Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 18
1.1. Амидазы - нитрилгидролизующие ферменты 18
1.1.1. Применение L- и D-энантиомеров аминокислот 19
1.1.2. L-селективные аминокислотные амидазы 22
1.1.3. D-селективные аминокислотные амидазы 25
1.2. Биотрансформация субстратов иммобилизованными амидазами 29
1.2.1. Иммобилизация клеток с амидазной активностью 29
1.2.2. Иммобилизация выделенных амидаз 1.3. Факторы, влияющие на стереоселективность ферментов 32
1.4. Энантиоселективная биотрансформация 0,Ь-фенилглицинонитрила. 36
1.5. Биотрансформация фенилаланинамида 41
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 43
2.1. Объекты исследования 43
2.2. Выделение и идентификация амидгидролизующих бактерий 43
2.3. Среды и субстраты для культивирования 46
2.4. Определение амидазной активности и стереоселективности штаммов 46
2.5. Выделение амидазы 47
2.6. Иммобилизация 49
2.7. Определение продуктов реакции трансформации нитрилов и амидов 50
2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция 51
2.9. Секвенирование ДНК 53
2. 10. Статистическая обработка 54
ГЛАВА 3. Исследование культуральных и стереоселективных свойств штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 56
3.1. Выделение и селекция штаммов, способных к стереоселективной трансформации 0,Ь-лактамида
3.2. ПЦР-анализ генов D-аминокислотных амидаз 57
3.3. Идентификация выделенных культур 59
3.4. Влияние источника углерода на рост и амидазную активность бактерий 63
3.5. Влияние источника азота на рост и амидазную активность бактерий.. 65
3.6. Влияние иммобилизации на стереоселективные свойства внутриклеточных амидаз 67
ГЛАВА 4. Стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 69
4.1. Каталитические свойства амидазы, иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, активированным бензохиноном 69
4.2. Стереоселективные свойства амидаз, иммобилизованных различными методами 76
4.3. Влияние температуры на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз 81
4.4. Влияние рН на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз 84
ГЛАВА 5. Биотрансформация ароматических амидов аминокислот 86
5.1. Биотрансформация 0,Ь-фенилглицинонитрила 86
5.1.1. Скрининг микроорганизмов, способных к гидролизу D,L-фенилглицинонитрила 86
5.1.2. Индукция нитрилгидролизующей активности штамма Rhodococcus rhodochrous 4-1 88
5.1.3. Трансформация 0,Ь-фенилглицинонитрила изолированной амидазойі?. rhodochrous 4-1 90
5.1.4. Влияние температуры на активность и стереоселективность амидазы R. rhodochrous 4-1 в реакции гидролиза D,L-фенилглицинонитрила 91
5.1.5. Влияние иммобилизации нитрилгидратазы и амидазы
R. rhodochrous 4-Х на стереоселективность реакции 91
5.2. Биотрансформация L-фенилаланинамида 93
Заключение 96
Выводы 102
Список литературы 1
- D-селективные аминокислотные амидазы
- Определение амидазной активности и стереоселективности штаммов
- Влияние источника углерода на рост и амидазную активность бактерий
- Стереоселективные свойства амидаз, иммобилизованных различными методами
D-селективные аминокислотные амидазы
Амидаза, выделенная из клеток Mycobacterium neoaurum АТСС 25795, была впервые описана как фермент, проявляющий активность по отношению к L-a-алкил-замещенным амидам аминокислот (Hermes et al., 1994). Позднее была выделена и охарактеризована L-аминокислотная амидаза, выделенная из штамма Pseudomonas azotoformans IAM 1603. Фермент имел узкую субстратную специфичность, будучи активным только по отношению к L-пролинамиду, L-аланинамиду и L-метионинамиду (Komeda et al., 2004). Штамм Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321 проявлял высокую амидазную активность по отношению к а,а-дизамещенным а-аминокислотным амидам, а-амидам гидроксикислот и a-N-гидроксиаминокислотным амидам со строгой L-селективностью (Sonke et al, 2005). Komeda и Asano описали L-стереоселективную аминокислотную амидазу штамма Brevundimonas diminuta TPU 5720, которая проявляла стереоселективность по отношению к широкому ряду L-амидов аминокислот, включая L-фенилаланинамид, L-глутаминамид, L-лейцинамид, L-метионинамид, L-аргининамид и амид L-2-аминомасляной кислоты (Komeda et al., 2006).
