Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Криобиосфера как среда обитания микроорганизмов 12
1.1 Вечная мерзлота и криопэги: определение, строение, физико-химические условия 12
1.2 Биоразнообразие бактерий многолетнемерзлых пород 13
1.3 Биоразнообразие прокариот в криопэгах 16
1.4 Характеристика рода psychrobacter 21
ГЛАВА 2 Адаптация прокариот к низким температурам
2.1 Физиологические группы бактерий по отношению к температуре.. 26
2.2 Механизмы адаптации к низкой температуре 27
2.2.1 Изменение структуры и функций компонентов мембраны 28
2.2.2 Синтез белков теплового шока 30
2.2.3 Белки холодового шока 31
2.2.4 Криопротекторы: белки и органические осмолиты 32
2.2.5 Холодоактивные белки 34
2.2.6 Анализ геномов и протеомов психрофилов 35
ГЛАВА 3 Холодоактивные липолитические ферменты 37
3.1 Основные свойства и биологические функции липолитических ферментов 37
3.2 Классификация бактериальных липаз 42
3.3 Особенности структуры холо до активных липолитических ферментов 46
3.4 Продуценты холо до активных липаз 48
3.5 Методы определения активности липаз 51
3.6 Применение холодоактивных липолитических ферментов в биотехнологии экспериментальная часть 55
Глава 4 Материалы и методы исследования 55
4.1 Объекты исследования 55
4.2 Районы исследования 56
4.3 Материалы 58
4.3.1 Штаммы Escherichia coli, вектор и среды для культивирования E.coli 58
4.3.2 Олигонуклеотиды 58
4.4 Микробиологические методы анализа 59
4.4.1 Оценка общей численности микроорганизмов 59
4.4.2 Накопительное культивирование и выделение чистых культур бактерий 60
4.4.3 Микроскопические методы исследования 61
4.4.4 Культивирование P. cryohalolentis 61
4.4.5 Определение липолитической активности 61
4.5 Молекулярно-генетические методы, использованные для изучения микроорганизмов 63
4.5.1 Выделение геномной ДНК 63
4.5.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 63
4.5.3 Определение нуклеотидных последовательностей генов 16SpPHK и филогенетический анализ 64
4.6 Молекулярно-генетические методы, использованные для получения рекомбинантных белков 64
4.6.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 64
4.6.2 Рестрикция 65
4.6.3 Электрофорез ДНК 65
4.6.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 65
4.6.5 Лигирование 65
4.6.6 Трансформация клеток Е. coli 65
4.6.7 ПЦР-анализ клонов 66
4.6.8 Выделение плазмидной ДНК из Е. coli 66
4.6.9 Секвенирование ДНК. 66
4.6.10 Конструирование экспрессионных векторов 66
4.7 Биохимические методы исследования 68
4.7.1 Денатурирующий электрофорез белков в ДСН-ПААГ. 68
4.7.2 Оптимизация экспрессии в Е. coli рекомбинантных белков 69
4.7.3 Выращивание рекомбинантных штаммов Е. coli 69
4.7.4 Выделение рекомбинантных белков EstPc, Lip IP с, ND1-ND5, LifPcd23 и LifPcd62 из клеток Е. coli 70
4.7.5 Получение рекомбинантного белка Lip2Pc 71
4.7.6 Рефолдинг рекомбинантного белка Lip2Pc 71
4.7.7 Очистка рекомбинантного белка Lip2Pc 72
4.7.8 Определение концентрации белка 72
4.7.9 Определение липолитической активности рекомбинантных белков 73
4.7.10 Характеристика свойств рекомбинантных белков 73
ГЛАВА 5 Результаты и обсуждение 74
5.1 Криопэги как источник продуцентов холо до активных липолитических ферментов 74
5.1.1 Микробиологическая характеристика исследуемых криопэгов 74
5.1.2 Скрининг на наличие липолитической активности у выделенных микроорганизмов 77
