окрашиваться раствором Люголя. 54
Определение элементного состава полисахарида. 54
Гидролиз н определение состава мономеров. 55
4.7 Молекулярно-генетические методы исследования. 55
Выделение и очистка хромосомной ДНК. 55
Определение нуклеотндной последовательности гена 16S рРНК. 55
Филогенетический анализ. 55
Определение ГЦ состава ДНК. 56
ДНК-ДНК гибридизация. 56 4.8 Протеомные методы. 56
Выделение тотального клеточного белка "P. muriicola'IpS и его подготовка к двухмерному электрофорезу. 56
Регидратация стрипов с иммобилизованным градиентом рН. 56
Первое разделение: изоэлектрофокусирование. 57
Уравновешивание стрипов в тяжелом буфере. 57
Второе разделение: SDS-полиакриламидный гель-электрофорез. 57
Окрашивание белков в гелях после электрофореза кумассп бриллиантовым синим R-250. 58
Документирование гелей. 58
4.8.8 Идентификация белков с помощью LC MS/MS масс-спектрометрии. 59
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 60
Глава 5. Численность бактерий в криопэгах различной
географической локализации. 60
Численность в криопэгах Колымской низменности. 60
Численность в криопэгах Вараидейского полуострова. 62 Глава 6. Новые пснхрофнльные и пснхротолерантные бактерии из арктических криопэгов: выделение и характеристика. 65
6.1 Анаэробные пснхрофнльные спорообразующие палочки штаммы 14D1
и 14F. 65
Аэробные штаммы IpS и 2pS. 77
Сульфатредуцирующая бактерия штамм В15. 85 Глава 7. Адаптация изолятов к отрицательной температуре. 92
7.1 Особенности роста выделенных бактерий при отрицательных
температурах. 92
7.1.1 Основные параметры роста выделенных бактерий рода Clostridium
при различных температурах в периодической культуре. 92
Образование продуктов метаболизма анаэробной бактерией С. algoriphilum при различных температурах культивирования. 93
Исследование влияния температуры и солености на скорость роста С. algoriphilum и "P. muriicola'IpS. 94
Влияние температуры культивирования на спектр утилизируемых 95
субстратов С. и "P. muriicola" 2pS.
7.2 Состав жирных кислот липидов клеточных мембран изолятов при
различных условиях культивирования. 96
Состав жирных кислот липидов мембран С. algoriphilum при оптимальной и отрицательной температурах культивирования. 96
Состав жирных кислот липидов мембран "P. muriicola'IpS при различных температурах культивирования и соленостях среды: повышенной, оптимальной и отрицательной. 98
7.3 Внутриклеточный полисахарид С. algoriphilum. 100
Состав и свойства внутриклеточного полисахарида С. algoriphilum. 101
Динамика накопления полисахарида в клетках С. algoriphilum. 102
7.4 Протеомный анализ холодовой адаптации "P. muriicola" 2pS. 106
Исследование дифференциальной экспрессии белков "P.muriicola"2iiS методом 2Д-ПААГ. 107
Белки "P. muriicola"2pS, индуцируемые при отрицательной температуре. 109
Заключение. 112
ВЫВОДЫ. 114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 116
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПСА - персульфат аммония
TEMED - тетраметилэтилендиамин
SDS - додецилсульфат натрия
DTT - дитиотриэтол
2Д-ПААГ - двумерный полиакриламидный гель-электрофорез
PMSF - фенилметансульфонилфлуорид
CHAPS - 3-(3-хлорамидопропилдиметиламино)-1-пропансульфонат
OD - оптическая плотность
ЖК - жирные кислоты
Введение к работе
Актуальность проблемы. Микробиологические исследования последних лет убедительно показали, что в вечной мерзлоте содержатся жизнеспособные микроорганизмы, и об этой части литосферы правомерно говорить как о части биосферы, для которой был предложен термин «криобиосфера» (Vorobyova et al., 1997). Численность микроорганизмов в вечномерзлых породах Арктики и Антарктики составила 103-108 кл/г (Rivkina et al., 1998; Cowan et al., 2002; Gilichinsky et al., 2002; Steven et al, 2004; Gilichinsky et al., 2007). Из проб вечномерзлых грунтов были выделены чистые культуры актиномицетов (Карасев и др., 1998; Gavrish et al., 2003), нитрифицирующих бактерий (Соина и др., 1991), метанотрофов (Хмеленина и др., 2002), сульфатредукторов (Вайнштейн и др., 1995), зеленых одноклеточных водорослей и цианобактерий (Vishnivetskaya et al., 2001), метаногенных архей (Rivkina et al., 2007). Многие изоляты и смешанные популяции проявляли метаболическую активность при отрицательных температурах (Ривкина и др., 2002; Хмеленина и др., 2002; Bakermans et al., 2003; Gilichisky et al., 2003). Исходя из того, что в вечной мерзлоте находится огромное количество микробной биомассы, вклад микроорганизмов криобиосферы может быть очень значительным для глобального круговорота веществ и биогеохимических процессов, и все еще остается неучтенным (Rivkina et al., 2004).
