Введение к работе
: 2
Актуальность проблемы 2
Цель и задачи исследования 4
Научная новизна 4
Основные положения, выносимые на защиту 5
Научно-практическое значение 7
Апробация работы 7
Актуальность проблемы. Лйтические ферменты, раарушвдяе клеточные стенки бактерій, грибов и высшх растений, привлекают пристальное внимание ученых. С развитием работ по ферментативному лизису клеточных стенок микроорганизмов связан достигнутый к настоящему времени прогресс в изучении этих структур и в разработке методов генетической инженерии.
Первым ферментом, обладающим литическим действием на клетки микроорганизмов, был лизоцим, открытый Флемингом в начале двадцатых годов (Fleming, Allison, 1922).
В начале пятидесятых годов появились первые сообщения о бак-териолитических ферментах бактериального происхождения (fcbCarty, 1952). В настоящее время можно достаточно определённо утверждать, что данные ферменты обнаружены у всех изученных микроорганизмов (Rogers, 1979).
Есе известные лйтические ферменты можно разбить на два класса по месту их локализации и функции. К первому классу относятся ав-толизины, локализованные внутри бактериальной клетки. Они играют важную роль в жизнедеятельности бактерий (Захарова, Павлова, 1985; Rogers et. al 1980). Показано участие автолизинов в процессах гидролиза и биосинтеза клеточных стенок (Chatterjee et al., 1976; Hayasrii et al., 1931), прорастании спор (Ando, 1979; Goirbas, Labbe, 1985; Foster, Johnstone, 1987), роста и деления клеток (Ayusawa et al., 1975; Rogers, 1970), определении проницаемости клеток к ряду макромолекул и прежде всего ДНК (Ranhand et al., 1971; Seto, Tomasz,1975), чувствительности к антибиотикам (Rogers, Forsberg, 1970). В клетке в норме существует равновесие между ферментами, разрушающими и синтезирующими клеточную стенку. Встраивание.вновьсинтезированного материала в клеточную стенку происходит после гидролиза определенных связей в молекуле пепти-догдикана. Процессы лизиса и биосинтеза происходят одновременно в течение роста клетки. И только на поздних стадиях развития, когда биосинтетические процессы вагухают, а активность логических ферментов остается на прежнем уровне или даже возрастает, происходит автолиз клетки (Goodell, Tomasz, 1980).
Ко второму классу можно отнести внеклеточные лйтические фер-
менты. Их биологическая роль, по-видимому, заключается в том, что микроорганизмы, синтезирующие и секретирущие такие ферменты в среду, имеют преимущество перед остальными микроорганизмами прежде всего в источниках питания. Разрушая клетки других микроорганизмов, бактерия-продуцент литических ферментов использует аминокислоты, углеводы и другие компоненты дизированной клетки для собственных нулд. В настоящее время данная группа ферментов интенсивно исследуется с точки зрения возможности их практического использования.
Литические ферменты нашли широкое применение для получения протопластов из бактерий (Inouye et al., 1979; Yokogawa et al,. 1975) и дрокяей (Yasucstsu et al., 19665, изучения структуры клеточных стенок бактерий (Jonga, Tonass, 1993), в генноинженерных работах при выделении ДНК (Щзкина и др., 1983), выделении антигенов (Hamada et al. , 1932) и фрагментов (щеточных стенок, обладавши иммуностимулирующей ( Kawata et al 1934) и противоопухолевой активностями ( Рар и др. , 1985), а тагаге других компонентов микробной клетки, в частности, белков, липвдов, антибиотиков, пигментов и полисахаридов (Andrews, Asenjo, 1987).
Перспективной областью применения бактериолитических ферментов является медицина Ens' в 1S64 году было проведено успешное лечение лизостафином мыяей, зараженных патогенными стафилококками (Schuardt, Schindler, 1964). Было показано, что лизостафин в комбинации с рядом антибиотиков и поверхностноактивньк веществ может быть использован при лечении маститов у животных (Blackburn, Pollack, 1990). Бактериолитические ферменты могут быть использованы при лечении и профилактике кариеса (Yoshimura et al, 1976).