5.1.3 Морфологический и филогенетический анализ культур, давших положительный результат на липолитический скрининг 80
5.2 Липолитическая система p.cryohalolentis 86
5.2.1 Изучение липолитической активности P. cryohalolentis в зависимости от стадии роста культуры и температуры культивирования 87
5.2.2 Моделирование липолитической системы P.cryohalolentis 90
5.3 Холо до активные липолитические ферменты P. Cryohalolentis 95
5.3.1 Получение и характеристика EstPc 95
5.3.2 Получение и характеристика Lip 1Рс 108
5.3.3 Получение и характеристика Ыр2Рс 123
5.3.4. Сравнение свойств липолитических ферментов P. cryohalolentis и гомологичных белков 138
Заключение 146
Выводы 149
Список литературы
- Биоразнообразие бактерий многолетнемерзлых пород
- Изменение структуры и функций компонентов мембраны
- Классификация бактериальных липаз
- Накопительное культивирование и выделение чистых культур бактерий
Биоразнообразие бактерий многолетнемерзлых пород
Общее количество бактерий, определенное путем прямого счета под микроскопом составило 105-106 для проб антарктических грунтов (Cowan et al, 2002; Gilichinsky et al, 2007), 107 для проб арктических грунтов Канады (Steven et al., 2008) и 103-108 кл/г для проб арктических грунтов Сибири (Gilichinsky et al., 2008). Количество жизнеспособных бактерий, определенное главным образом чашечным методом при посеве на богатые среды, варьировало от 0 до 106 кл/г.
Среди бактерий, выделенных из образцов вечномерзлых грунтов Колымской низменности, наиболее часто встречались коринеформные (85%) и коккоидные (5%) формы, среди которых доминировали бактерии родов Arthrobacter, Rhodococcus, Micrococcus, Deinococcus, Brevibacterium и Streptomyces. Неспорообразующие грамотрицательные палочки (12%) в большинстве своем были представлены родами Pseudomonas и Flavobacterium (Gilichinsky et al., 2008; Steven et al., 2006).
В образцах позднеплейстоценового (1.8-3 млн. лет) возраста доминировали актиномицеты, принадлежащие к родам Arthrobacter,Kocuria, Aureobacterium, Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardioides, Streptomyces и Propionibacterium (Карасев и др., 1998). Использование селективных питательных сред также позволило выделить сульфатвосстанавливающую бактерию Desulfotomaculum 8р.(Вайнштейн и др., 1995), в последствие описанную как Desulfosporosinus hippei (Vatsurina et al., 2008), нитрифицирующие бактерии родов Nitrosospira, Nitrosovibrio и Nitrobacter (Соина и др., 1991), пурпурную несерную фотосинтезирующую бактерию рода Rhodopseudomonas (Бурашникова и Гоготов, 1994) и спорообразующие бактерии рода Bacillus (Кузьмин и др., 1996). Мезофильные актиномицеты и родственные им грамположительные бактерии преобладали в замороженных позднеплиоценовых образцах Колымской низменности. Исследование физиологических, морфологических и хемотаксономических свойств показало, что бактерии относятся к родам Arthrobacter, Kocuria, Aureobacterium, Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardioides, Streptomyces. Анаэробные бактерии были идентифицированы как Propionibacterium sp. Изучение фенотипических характеристик пигментированных бактерий, выделенных из образцов вечной мерзлоты и определенных как представители рода Brevibacterium, показало, что три выделенных штамма представляли три новых вида рода Brevibacterium (Гавриш и др., 2004). Клеточная стенка штаммов содержала маннитолтейхоевую кислоту с ранее неизвестной структурой (Potehina et al., 2003).