Кроме того, выживание микроорганизмов в условиях вечной мерзлоты поднимает вопрос о механизмах адаптации клетки к условиям местообитания, а также о существовании временного предела сохранения жизни. Решить последнюю проблему экспериментально или при помощи моделирования невозможно. С этой точки зрения многолетнемерзлые отложения являются уникальным объектом, позволяющим наблюдать результат криоконсервации в течение геологического времени.
Большинство планет Солнечной системы имеет криогенный характер, то есть физико-химические условия на них наиболее близки к условиям криосферы Земли. Поэтому вечномерзлые грунты являются уникальной моделью такого внеземного местообитания для живых организмов (Гиличинский, 2002). Кроме того, исследования биоразнообразия вечной мерзлоты дают возможность приобрести ценный опыт отработки методик стерильного отбора и хранения проб для исключения контаминации образцов с одной стороны, и методик обеспечения биологической безопасности с другой.
Криопэги (отрицательнотемпературные рассолы внутри вечной мерзлоты) являются водными системами морского происхождения. Было показано, что микробное
сообщество криопэгов Колымской низменности способно окислять С-глюкозу при отрицательных температурах вплоть до -15С (Gilichisky et al., 2003).
К началу нашей работы состав микробных сообществ, населяющих криопэги и способных проявлять метаболическую активность при столь низких температурах, оставались неизвестными.
Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным, целью нашей работы бьшо исследование состава микробных сообществ и особенностей биологии изолятов, связанных с адаптацией к условиям криопэгов.
Для достижения цели решались следующие задачи:
Определение численности микроорганизмов в образцах криопэгов Колымской низменности и Варандейского полуострова.
Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий, изучение их физиолого-биохимических свойств, определение таксономического положения изолятов.
Изучение особенностей роста изолятов при отрицательных температурах и высокой солености.
Изучение изменения биохимического состава клеток в ответ на действие отрицательных температур.
Научная новизна работы. Впервые дана микробиологическая характеристика отрицательнотемпературных рассолов в вечной мерзлоте. Выделены и описаны чистые культуры адаптированных к холоду аэробных и анаэробных бактерий, представляющих новые виды родов Clostridium, Desulfovibrio, Psychrobacter. Показано, что выделенные бактерии способны к росту при отрицательных температурах. Рост при температурах ниже нуля сопровождался значительными изменениями физиологии и биохимического состава клеток.
Полученные результаты расширяют представления о микробном разнообразии вечной мерзлоты и биологии психрофильных и психротрофных бактерий.
Практическое значение. Изоляты адаптированных к холоду бактерий представляют интерес как компоненты искусственно создаваемых сообществ, способных к биодеградации загрязняющих природу веществ в холодном климате, а также как источники холодоактивных ферментов, используемых в пищевой промышленности, при очистке сточных вод, в молекулярной биологии.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на 7-ой, 8-ой, 9-ой Пущинских конференциях молодых ученых «Биология-наука 21-го века» (2003 - 2005),
Международной конференция по арктической микробиологии (Рованьеми, Финляндия, 2005), второй европейской конференции по вечной мерзлоте «EUCOP 2005» (Потсдам, Германия, 2005), 9-м симпозиуме по водной микробной экологии (Хельсинки, Финляндия, 2005), Всероссийских Молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005, 2006), а также на ежегодных сессиях научных работ ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина (2003 - 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 211 ссылок, содержит 30 таблиц и 30 рисунков.
Благодарности. Автор искренне благодарен сотрудникам, способствовавшим вьшолнению данной диссертационной работы: д.б.н. Гиличинскому Д.А., к.б.н. Ривкиной Е.М за предоставленные пробы криопэгов (ИФХиБПП РАН); к.б.н. Лысенко A.M. за определение уровня ДНК-ДНК гибридизации и состава ГЦ-пар в ДНК (ИНМИ им С.Н. Виноградского РАН); д.б.н. Осипову Г.А. за анализ жирнокислотного состава клеток (Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева); к.б.н. Сузиной Н.Е. за помощь при выполнении электронномикроскопических исследований, к.б.н. Гавриш Е.Ю., к.б.н. Акимову В.Н. за филогенетический анализ, Лысанской В.И. за анализ мономерного состава полисахарида, а также к.б.н. Архиповой О.В., к.б.н. Лауринавичюсу К.С., к.б.н. Трутко СМ., к.б.н. Чувильской Н.А. и всем сотрудникам лаборатории анаэробного метаболизма микроорганизмов (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН).
Автор благодарит профессора Марбургского университета М.А. Марахила (Германия) за руководство при выполнении протеомного анализа.
Особую признательность автор выражает к.б.н. Щербаковой В.А. за всестороннюю помощь на всех этапах исследований.