Введение к работе
Актуальность проблемы. Использование биокатализаторов в
тонком органическом синтезе находит все более широкое применение.
Привлекательность биокаталитических превращений заключается в
уникальной субстратной и стереоспецифичности действия ферментов,
возможности проведения реакций в "мягких", экологически
благоприятных условиях. Успешным примером является применение
пенициллинацилазы из Escherichia coli для модификации бета-
лактамных антибиотиков как на стадии гидролиза природного
пенициллина с целью получения ядра пенициллинов 6-
аминопенициллановой кислоты, так и на стадии ферментативного
ацилирования 6-аминопенициллановой кислоты с целью получения
новых «полусинтетических» антибиотиков этого класса. На основании
исследований последних лет, показавших высокую стереоселективность
пенициллинацилазы, следует предположить, что этот фермент найдет
широкое применение при получении энантиомерно чистых соединений.
Детальные исследования выявили, что пенициллинацилаза обладает
широкой субстратной специфичностью и высокой
стереоселективностью в реакциях ферментативного гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот. В то же время было установлено, что каталитическая эффективность и стереоселективность фермента дикого типа в реакциях ацильного переноса на первичные амины и аминоспирты, а также в реакциях гидролиза соответствующих N-фенилацетильных производных недостаточна для сколько-нибудь эффективного расщепления рацематов этих соединений. На основании анализа научной литературы наиболее эффективным способом улучшения свойств пенициллинацилазы дикого типа представляется введение мутаций в структуру фермента. В случае пенициллинацилазы из Escherichia coli ранее было показано, что введением мутаций удается добиться улучшения способности фермента катализировать синтез бета-
лактамных антибиотиков. Следует отметить, что поиск мутантных форм пенициллинацилазы с улучшенной способностью катализировать ферментативный ацильный перенос на первичные амины не может быть сведен к использованию мутаций, которые улучшали способность к синтезу антибиотиков из-за принципиальных отличий в структуре субстратов и в условиях проведения соответствующих реакций. Более того, наряду с целью улучшения каталитической эффективности, задачей диссертационной работы было также увеличение стереоселективности действия фермента, принципы регуляции которой в настоящее время практически не изучены.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось
поиск мутантных препаратов пенициллинацилазы из E.coli с
увеличенной стереоселективностью и каталитической эффективностью
в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, и в
реакциях стереоселективного гидролиза соответствующих N-ацильных
производных. В соответствии с этим, задачами явились исследование
каталитических свойств препаратов мутантных форм
пенициллинацилазы по положению 145, 149 альфа цепи, а также 71, 384, 385 бета цепи, в частности, получение очищенных препаратов мутантных форм пенициллинацилазы, первичная характеристика их стабильности и каталитической активности, детальные исследования каталитических свойств перспективных препаратов в реакциях стереоселективного ацильного переноса на первичные амины и аминоспирты, и гидролиза соответствующих N-ацильных проиводных.
Научная новизна. Впервые показана возможность улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из E.coli в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, а также в реакциях гидролиза их N-ацильных производных путём замены единичных аминокислотных остатков в структуре фермента. В частности, замена аминокислотного остатка в положении 145 альфа цепи и 71 бета цепи
пенициллинацилазы приводит к существенному увеличению стереоселективности и каталитической эффективности фермента в названных ферментативных превращениях.
Практическая значимость работы. Выявлены точечные мутанты пенициллинацилазы из E.coli, характеризующиеся увеличенной стереоселективостью, эффективностью ацильного переноса на добавленный нуклеофил и каталитической активностью в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, а также в реакциях гидролиза соответствующих N-ацильных производных. Применение исследованных мутантов представляет интерес для целей разделения рацематов первичных аминов и аминоспиртов, а также для синтеза соответствующих энантиомерно чистых N-ацильных производных. Апробация работы. Результаты работы были представлены на российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Москва-Пущино, 2006 г., на 4 Международном конгрессе «Биотехнология-2007», Москва, 2007 г., на Международной конференции «Ломоносов-2007», Москва, 2007 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссией, 3 тезисов докладов на международных конференциях и 1 заявка на патент. Объем и структура работы. Дисертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 141 ссылку. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 25 рисунков.