Исследования филогенетического разнообразия, как современных мерзлотных почв, так и многолетнемерзлых отложений, выявили значительное микробное разнообразие. Филогенетический анализ клонированных 16S рРНК последовательностей, выделенных из мерзлотных почв и многолетнемерзлых пород, позволил исследователям выявить микроорганизмы, которые были отнесены к родам Arthrobacter, Micrococcus, Brevibacterium, Streptomyces, Cellulomonas, Flavobacterium, Pseudomonas, Aeromonas, Myxococcus, Bacillus, Rhodococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Flavobacterium, Mycobacterium, Chloroflexus, Nitrospina, Prosthecobacter, Flexibacter, Hyphomicrobium, Azospirillum, Blastochloris, Methylosinus, Bradyrhizobium, Sphingomonas, Caulobacter, Rhodocyclus, Comamonas, Rhodoferax, Lepthotrix, Oxalobacter, Xantomonas, Methylomonas, Desulfuromonas, Rhubrobacter, Brevibacillus (Spirina et. al., 2003; Trotsenko and Khmelenina, 2005). 1.3 Биоразнообразие прокариот в криопэгах Колымская низменность
Впервые микробным разнообразием криопэгов заинтересовались в конце XX века. Общая численность микроорганизмов в криопэгах, определенная методом прямого счета, составляла в образцах Колымской низменности 10 кл/мл, что соответствует обычным природным водным местообитаниям и общей численности микроорганизмов в мерзлых породах (Vorobyova et al., 1997).
Позднее, методом предельных разведений было показано, что численность микроорганизмов в криопэгах Колымской низменности 9 4 \ Ясоставляет 10 - 10 кл/мл, в то время как в окружающих породах 10 - 10 кл/г (Gilichinsky et al., 2005). Численность анаэробных групп микроорганизмов (гетеротрофов, метаногенов, ацетогенов и сульфатредукторов) в криопэгах находилась в пределах от десятков кл/мл (ацетогены) до 2x106 кл/мл (сульфатредукторы). Максимальная численность отмечалась при температуре культивирования 5С, а при 18С она падала на 1-3 порядка (Табл. 1), что, в целом, указывает на психрофильный характер анаэробного сообщества (Гиличинский и др., 2003).
Численность культивируемых аэробных бактерий, 80-95% которых были представлены грамположительными непигментированными палочками и кокками, колебалась в криопэгах от сотен до сотен тысяч клеток в 1 мл воды (Табл. 2), а во вмещающих морских отложениях составляла 10-10 кл/г породы.
Изменение структуры и функций компонентов мембраны
Многие прокариоты приспособились изменять состав жирных кислот липидов таким образом, чтобы вязкость мембраны не увеличивалась при понижении температуры окружающей среды. Эта способность называется гомовискозной адаптацией (Becker et al, 1996).
Состав жирных кислот липидов влияет на плотность их упаковки, от которого, в свою очередь, зависит температура фазового перехода. Чем выше плотность упаковки, тем выше температура фазового перехода, и наоборот. Поэтому при адаптации к холоду имеют значение изменения жирнокислотного состава, которые направлены на снижение плотности упаковки «хвостов» фосфолипидов в бислое мембран. Известно несколько таких механизмов. Это введение двойной связи специфической десатуразой, укорочение, разветвление цепи жирной кислоты, а также изменение соотношений жирных кислот с цис- и транс-конформацией двойной связи, с помощью цис-транс изомеразы, изо- и антеизо-разветвлением (Suutari and Laasko, 1994). Так, повышение синтеза ненасыщенных жирных кислот при пониженных температурах наблюдали у грамположительных бактерий {Micrococcus roseus) и у грамотрицательных (Sphingobacterium antarcticus) (Chattopadhyay and Jagannadham, 2001). Роль десатуразы для роста антарктических цианобактерий при низких температурах была показана в работе Чинталапати и других (Chintalapati et al, 2004). Уменьшение способности к текучести клеточной мембраны при увеличении насыщенных транс-изомеров жирных кислот было показано на антарктическом штамме Pseudomonas syringae (Kiran et al., 2005). Ген, кодирующий цис-транс изомеразу, экспрессируется конститутивно независимо от температуры культивирования, что предполагает посттранскриптомную регуляцию уровня синтеза цис-транс изомеразы (Kiran et al., 2005). При культивировании Р. syringae при пониженных температурах было также показано, что повышение количества жирных гидроксикислот в липополисахаридах приводило к увеличению текучести мембраны (Kumar et al., 2002). Размер и заряд полярных групп липидов также влияет на плотность упаковки глицерофосфолипидов и, таким образом, на текучесть мембраны. Эти изменения приводят к снижению плотности упаковки компонентов мембраны, что было показано для В. caldotenax (Hasegawa et al., 1980).