Таким образом, интерес исследователей к поиску новых бактериолитических ферментов определяется как их ролью в жизнедеятельности бактерий, так и возможностями их практического использования.
В 1975 году в ЩЙЇ РАН под руководством академика F. К. Скрябина, чх корр. РАН It С. Кулаева и к. б. н. В. А. Ламбиной были начаты исследования бактериолитических ферментов микроорганизмов. Были выделены бактерии, продуцирующие бактериолитические ферменты, и оценена их способность лизировать грамполокительные и грам-отрицательные микроорганизмы.
- A -Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось выделение и изучение бактериолитических ферментов микроорганизмов для использования их в фундаментальных научных исследованиях структуры клеточных стенок бактерий и медицине. Для достижения указанной целя в работе решались следующие основные задачи:
-
Выделение и характеристика бактериолитических ферментов;
-
Исследование механизма гидролиза пептидогликана клеточных стенок бактерий выделенными бактериолктическими ферритами;
-
Изучение первичной структуры клеточных стенок бактерий с использованием бактериолитических ферментов известной специфичности;
-
Выяснение возможности получения функционально активных протопластов из клеток Staphylococcus aureus с помощью выделенных бактериолитических ферментов;
-
Исследование возможности создания лекарственного препарата на основе бактериолитических ферментов для лечения ран, инфицированных патогенными микроорганизмами.
Научная новизна. Б результате проведенных исследований впервые охарактеризованы Оактериолитические ферменты Pseudomonas lytica, Micavibrio admirandus и Pseudomonas sp. :
показано, что основными бактериологическими ферментами P. lytica и М. admirandus являются лктические протеиназы;
установлено, что фермент, выделенный из фильтрата культу-ральной жидкости P. lytica, гидролизовал г.ептидогликак клеточных стенок S.aureus по связям в пентаглициновом мостике;
определено, что штамм Pseudomonas sp. синтезировал и секре-тировал в культуральную жидкость комплекс бактериолитических ферментов, названный лиаоамидазоя. Биосинтез лизоамидазы может осуществляться как свободными, так и иммобилизованными в полиакрила-мидный гель клетками;
выявлено, что в состав лизоамидазы, кроме бактериолитических ферментов (логической протеиназы, мурамидазы, ацетилмура-мил-аланин амилазы), входят металлопротеиназа, нейтральная фосфатаза и полисахарид. Изучен вклад каждого компонента в суммарную бактериолитическую активность лизоамидазы;
установлено, что лизоамидаза лизировала клетки стафилокок-
ксв, в том числе устойчивые к антибиотикам. Только устойчивые к пенициллину штаммы Streptococcus pneumonias гидродизовались лизо-амидаэой. Такой характер действия лизоашедазы на клетки S.pneumoniae связан с изменениями в структуре пептидогликана клеточных стенок при развитии устойчивости к пенициллину, а именно, с появлением пептидов, несущих связи, которые гидролизовалксь зн-допептидазой лизоамидазы.
С использованием бактериолитическвх ферментов исследована перЕичкая структура пептидогликана клеточных стенок двух штаммов бактерий рода Eubacterlum и DD-карбоксипептидазного мутанта S.pneumoniae:
установлено, что пептидогликан птокма E.nodatum относится к навагу типу - A5v, а пептидогликан штамма E.alactolytlcmi - к А1т типу;
обнаружено, что мутанты S.pneumoniae, лишенные Ш-карбокси~ пептидавы, имеют изменённую структуру пептидогликана. В пептидог-ликзне мутантов обнаружены пептиды, в состав которых входит пептидная субъединица, образованная пентапептидом.
Основные подолання, выносимые на задзіту.