Среди D-стереоспецифических амидаз одной из первых была выделена амидаза штамма Ochrobactrum antropi SV3, которая катализировала энантиоселективный гидролиз ряда ароматических амидов аминокислот, включая D-фенилаланинамид, D-тирозинамид и D-триптофанамид (Komeda еґа/.,2000).
Термостабильная D-стереоспецифическая аланинамидаза, выделенная из термофила Brevibacillus borstelensis BCS-1, использовалась для гидролиза D-аланинамида (Sung et al., 2000; Baek et al., 2002). D-аланинамид специфическая амидогидролаза, выделенная из штамма Arthrobacter sp. NJ-26, также катализировала энантиоселективный гидролиз 0,Ь-аланинамида с энантиомерным выходом 99% (Ozaki et al., 1992). Образующийся в результате гидролиза D-аланин используется в качестве сырья в синтезе подсластителей.
С помощью штамма Delftia acidovorans 16 осуществлен стереоселективный гидролиз DerZ-лейцинамида до DerZ-лейцина, одной из наиболее ценных D-аминокислот, коммерческая стоимость которой составляет более 100 долларов за грамм. Было установлено, что аминокислотная последовательность D-стереоселективной аминокислотной амидазы Delftia acidovorans на 67,9% гомологична D-аминокислотной амидазе бактерии Variovorax paradoxus (Hongpattarakere et al., 2005; Krieg et al, 2002).
Hayashi с соавт. описали R-энантиоселективную амидазу Comamonas acidovorans, которая гидролизует D-лейцинамид и D-фенилаланинамид, но имеет низкую стереоселективность (Hayashi et al., 1997).
На сегодняшний день нерешенными остаются несколько проблем стереоселективной трансформации аминокислотных амидов: выход процесса составляет 50%, возникают трудности при разделении L-a-аминокислоты от D-a-аминоамида, а также рацемизация последнего (Maestracci et al., 1988). Эти недостатки могут быть устранены путем изучения свойств аминокислотных амидаз, получением мутантных штаммов, иммобилизацией клеток или выделенного фермента.
Таким образом, поиск и характеристика бактерий - продуцентов амидаз аминокислот остается актуальной задачей биотехнологии. Новые данные о природе и свойствах этих ферментов и их продуцентов позволят разработать новые, а также усовершенствовать существующие процессы биотрансформации.
Научная новизна Селекционированы культуры бактерий способные к стереоселективному гидролизу амидов аминокислот. Разработаны и синтезированы праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям генов, кодирующих известные D-аминокислотные амидазы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Впервые определено влияние различных факторов - состав культуральной среды, температура и рН реакционной среды - на стереоселективные свойства амидаз штаммов R. rhodochrous 4-ій Arthrobacter sp. 6-1. Изучено влияние иммобилизации на каталитические и стереоселективные свойства биокатализаторов на основе целых бактериальных клеток и выделенных амидаз. Оптимизированы условия процесса биотрансформации D,L-фенилглицинонитрила и L-фенилаланинамида.
Теоретическое и практическое значение работы Полученные экпериментальные данные расширяют представления о процессах стереоселективной трансформации амидов клетками бактерий. Определено влияние различных факторов внешней среды на стереоселективные свойства амидаз. Установлено, что для проявления стереоселективности амидазы в гетерогенном катализе определяющим фактором является присутствие носителя, который изменяет соотношение образующихся изомеров, что может быть использовано для увеличения энантиомерной чистоты продуктов ферментативной реакции.
Показана возможность получения изомеров фенилглицина и фенилаланина при трансформации соответствующих амидов стереоселективными амидазами. Оптимизирована среда культивирования наиболее перспективного изолята Arthrobacter sp., выделенного с целью дальнейшего использования в качестве биокатализатора гидролиза рацемических амидов. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Штаммы - продуценты амидаз R. rhodochrous 4-ій Arthrobacter sp. 6-1 способны к стереоселективной трансформации 0,Ь-лактамида с максимальным энантиомерным избытком 44 и 43% соответственно. Иммобилизация клеток и оптимизация условий роста бактерий не дают увеличения энантиомерной чистоты продукта. 2. Иммобилизация амидазы методом ковал ентной сшивки с активированным хитозаном приводила к повышению термо- и операционной стабильности; методом поперечно сшитых ферментных агрегатов - к повышению стереоселективности трансформации амидов. 3. Изученные штаммы трансформировали D,L-фенилглицинонитрил до L-фенилглицина с разной степенью стереоселективности, гидролизовали L-фенилаланинамид до L-фенилаланина. Апробация работы и публикации Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на IV, V, VI, VII Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия» (Воронеж, 2011; Тверь, 2012; Иркутск, 2013; Екатеринбург, 2014), Международной школе-конференции «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2014). Результаты проведенных исследований опубликованы в 10 научных работах: 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, тезисы 6 докладов. Объем и структура диссертации
Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 17 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 189 наименований работ, в том числе 17 отечественных и 172 зарубежных автора.