Исследования in vitro показали, что каротиноидные пигменты взаимодействуют с мембраной клетки и увеличивают ее жесткость (Jagannadham et al., 1991, 1996, 2000; Chattopadhyay et al, 1997). Многие антарктические бактерии содержат в мембране пигменты каротиноидной природы. Известно, что полярные каротиноиды уменьшают текучесть мембраны, за счет связывания липидов и увеличения их ригидности (Subczynski et al., 1992). Это натолкнуло исследователей на мысль об их возможной роли в поддержании текучести мембраны. И действительно, для антарктических изолятов S. antarcticus и М. roseus показано, что соотношение различных каротиноидов мембраны зависит от температуры культивирования: при низкой температуре возрастало содержание полярных пигментов каротиноидов с одновременным уменьшением неполярных (Chattopadhyay, 2006). Поэтому предполагается, что синтез жирных кислот направленных на повышение текучести мембраны и полярных каротиноидов уменьшающих ее являются двумя уравновешивающими процессами (Chattopadhyay, 2006).
Белки теплового шока (HSP) представляют собой группу широко распространенных в организмах белков, защищающих их от теплового стресса, однако некоторые из них способствуют выживанию бактерий при низких температурах. Показано, что к увеличению выживаемости клеток Е. coli при хранении при температуре -80С приводит прогрев перед этим суспензии клеток при 42 С в течение 30 мин.Установлено, что при таком прогреве индуцируется синтез некоторых HSP-белков (Chow and Tang, 1998). При переносе цианобактерии Synecoccus sp. РСС 7942 с 37 в 25С уровень HSP-белка С1р В увеличивался в 5-6 раз. Рост и фотосинтетическая активность мутанта, лишенного этого белка, значительно снижались (Porankiewicz and Clarke, 1997).
Аналогичные результаты были получены для белка Htp G, являющегося прокариотическим гомологом хорошо известного белка теплового шока Hsp 90 (Hossain and Nakamoto, 2002). Ранее с помощью сайтнаправленного мутагенеза было показано, что этот белок необходим Synecoccus sp. РСС 7942 при культивировании при 45С. Мутантный штамм, лишенный HtpG, прекращал рост после 20 часов культивирования при температуре 16С, а дикий тип при этом сохранял медленный рост (Hossain and Nakamoto, 2002). При изменении температуры культивирования с 30 до 16С, фотосинтетическая активность штаммов снижалась в случае дикого штамма на 20, а в случае мутанта более чем на 20%. У дикого типа активность в течение 5 суток оставалась на том же уровне (80%), а у мутанта продолжала снижаться. С помощью Вестерн-блоттинга была показана высокая индукция Htp G при культивировании при 16С у дикого штамма и его отсутствие у мутантного варианта. Отсюда следует, что и С1р В и Htp G играют значительную роль в способности к акклиматизации Synechococcus sp., РСС 7942 при пониженных температурах.
Индукция некоторых молекулярных шаперонов (Hsc В, Hsc 25, триггер-фактор) повышается при снижении температуры (Yamanaka, 1999; Kawahara et al., 2000). Индукция Hsc 66, гомолога белка теплового шока HSP 70, синтезируемого в E.coli, вызывается не только тепловым, но и Холодовым шоком (Lelivelt and Kawula, 1995). Таким образом, белки теплового шока играют важную роль в адаптации бактерий к холоду. Это не удивительно, так как белки теплового шока индуцируются не только при повышении температуры, но и при других стрессовых факторах. Многие белки теплового шока являются шаперонами, стабилизирующими белки в правильной конформации при различном стрессе. Они также помогают рефолдингу белков и их растворению в случае агрегации. Все это необходимо не только в случае теплового, но и холодового шока.