-
Новый вид бактерии рода Pseudomonas - P.lytica синтезирует и секретирует в ростовую среду бактериолитический фермент - лити-ческую протеиназу. Фермент способен ливировать клетки бактерий рода Staphylococcus и Spreptococcus. Биосинтез литической протеина-вы контролируется по механизму катаболитной репрессии. Внесение в ростовую среду убитых клеток стафилококка приводит к двукратному увеличению выхода фермента. Литическая протеиназа гидролизует пептидогликан клеточных стенок S.aureus по связям в пентаглицино-вом мостике.
-
Охарактеризована бактериолигическая система паразитической бактерии Mlcavlbrio adralrandus. Очищена до гомогенного состояния литическая протеинава, определены основные физико-химические свойства фермента.
-
Из культуральной жидкости бактерии Pseudomonas sp. выделен
- 6 -комплекс бактериолитичєских и прстеодитичееких ферментов и полисахарида, получивший название лизоамидаза. Лиаоамидаза лизировала клетки стафилококков независимо от их устойчивости к антибиотикам. Ферменты диаоамидазного комплекса гидролизовали пептидогли-кан клеточных стенок S.aureus по связям, образованным двумя глицинами, аланином и мурамовой кислотой, мурамовой кислотой и ацетилглюкозамином.
Только устойчивые к пенициллину штаммы S.pneumoniae гидролизо-вались лизоамидазой, что связано с изменением первичной структуры пептидной части пептидогликана при развитии устойчивости к пенициллину. Появление в пептидогликане устойчивых к пенициллину штаммов разветвлённых пептидов, которые являлись субстратом эндо-пептидааы лизоамидазы, приводило в целом к гидролизу этих штаммов.
4. Из лизоамидазы выделены, очищены до электрофоретически
гомогенного состояния и охарактеризованы металлопрбтеиназа, лити
ческая протеиназа Л2, нейтральная фосфатаза. Кроме того, из лизо
амидазы выделены: полисахарид и литическая фракция Л1, состоящая
из мурамидавы, протеиназы и литического фермента, предположитель
но, зндопептидазы. Реконструкция ливоамидазы из полученных фер
ментов показала, что только литическая протеиназа Л2 и литическая
фракция Л1 вносят вклад в суммарную бактериолитическую активность
лизоамидазы. Полисахарвд оказывал стабилизирующее действие как на
отдельные ферменты, так и на бактериолитическую активность ре
конструированного препарата.
5. Литические ферменты являются ванным инструментом при ис
следовании структуры клеточных стенок бактерий. Это было проде
монстрировано на примере изучения первичной структуры клеточных
стенок двух штаммов бактерий рода Eubacterlum: E.nodatum и
E.alactolytlcum с использованием литического комплекса, выделен
ного из бактерии Strepomyces albus G. Структура пептидогликана Е.
nodatum содержит в межпептидном мостике пептид L-Ala-L-Ala-L-Orn,
который соединён с орнитином, находящимся в третьем положении од
ной пептидной субъединицы Ala-Glu(61y)-0rn-Ala, и аланином в чет
вертом положении другой пептидной субъединицы. В структуре пепти
догликана E.alactolytlcum две пептидные субъединицы Ala-Glu(Gly)-
тАдаї-АІа непосредственно соединены между собой.
С использованием дитического фермента - амидазы S.pneumoniae исследована первичная структура пептидогликана DD-карбоксипепти-дааного мутанта S.pneumoniae, несущего дефект в пеницидлинсвязы-вагацем белке 3. Впервые показано, что пептидогликан в отсутствии нативного пенициллиневязыващего бедка 3 претерпевает изменения, связанные с накоплением пептидов, в которых пептидная субъединица образована пятью аминокислотами; четвёртое и пятое положения в пептидной субьединице заняты D-аланином.