Определение амидазной активности и стереоселективности штаммов
Такой гидролиз способны осуществлять виды Rhodococcus, которые обладают неселективной нитрилгидратазой и L- или D-специфичной амидазой. Штаммы MAWA, MAWB, MAWE, MAWC и MAWD синтезировали нитрилгидратазу, которая конвертировала нитрил до амида, и L-специфичную амидазу, которая гидролизовала накапливающийся амид до L-кислоты (Wegman et al., 2001). В результате оптимизации условий роста полученных культур, был отобран штамм R. globerulus MAWA, который в течение 5 минут катализировал гидролиз 0,Ь-фенилглицинонитрила с образованием 48% D-фенилглицинамида (ее - 99%) и последующий 4-часовой гидролиз амида с образованием 52% L-фенилглицина (ее - 97%) (Wegman etal, 2001).
Штамм Rhodococcus sp. AJ270, обладающий нитрилгидратазной и амидазной активностью, способен гидролизовать широкий ряд рацемических а-замещенных фенилацетонитрилов и 2-арилциклопропанкарбонитрилов с высокой энантиоселективностью (Meth-Cohn et al, 1997; Wang et al., 2000). Данный штамм был использован для энантиоселективной биотрансформации 0,Ь-фенилглицинонитрила. После реакции в течение 2,5 часов был получен D-фенилглицинамид (ее=74%) и L-фенилглицин (ее=9Ъ%) (Wang et al., 2001).
Выделен и идентифицирован штамм Pantoea endophytica, который синтезировал S-фенилглицин (ее 99%) в результате гидролиза S-фенилглицинамида. Синтез R-фенилглицина (ее 99%) был достигнут при использовании другого штамма Pantoea sp., обладающим R-селективной амидазой. Nocardioides sp. гидролизовал рацемический фенилглицинонитрил до S-фенилглицинамида (ее=52%) без последующего гидролиза в кислоту из-за отсутствия амидазной активности (Hensel et al., 2002). Aspergillus fumigatus с помощью нитрилазы катализирует гидролиз 0,Ь-фенилглицинонитрила до L-фенилглицина с энантиомерным избытком 80% (Choi et al., 1986; Lee et al., 1988).
Клетки Pseudomonas aeruginosa 10145 использовали в качестве биокатализатора в трансформации 2-фенил-2-аминоацетонитрила до D-фенилглицина. После реакции в течение 1 часа было получено 18% D-фенилглицина с энантиомерным избытком 95% (Alonso et al., 2008). Чтобы повысить биокаталитический потенциал, клетки Ps. aeruginosa 10145 были включены в 1,5%-ный альгинат кальция. 20%-ная конверсия 2-фенил-2-аминоацетонитрила до D-фенилглицина была достигнута в результате 3-часовой реакции (ее 98%). Иммобилизованный фермент использовали в 4-х циклах, в ходе которых сохранялась биокаталитическая активность (Alonso et al, 2007).
Таким образом, энантиоселективная биотрансформация D,L-фенилглицинонитрила с использованием нитрилгидролизующих ферментов является перспективным методом получения изомеров фенилглицина.
Фенилаланин - ароматическая аминокислота, которая существует в двух оптически изомерных формах L и D. Потребность в этой аминокислоте очень велика. Фенилаланин используется для сбалансирования кормов животных, как компонент спортивного питания. Значительная часть фенилаланина идёт на производство дипептида аспартама — синтетического сахарозаменителя, активно использующегося в пищевой промышленности (Kamphuis et al., 1990).