Холодовой шок - это действие, которое оказывает на клетку резкое снижение температуры. Ответом на холодовой шок называется сумма клеточных реакций, необходимых для эффективной адаптации к снижению температуры окружающей среды (Weber and Marahiel, 2003). В отличие от теплового шока, этот ответ запускается только при резком снижении температуры и отсутствует при воздействии других стрессовых факторов. Наиболее подробно ответ на холодовой шок исследован у бактерии Е. coli (Thieringer et al., 1998), в том числе с помощью протеомных и геномных исследований. Показано, что к белкам холодового шока относятся небольшие по размеру (около 70 аминокислотных остатков) консервативные белки, имеющие домен связывания с нуклеиновыми кислотами. Гены, кодирующие белки холодового шока, идентифицированы у различных психрофильных, мезофильных, термофильных и даже гипертермофильных бактерий, включая такие как Thermotoga и Aquifex, что говорит о древнем происхождении этой группы белков (Graumann and Marahiel, 1998). Белки, синтезируемые исключительно в психрофильных микроорганизмах в ответ на понижение температуры, были названы Cap (cold acclimation proteins). Белки холодового шока, идентифицированные в Е. coli, включали гистоподобные белки, субъединицу ДНК - гиразы, РНК связывающие белки, факторы транскрипции, триггер-фактор и др. Один из основных белков холодового шока CspA выполняет в клетках Е. coli функции активатора транскрипции и РНК-шаперона. Гомологи гена, кодирующего белок, обнаружены в геноме нескольких антарктических бактерий (Chattopadhyay, 2006). Но роль белков холодового шока в адаптации психрофильных микроорганизмов к низким температурам требует дальнейшего детального изучения.
Классификация бактериальных липаз
Липидоразлагающие ферменты не только играют важную роль в метаболизме организмов, но и являются привлекательным объектом биотехнологии из-за потенциальной возможности их применения для синтеза новых соединений, которые могут быть использованы в пищевой, фармацевтической и химической промышленности (Gupta et al., 2004).
Липолитические ферменты, принадлежащие к классу гидролаз, участвуют в реакциях расщепления сложноэфирной связи в липидах и других органических соединениях, а так же способны гидролизовать неэфирные связи (Buchholz et al, 2005; Sterner, 1999). На данный момент эстеразы делят на 84 класса по рекомендации Комитета по номенклатуре (Nomenclature Committe of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)) в соответствии с видом связи и субстрата, участвующих в реакции гидролиза. Гидролазы карбоксильных эфиров, расщепляющие ацилглицеролы с образованием глицерина и жирных кислот, называются липазами (Gupta et al., 2004; Testa and Mayer, 2003).
Липазы встречаются в тканях животных, растений, а также у микроорганизмов, включая грибы, бактерии и археи (Bornscheuer, 2002; Hasan et al., 2006). Для большинства все физиологические функции до конца не ясны, но основная их функция - участие в трансформации липидов (Pandey et al., 1999). Микробные липазы обладают широкой субстратной специфичностью, что обеспечивает продуцирующие их микроорганизмы питательными веществами из различных источников (Bornscheuer, 2002; Gunstone, 1999; Sharma et al, 2001). Некоторые липазы также участвуют в преобразовании мембранных липидов, в клеточной сигнализации, в контролируемой деградации внутриклеточных вакуолей, в цитолизе (Schmid and Verger, 1998; Titball, 1998), в детоксикации биоцидов и загрязняющих веществ (Khalameyzer et al., 1999; Margesin et al., 2003), а также в патогенезе, выступая в качестве факторов вирулентности (Jaeger et al, 1994;Stehr et al., 2003).
Были разработаны различные критерии, чтобы отличать триацилглицерол-липазы или настоящие липазы (ТЛ, КФ 3.1.1.3) от карбоксилэстераз или эстераз (КЭ, КФ 3.1.1.1). Однако субстратная специфичность является в настоящее время основным критерием их дифференциации (Bornscheuer, 2002; Fojan et al, 2000; Testa and Mayer, 2003). Настоящие липазы способны утилизировать длинноцепочечные ацилглицеролы и другие эфиры, в то время как эстеразы утилизируют ацилглицеролы и эфиры с короткой длиной цепи (Bornscheuer, 2002). Нет строгого определения коротких и длинных субстратов, но эфиры с длиной ацильной цепи 10 атомов углерода считаются субстратами липаз, при этом в качестве стандарта активности используется триолеин. Эфиры с длиной ацильной цепи 10 атомов углерода считаются субстратами эстераз, и в качестве стандарта используется трибутирин (Jaeger et al, 1999; Fojan et al, 2000). Большинство липаз способны гидролизовать субстраты для эстераз, а некоторые эстеразы гидролизуют субстраты с длинной углеводородной цепью (Fojan et al, 2000; Jaeger et al, 1999).