Научно-практическое значение. Полученные результаты являются частью работы по созданию фундаментальных основ получения бакте-риолитических ферментов с целью их использования в медицине. На основе бактериолитического комплекса лизоамидазы создан лекарственный препарат для лечен::я ран, ожогов и других повреждений кожи, твёрдых и мягких тканей ротовой полости. Созданный препарат не имеет аналогов. Эффективность лечебного действия препарата связана с его составом: протеолитические ферменты очищает рану от некротических масс, бактериолитические ферменты лизиругот находящиеся в ране грамполаяительше патогенные микроорганизмы, полисахарид не только стабилизирует комплекс , ко также, по-видимому, ускоряет регенерацию тканей. С 1989 года лизоамидаза производится в промышленном масштабе и используется в медицинской практике.
Другое возможное использование лизоамидазы связано с её протео-литической активностью. Показано, что лизоамидаза может заменить трипсин при мацерации тканей и отделении растущего монослоя клеток от стекла при работах, проводимых на культуре клеток. Такое действие лизоамидазы связано с входящей в её состав металдопро-теиназой (авт.свид. 1594214).
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на всесоюзных и международных конференциях: Всесоюзном совещании по медицинской энзимологии (Алма-Ата, 1983), Всесоюзной конференции по биосинтезу ферментов микроорганизмами (Кобулети, 1986; Ташкент, 1988), Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), Международном симпозиуме по внеклеточным ферментам микроорганизмов (Бехин, 1986), Всесоюзном симпозиуме по медицинской
- 8 -энзимодогии (Махачкала, 1986), Всесоюзной конференции "Раны и раневая инфекция" (Москва, 1966), Международном симпозиуме по сверхпродукции микробных продуктов (Чешские Будиёвицы, 1988), Лейпцигском симпозиуме по биотехнологии (Лейпциг, 1988), Всесоюзной конференции по регуляции микробного метаболизма (Пущино, 1989), Международном симпозиуме по молекулярной организации биологических структур (Москва, 1989), Международной конференции по биологически активным природным продуктам (Варна, 1389), Международной конференции по антимикробной активности неантибиотиков (Копенгаген, 1990), Европейском конгрессе по биотехнологии (Копенгаген, 1990), Конференции американского общества микробиологов (Новый Орлеан, 1992).
Принятые в работе сокращения: МИК - минимальная ингибирующая концентрация, ВВК - белково-витаминный концентрат, МПЕ - мясо-пеп-тонный бульон, ВЯИ - высскоразрешающая жидкостная хроматография, ТФК - трифторуксусная кислота, ТХУ - трихлоруксусная кислота, ТХК - .тейхоевая кислота, ЭДТА - этилендиаминтетрауксуеная кислота, ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид, яЖБ - пара-хлормеркурийбенао-ат, п-Агрю - мево-диаминопимелиновая кислота, ЛЕ - бактериолити-ческая активность, НЕ - протеолитическая активность.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 62 работы (38 статей, 22 тезисов), получено б авторских свидетельств.
Благодарности. Особую благодарность автор выражает руководителю проекта "Создание научных основ получения бактериолитических ферментов с целью их использования в медицине" чл. корр. АН РАН профессору И.С. Кулаеву за постоянную поддержку и чуткое руководство.
Автор выражат глубокую благодарность коллегам, принимавшим участие в выполнении различных этапов данной работы: к.б.н. О.А. Степной, к.б.н. Г.В. Абрамочкину, д.б.н. В.И. Крупянко, д.б.н. А.Г. Козловскому, д.б.н. А.В. Афиногеновой, к.б.н. Е.Л. Таусон,
- 9 -к.т.н. В.А. Ежову, к.б.н. В.А. Ламбиной, к.б.н. М.В. Богданову, к.б.н. А.Я. Валиахыетову, к.б.н. В.В. Петрову, к.б.н. А.Ю. Арин-басаровой, к.б.н. А.В. Прокопович, д.б.н. А.А. Селезнёвой, Л.А. Ледовой, З.С. Плотниковой, Е.Н. Ратнеру, О.В. Круглой, А.И. Кудрявцевой, а также К. Като и С. Какигучи - сотрудникам лаборатории микробиологии университета г. Огеаяма (Япония) и А. Томасу - зав. лабораторией микробиологии Рокфеллеровского университета, Нью-Йорк, (США) за плодотворное сотрудничество.