До недавнего времени единственным методом лечения болезни Паркинсона было хирургическое вмешательство в область головного мозга. Сейчас найдено эффективное лекарство — 3,4-диоксифенилаланин (ДОФА) и его производные. Ь-метил-3,4-дигидроксифенилаланин используют в качестве исходного вещества для синтеза Эналаприла - лекарственного препарата против гипертензии. D-фенилаланин является основой противодиабетического лекарственного средства (James, 2003).
Получение фенилаланина возможно методами прямого микробиологического синтеза (Khamduang et al., 2009), либо методами биотрансформации с использованием предшественников, в качестве которых рассматриваются коричная кислота (Yamada et al., 1981), фенилпируват (Miller et al., 1987). Использование для синтеза фенилаланина предшественников считается наиболее перспективным в силу более высоких достигаемых концентраций целевого продукта и большей скорости реакции.
Энантиомеры фенилаланина также получают ферментативным расщеплением рацемических предшественников аминокислоты: производных гидантоина (Zhou et al., 2011), эфиров и амидов фенилаланина (Komeda et al., 2006; Komeda et al, 2003), ацетилпроизводных (Hermes et al, 1993). С открытием D-стереоспецифических ферментов появилась возможность получения не только L-, но и D-энантиомеров аминокислот, которые ранее получали исключительно химическим синтезом. В связи с этим, энзиматические методы приобрели большую популярность (Leuchtenberger et al, 2005).
Объектом исследования явились штаммы, выделенные из образцов антропогенно-загрязненной почвы, а также штаммы лабораторной коллекции, обладающие амидазной активностью. Образцы почвы были отобраны на территории Подольского завода цветных металлов и предоставлены сотрудниками кафедры физиологии растений и микроорганизмов (ПГНИУ, Пермь).
Для дальнейших исследований были отобраны два штамма Arthrobacter sp. 6-1 и R. rhodochrous 4-1, обладающие амидазной активностью и стереоселективностью.
Штаммы выделяли методом прямого высева. Навеску почвы (1,0 г) суспендировали в 100 мл стерильного фосфатного буфера, оставляли при температуре 28С при постоянном перемешивании со скоростью вращения 120 об/мин на 1 час. Полученный раствор использовали для разведений и последующего параллельного высева на чашки Петри с агаризованной средой N, содержащей селективный субстрат - лактамид в концентрации 10 мМ. На 3-7 сутки роста отбирали среди образовавшихся колоний наиболее крупные, а также морфологически различающиеся переносили на чашки Петри со свежей селективной средой. Чистую культуру пересевали в колбы с жидкой средой аналогичного состава и культивировали в течение 5-7 суток. Селекцию проводили на минеральной среде N с добавлением лактамида до конечной концентрации 50 мМ в качестве единственного источника углерода и азота.
Влияние источника углерода на рост и амидазную активность бактерий
Оптимизация условий культивирования позволяет не только увеличить скорость роста и выход биомассы биотехнологически значимого штамма, но и повысить его продуктивность в отношении желаемых субстратов. При этом важную роль играют такие компоненты среды как источник углерода и азота.
Оценивали влияние различных источников углерода (глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза, сорбит, маннит, дульцит, инозит, янтарная, муравьиная, уксусная, лимонная кислоты) на рост и амидазную активность клеток R. rhodochrous 4-ій Arthrobacter sp. 6-1. Исследуемые источники углерода вносили в минеральную среду в концентрации 0,1%, в качестве источника азота использовали 10 мМ ацетонитрил.
Высокая плотность культуры R. rhodochrous достигалась в результате использования в качестве источника углерода ряда спиртов - сорбита, дульцита и инозита, а также янтарной кислоты. Максимальный рост штамма Arthrobacter sp. 6-1 наблюдался в присутствии сахарозы и ряда кислот -уксусной, лимонной и янтарной (рисунок 12). Указанная плотность соответствует максимальной и наблюдается в конце экспоненциальной фазы роста культур (3-4 сутки).
Установлено, что штамм R. rhodochrous 4-1 проявляет максимальную амидазную активность при использовании сорбита в качестве источника углерода. Высокую активность амидазы штамма 4-1 также наблюдали при росте клеток на инозите и муравьиной кислоте. Оптимальными субстратами для роста и проявления амидазной активности Arthrobacter sp. 6-1 являются кислоты (лимонная, муравьиная и янтарная). Максимальная активность была зарегистрирована при росте клеток на муравьиной кислоте (рисунок 13).