Липазы обладают способностью катализировать огромное число разнообразных реакций. Они катализируют гидролиз ацилглицеролов и других эфиров: простых эфиров, фосфолипидов, ацилгликозидов и др., а также катализируют обратную реакцию синтеза эфиров, перенос ацильных групп в том числе интер- и трансэтерификацию ацилглицеролов, спиртов, эфиров, гликозидов и аминов (Bornscheuer, 2002; Ferrer et al., 2000; Gupta et al, 2004; Hedfors et al, 2010; Schmidt-Dannert, 1999; Zhang et al. 2011). Липазы проводят эти реакции с высокой хемо-, регио- и энантиоселективностью, которые могут быть различны для реакций гидролиза, синтеза или переноса ацильных групп (Gotor-Fernandez et al., 2006; Gunstone, 1999; Reetz, 2002).
Количество липаз, охарактеризованных за последнее десятилетие, огромно, в том числе многие из них были исследованы с помощью рентгеновской кристаллографии и методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (Angkawidjaja et al, 2010; Breg et al, 1995; Chen et al, 2009; Fojan et al, 2000; Sibille et al, 2006). Согласно полученным данным, почти все липазы, даже имеющие низкое сходство аминокислотных последовательностей, обладают сходной пространственной структурой (Jaeger et al.,1999; Widmann et al., 2010). Эти ферменты принадлежат к обширному суперсемейству альфа/бета-гидролаз, молекулы которых характеризуются наличием центрального домена, имеющего структуру альфа/бета-сэндвича. Центральный домен включает бета-слой, образованный 5-11 бета-тяжами и фланкированный с обеих сторон альфа-спиралями (Ollis et al., 1992). Каноническая структура обычно содержит 8 бета-тяжей, второй из которых антипараллелен остальным (Рис. ЗА) (Carr and Ollis, 2009; Ollis et al, 1992; Van Pouderoyen et al, 2001).
Доступ к активному центру у ферментов данного семейства часто экранируется мобильной «крышкой» (lid или cap), положение которой может определять активную или неактивную конформацию фермента (Lotti et al., 1994). «Крышка » может состоять из одной или двух альфа-спиралей или образовываться петлей, в которой гидрофобная часть направлена в сторону активного центра, а гидрофильная экспонируется наружу (Cygler and Schrag, 1997; Ericsson et al, 2008; Grochulski et al, 1994; Miled et al, 2003). «Крышка» закрывает активный сайт фермента в отсутствие субстрата и сдвигается за счет структурных изменений, давая доступ субстрату и растворителю к активному центру фермента (Gao et. al, 2011; Secundo et al, 2006). Ho существуют исключения. Так, панкреатическая липаза морской свинки не имеет «крышки» в своей структуре (Cygler and Schrag., 1999; Jaeger et al, 1999; Verger, 1997). Наиболее консервативной особенностью альфа/бета гидролазного фолда является наличие «нуклеофильного локтя» - гамма-поворота с нуклеофилом (Nu) на вершине. Конфигурация этого поворота требует наличия остатков с небольшими боковыми группами, например, глицина, в положениях Nu-2, Nu+2, Nu+З, что позволяет им располагаться на небольшом расстоянии от субстрата и участвовать в формировании так называемой оксианионной полости. Данный участок, стабилизирующий отрицательно заряженное переходное состояние в процессе гидролиза, обычно образуется двумя атомами азота основной цепи, один из которых принадлежит остатку, следующему за нуклеофилом (Nu+І), а второй располагается между бета-тяжем 3 и альфа-спиралью 1. Каталитические остатки карбоксила и гистидина чаще всего расположены в петлях, следующих за бета7- и бета8-тяжами соответственно. Связывание субстрата в большинстве случаев происходит в кэп-домене, расположенном над каталитической триадой.