Искренняя благодарность и светлая память осталась от сотрудничества с к.б.н. М.А. Бобыком.
Огромная благодарность и признательность академику Г.К. Скрябину - инициатору работ по созданию научных основ получения лекарственного препарата лиаоамидааы.
Цитируемая литература
-
Захарова И. Я., Павлова И.Н., Литические ферменты микроорганизмов, 1985, Киев, Наукова думка, 215с.
-
Рар В.А., Ким Г.И., Коробкина О.Н., и др., Биотехнология, 1985, N4, с. 38-43.
-
ЩёкинаЕ.В., Григорьева СП., Полумиенко А. Л., Прикл. биохим. микробиол., 1982, N8, с.240-243.
-
AndoY., J.Bacterol., 1979, 140, N1, p. 59-64.
-
Andrews В.A., Asenjo J.A., Trends In Biotechnology, 1987, N10, p. 73-277.
-
Ayusawa D., YonedaY., Yamana K. etal., J.Bacterlol., 1975, 124, N1, p. 459-469.
-
Blackburn P., Pollack J., Europ. Pat. N 0359873, 1990.
-
Chatterjee A.N., Wong W., Young F.E. et al., J.Bacterlol., 1976, 125, N3, p. 961-967.
-
Fleming A., Allison V.D., Brit. J. Exp. Path., 1922, 3, p.252-260.
-
Foster S.J., Johnstone K., Blochem., 1987, 242, N2, p. 573-579.
-
GombasD.E. , Labbe R.G., J. Sen. Microbiol., 1985, 131, p. 1487-1496.
-
Goodell W., Tomasz A., J. Bacterlol., 1980, 144, N3, p. 1009-1016.
-
Hamada S., Okahashi N.. Klmura S., et al., Japan. J. Med. Sai. Biol. 1982, 35, N4, p. 171-181.
-
Hayashi K., Kasumi Г.,Kubo N.. Tsumura N.. Agr. Biol. Chem., 1981, 45, N10, p. 289-2300.
-
Inouye M., Hamada S., Ooshima T. et al., Microbiol. Immunol., 1979, 23, N5, p.319-328.
-
Kawata S., Yokogawa K., Takahashi E. et al., Agrlc. Biol. Chem., 1984, 48, N7, p.1783-1793.
-
McCarty M., J. Exp. Med., 1952, 56, p. 569-580.
-
Ranhand J.M. , Leonard СВ., Cole R.M., J.Bacterlol., 1971, 106, N1, p. 257-268.
-
Rogers H.J., Bacterol. Rew., 1970, 34, p. 194-214.
-
Rogers H.J., Forsberg C.W., J. Bscterlol., 1971, 108, N3, p. 1236-1243.
-
Rogers H.J., Perkins H.R., Ward J.В., Microbial cell walls and membranes, 1980, London, NY, (Chapman, Hall), 541p.
-
Schuhardt V.T., Schindler С A., Proc. Nat. Acad. Sci., 1964., 51, p. 414-421.
-
Seto H., Tornasz A., J. Bacterial., 1975, 121, N2, p. 344-353.
-
Yasumatsu K., Qhno M., Fobarl. et al., J. Ferm. Technol., 1966, 44, N11, p. 847-853. " .
5. Yokogawa K., Kawata S., Takemura T. et al., Agr. Biol. Chem.,
1975,-39, N8, p. 1533-1543. ^ _ '.. ..-. . . 26. YoshlmuraY. , Yogawa K., Kawata S.,' Pat USA N 3965869,' 1976.