Влияние источника азота на рост и амидазную активность бактерий Исследовано влияние ряда альтернативных источников азота на рост и амидазную активность штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1.
Максимальный рост клеток R. rhodochrous 4-ій Arthrobacter sp. 6-1 наблюдался в присутствии ацетонитрила, который обеспечивал достаточно высокий уровень ферментативной активности (рисунок 14). Повышение амидазной активности культуры 4-1 наблюдалось также в присутствии мочевины (рисунок 15). R. rhodochrous 4-1 Arthrobactersp. 6-1
В результате проведенных экспериментов было установлено, что при выращивании штаммов 4-1 и 6-1 с использованием оптимальных источников углерода и азота, наблюдалось незначительное повышение (2-15%) стереоселективных свойств по отношению к 0,Ь-лактамиду (таблица 10).
Изучение влияния иммобилизации штаммов 4-1 и 6-1 на стереоселективность внутриклеточных амидаз также проводили путем трансформации рацемического лактамида до D- или L-изомера молочной кислоты. Клетки штаммов иммобилизовали методом адсорбции на активном березовом угле (БАУ). Суспендированные клетки R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 гидролизовали лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 76 к 24% и 72 к 28% соответственно, тогда как адгезированные не проявляли стереоселективных свойств (таблица 11). Таблица 11 - Стереоселективный гидролиз рацемического лактамида свободными и иммобилизованными клетками
Иммобилизованные Arthrobacter sp. 6-1 0,35±0,017 37±4,7 рацемат Известно, что многие оптически активные вещества обладают лишь ограниченной устойчивостью. В случае снижения доли одного из оптических изомеров при трансформации иммобилизованными на углеродном носителе клетками, возможно, происходит рацемизация молочной кислоты. Известно, что рацемизация чаще может происходить не самопроизвольно, а вызываться различными физико-химическими воздействиями, причем катализаторами рацемизации могут выступать щелочные агенты (Потапов, 1988). В данном случае, скорее всего, причиной снижения оптической чистоты образующегося раствора молочной кислоты при гидролизе адгезированными клетками является не изменение скорости образования изомеров, а присутствие носителя в образце, приводящее к рацемизации.
Таким образом, установлено, что оптимальными источниками углерода и азота для роста и проявления амидазной активности штамма R. rhodochrous 4-1 являлись дульцит и ацетонитрил, для штамма Arthrobacter sp. 6-1 -муравьиная кислота и ацетонитрил. Стереоселективность, проявленная штаммами на этих питательных средах, незначительно отличалась от стереоселективности культур при росте на контрольной среде, а иммобилизация клеток на углеродном адсорбенте БАУ приводила к снижению оптической чистоты образующегося продукта.
Стереоселективные свойства амидаз, иммобилизованных различными методами
Изучали стереоселективные свойства иммобилизованных амидаз R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 в модельной реакции гидролиза рацемического лактамида до D- и L-изомеров молочной кислоты.
Отмечено, что при ковалентной сшивке ферментов обоих штаммов с активированным хитозаном стереоселективность реакции снижается (таблица 13, 14). Так, соотношение D- и L-энантиомеров молочной кислоты в реакции, катализируемой ферментом 4-1 в растворе, составило 89 и 11%, тогда как в реакции, катализируемой ковалентно присоединенной к хитозану амидазой - 59 и 41%.
Было изучено влияние адсорбционной иммобилизации на углеродсодержащих носителях на активность и стереоселективность амидаз. Установлено, что при адсорбции амидаза R. rhodochrous сохраняет лишь 15-18% активности нативного фермента, а амидаза Arthrobacter sp. - 36-46%. Показано, что фермент 4-1, иммобилизованный на СУМС, гидролизовал лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 60 к 40%, тогда как фермент, адсорбированный на Сибуните, гидролизовал лактамид без стереоселективности (таблица 13). Иммобилизованный фермент Arthrobacter sp., полученный методом адсорбции, также проявлял низкую стереоселективность (таблица 14). Можно предположить, что в этом случае стереоселективность реакции снижается как за счет изменения скорости образования энантиомеров, так и в результате влияния гетерогенной среды, в частности, свойств носителей, на рацемизацию полученных продуктов реакции гидролиза лактамида. При контакте смеси D-и L-изомеров молочной кислоты в соотношении 4:1с СУМС в течение 1 ч при 22С происходило превращение смеси в L-изомер, с Сибунитом - в D-изомер. Так как эти данные не согласуются с результатами трансформации рацемического лактамида амидазой, адсорбированной на этих носителях, можно заключить, что на процесс снижения энантиоселективности реакции влияет не только микроокружение фермента, создаваемое углеродным носителем, но и особенности образования фермент-субстратного комплекса у адсорбированного фермента.