Базовая архитектура фолда модифицируется в различных белках при помощи инсерций, не изменяющих общую структуру и каталитический механизм. Чаще всего удлиняются петли после участков бетаЗ, бета4, бетаб, бета7 или бета8 (Nardini and Dijkstra, 1999). Инсерций, длина которых может варьировать от нескольких аминокислотных остатков до целого домена, оказывают влияние на геометрию и микроокружение активного сайта, что в свою очередь создает потрясающее разнообразие субстратной специфичности и других свойств членов семейства.
Активный центр альфа/бета гидролаз содержит остатки, образующие каталитическую триаду: нуклеофил (серии, цистеин или аспартат), карбоксил (аспартат или глутамат) и остаток гистидина, всегда расположенные в таком порядке (Рис.ЗВ) (Jaeger et al., 1999; Ollis et al., 1992). Установлено, что в липазах нуклеофилом всегда является серии, в то время как карбоксилом может быть как аспартат, так и глютамат (Bornscheuer, 2002; Cai et al., 2004; Jaeger et al., 1999; 0sterlund et al., 1997). Нуклеофил серии расположен в консервативном участке аминокислотной последовательности пентапептида Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly (Cai et al, 2004; Ollis et al, 1992).
Активный сайт липаз содержит карман связывания жирных кислот, ответственный за размещение ацильной цепи сложных эфиров. Существуют и дополнительные карманы связывания для ацильных цепей других субстратов, таких как триацилглицеролы (ТАГ), предназначенные для удержания субстрата вблизи активного центра в процессе катализа (Jaeger et al, 1999).
Накопительное культивирование и выделение чистых культур бактерий
Следующим этапом работы стало определение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, выделенных культур, путем прямого секвенирования фрагментов ДНК, полученных в реакции ПЦР с использованием универсальных бактериальных праймеров. Полученные нуклеотидные последовательности длиной от 399 до 1473 п.о. сравнили с последовательностями, имеющимися в базах данных RDP и GenBank с использованием программы BLAST (Табл. 14).
Филогенетический анализ показал, что выделенные штаммы принадлежат к двум филумам: Firmicutes и Actinobacteria. Филум
Actinobacteria представляли 7 штаммов (из образцов № 1, 2 и 6), принадлежащих к роду Brevibacterium; 2 штамма (из образцов № 2 и 3) относились к роду Dietzia, 8 штаммов - к роду Citricoccus (из образцов № 2 и 4) и 1 штамм - к роду Kocuria (из образца №2). Филум Firmicutes был представлен 1 штаммом (из образца №4), относящемуся к роду Lacticigenium и 1 штаммом - к роду Bacillus (из образца №2).
В результате работы получена коллекция из 20 штаммов чистых культур микроорганизмов, обладающих липолитической активностью. Большую часть коллекции составляют представители актинобактериальных семейств Dietziaceae, Micrococcaceae (роды Citricoccus и Kocurid) и Brevibacteriaceae (род Brevibacterium).
Из филогенетической дендрограммы (Рис. 6), построенной с использованием почти полных последовательностей генов 16S рРНК, видно, что штаммы LJalO, JaCP38 и LJa5 представляют один вид рода Brevibacterium, близкий галофильному виду В. marinus, выделенному из морской воды (Lee, 2008). Другой штамм JaCP44, также изолированный из криопэга Ямала, генетически близок В. antiquum, типовой штамм которого VKM Ас-2118 выделен из плейстоценовых многолетнемерзлых отложений Колымской низменности (Гавриш и др., 2004). Для двух из семи штаммов, представляющих род Citricoccus, были получены почти полные последовательности генов 16S рРНК. Штамм JaCP29 оказался близок виду Citricoccus muralis, а штамм А1-Т9 - виду С. nitrophenolicus. Род Dietzia был представлен двумя штаммами, близкими между собой и виду D. maris. Следует отметить, что все известные представители этого рода характеризуются устойчивостью к содержанию до 7-10% NaCl (Gharibzahedi etal.,2014).
Наиболее интересным из выделенных бактерий филума Firmicutes оказался штамм А1-Т7, генетически близкий единственному виду L. naphtae рода Lacticigenium семейства Carnobacteriaceae. Это факультативно-анаэробные галофильные бактерии, устойчивые к 17% NaCl, основным продуктом метаболизма которых является лактат (lino et al., 2009).
Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК некоторых штаммов, выделенных из арктических криопэгов. Длина масштабной линейки: 2 замены на 100 нуклеотидов. Учетный номер базы данных GenBank указан в скобках. Дендрограмма построена с использованием метода поиска ближайших соседей ("neibour-joining"). Данные "bootstrap -анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления.
Другой штамм - грамположительная бактерия штамм YaCP24-наиболее близка была к виду Bacillus pumilus, споры которой, чрезвычайно устойчивы к стрессовым факторам окружающей среды, таким как УФ излучение, высыхание и воздействие окислителей (Link et al., 2004). Штаммы этого вида характеризуются также высокой солеустойчивостью. Ранее была охарактеризована липаза одного из штаммов этого вида (Kim et al., 2002).
Анализ литературы показал, что при скрининге на наличие липолитической активности образцов арктических почв и осадков также были обнаруженыпродуценты холодоактивных липаз, относящиеся к филумам Actinobacteria и Bacilli, но большинство исследованных авторами продуцентов принадлежало к грам-отрицательным бактериям, относящимся к филумам Bacteroidetes и Proteobacteria (Srinivas et al., 2009; Rasol et al., 2014). Как видно из Таблицы 5, большинство известных продуцентов холодоактивных липаз относятся к грам-отрицательным бактериям филума Proteobacteria, в том числе к классу Gammaproteobacteria, например, к родам Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Psychrobacter spp и др. (см. Табл. 5). Многие исследователи этих липаз сталкиваются с их нестабильностью под влиянием различных факторов (температура, добавление солей и детергентов и др.) (Joseph et al, 2007; Kulakova et al, 2004). Поэтому полученная нами коллекция грам-положительных галофильных психроактивных бактерий является потенциальным источником более перспективных липолитических холодоактивных ферментов, предположительно, обладающих повышенной стабильностью к различным факторам.
Результаты работы показали, что наиболее перспективными для выделения продуцентов липолитических ферментов являются криопэги Ямала и Аляски (Табл. 12). Дальнейшие исследования позволят изучить филогенетические свойства выделенных галотолерантных и галофильных бактерий, обладающих липазной активностью, и установить их таксономическое положение.
P. cryohalolentis штамм К51 был выделен из криопэга в вечной мерзлоте Арктики (Bakermans et al., 2006). Подробная физиолого-биохимическая характеристика штамма К5 представлена в Табл. 3. Клетки этой аэробной бактерии представляли собой грамотрицательные, неподвижные, непигментированные, неспорообразующие коккобацилы размером 0,9-1,3 мкм в длину и 0,5-0,8 мкм в ширину. P.cryohalolentis образовывал гладкие матовые круглые колонии диаметром 2 мм. Хотя оптимальный рост наблюдался при температуре 22С, штамм К5Т мог осуществлять метаболические реакции при отрицательных температурах до --10С. NaCl был необязателен для роста, но рост не ингибировался присутствием соли до 1,7 М NaCl. В качестве единственного источника углерода и энергии штамм использовал цитрат, лактат, ацетат и L-глутаминовую кислоту. Основные жирные кислоты клеточной стенки являются Сі8:ію7с и Сіб:ію7с- Биохимические тесты показали положительные результаты на щелочную фосфатазу, эстеразу (С4), эстеразу липазу (Cg), липазу (Ci4), лейцинариламидазу и нафтол-АБ-ВІ-фосфогидролазу.
Для подтверждения наличия липолитической активности у Р. cryohalolentis культуру высевали на агаризованную среду с родамином В и оливковым маслом (среда АСР) или с трибутирином (среда ACT) и инкубировали при температурах 4 и 25С. Образование флюоресцирующего окрашивания на среде с родамином В (Рис. 7 а и б) и появление областей гидролиза на среде с трибутирином (Рис. 8 а и б) указывали на наличие липаз у этого организма. При инкубировании при 4 С зона гидролиза и интенсивность окрашивания в УФ была больше. Это свидетельствует о потенциальном наличии именно холодоактивных ферментов у организма.