Были получены поперечно-сшитые ферментные агрегаты при высаливании сульфатом аммония с одновременной сшивкой бифункциональными реагентами - глутаровым альдегидом и бензохиноном. Установлено, что при сшивании молекул амидазы 4-1 бензохиноном сохраняется около 9% исходной активности фермента, глутаровым альдегидом - около 30% активности. Было показано, что иммобилизованные амидазы штаммов, полученные данным методом, проявляют более высокую D-стереоселективность, чем ферментные препараты в растворе. Так, биокатализатор 4-1, полученный сшивкой глутаровым альдегидом, катализировал гидролиз 0,Ь-лактамида с энантиомерным избытком D-изомера до 92%, а поперечно сшитые агрегаты амидазы Arthrobacter sp. 6-1 при использовании глутаральдегида и бензохинона - 84 и 95% соответственно (таблица 13, 14). Таблица 13 - Влияние иммобилизации на активность и стереоселективные свойства амидазы R. rhodochrous 4- Соотношение Активность по лактамиду, Количество энантиомеров Амидаза мкмоль/мгмин связанного молочной ее, % (% сохранения активности) белка, % кислоты D : L, % В растворе 3,80±0,26 (100) 100 89:11 78±5,6 на сибуните 0,68±0,054 (18) 59 50:50 0±0,011 Адсорбированная на СУМС 0,57±0,035 (15) 67 60:40 20±1,7 Ковалентно присоединенная к 1,60±0Д2(42) 38 59:41 18±0,98 активированному хитозану глутаровый 1Д4±0,091 (30) 100 96:4 92±7Д ПСФА альдегид бензохинон 0,34±0,028 (9) 100 84:16 68±4,3 Таблица 14 - Влияние иммобилизации на активность и стереоселективные свойства амидазы Arthrobacter sp. 6- Соотношение Активность по лактамиду, Количество энантиомеров Амидаза мкмоль/мгмин связанного молочной ее, %
Температура, С Рисунок 25 - Зависимость энантиомерного избытка (1) и активности (2) поперечно сшитых препаратов амидазы Arthrobacter sp. 6-1 от температуры. Сдвиг максимума энантиоселективности поперечно сшитых агрегатов амидазы в сторону более высоких температур может объясняться стабилизацией определенной конформации амидазы, более предпочтительной для образования фермент-субстратного комплекса с D-изомером лактамида. Температура ниже 20С и выше 60С приводила к снижению энантиоселективности. Известно, что энантиоселективность является результатом разницы между свободной энергией активации энантиомеров, которая имеет энтальпический и энтропический компонент. В данном случае образование комплекса D-изомера с активным центром амидазы энтальпически выгодно, но энтропически не выгодно. Другим значимым параметром является температура рацемизации. В данном случае нагрев реакционной смеси до 70С приводил к резкому снижению энантиоселективности даже в случае ферментов, стабилизированных за счет иммобилизации.
Исследовали влияние рН среды на активность и стереоселективность препаратов амидаз. Установлено, что стереоселективность обоих ферментов достигает максимума при рН 6.0 (рисунок 26, 27). Тогда как максимум активности (1,51 ЕД) наблюдается при рН 7.0 - Arthrobacter sp. 6-1 и рН 7.0-8.0 - R. rhodochrous 4-1 (2,01 и 2,32 ЕД соответственно). амидазы (2) Arthrobacter sp. 6-1. Влияние рН на активность и стереоселективность ферментов связано с ионизацией функциональных групп аминокислотных остатков белка, обеспечивающих оптимальную конформацию активного центра фермента. При закислении среды происходит протонирование свободных аминогрупп, что приводит к изменению конформации молекулы фермента и конформации активного центра. В данном случае снижение рН с 7.0 до 6.0, вероятно, вызвало увеличение сродства D-изомера лактамида к активному центру амидазы.
