Введение к работе
Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза из E.coli широко используется в фармацевтической промышленности. Появление структурных данных, а также разностороннее исследование каталитических свойств пенициллинацилаз из различных источников позволило задуматься о получении пенициллинацилаз с измененными свойствами. Совместный анализ ранее накопленных данных о взаимосвязи строения субстратов и эффективности их каталитического превращения, а также структуры нативной пенициллинацилазы, аналогов фермент-субстратного комплекса и комплексов с ингибиторами позволяет очертить круг тех аминокислотных остатков, которые могут определять специфичность и хиральную дискриминацию субстратов в активном центре, а также участвовать в механизме действия фермента. Сайт-направленный мутагенез предоставляет возможность выявления роли этих остатков в механизме действия пенициллинацилазы, понимания природы субстратной специфичности и энантиоселективности ее действия. В то же время получение мутантных форм пенициллинацилазы представляет большой интерес для фармацевтической и тонкой химической промышленности, поскольку таким путем могут быть получены катализаторы, превосходящие нативный фермент. Таким образом, получение и характеристика мутантных форм пенициллинацилазы имеет как фундаментальное, так и практическое значение.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось исследование каталитических свойств мутантов пенициллинацилазы из E.coli, полученных при сайт-направленном мутагенезе остатков, которые на основании имеющихся структурных данных могут играть важную роль в механизме действия фермента и определять его специфичность ((3Phe71, (3Phe57, aArgl45 и aPhel46): изучение субстратной специфичности полученных мутантных пенициллинацилаз, характеристика стереоселективности их действия в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот, исследование мутантов как катализаторов ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков в водной среде, детальная кинетическая характеристика реакций переноса ацильной группы на добавленный нуклеофил, катализируемых наиболее активными мутантами, их использование в препаративном синтезе ампициллина и цефалексина.
Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований были впервые охарактеризованы каталитические свойства более 30 мутантных форм пенициллинацилазы из Е. coli: каталитическая активность, субстратная специфичность и энантиоселективность действия, способность катализировать ацильный перенос на ядра пенициллинов и цефалоспоринов. Показано, что ряд мутантных ферментов по остатку (3Phe71 обладают измененным субстратным профилем и более высокой специфичностью по отношению к производным D-фенилглицина, причем каталитическую активность фермента к отдельным субстратам удается повысить более чем в 10 раз. Введением мутаций в положение (3Phe71 (в зависимости от природы вводимого остатка) можно регулировать (повысить или понизить) стереоселективность фермента в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот. Охарактеризована возможность использования мутантных ферментов в качестве катализаторов синтеза Р-лактамных антибиотиков ампициллина и цефалексина; показано, что замена остатка pPhe57, являющегося важным составным фрагментом узкого
гидрофобного кармана для связывания ацильной части субстрата, может привести к снижению эффективности действия фермента на три порядка. В то же время замена остатков aArgl45 и aPhel46 может улучшить эффективность ацильного переноса на ядра пенициллинов и цефалоспоринов; проведено детальное исследование каталитических свойств наиболее активных мутантных форм фермента с целью выявления оптимальных условий синтеза антибиотиков. Определены количественные параметры, определяющие эффективность переноса ацильной группы на добавленный нуклеофил при использовании данных мутантов пенициллинацилазы в качестве катализатора. Три мутантных формы фермента по остатку: aArgl45 (aArgl45Ser, aArgl45Leu и aArgl45Gly), показавшие наиболее эффективные каталитические свойства при синтезе ампициллина и цефалексина по сравнению с нативной пенициллинацилазой, использованы в качестве катализаторов препаративного процесса. Показано, что при использовании этих мутантных форм можно получить более высокий выход целевого продукта с меньшими нецелевыми потерями донора ацильной части при синтезе ампициллина. Детально охарактеризована также субстратная и стереоспецифичность действия одного из «улучшенных» мутантных ферментов этой группы - aArgl45Leu в реакциях гидролиза. Предложен новый оптически активный тиоловый реагент N-фенилацетил-(К)-фенилглицил-(8)-цистеин для хирального анализа аминокислот и определения энантиоселективности действия пенициллинацилазы и ее мутантов. Проведенные исследования позволили получить ряд мутантных пенициллинапилаз с улучшенными свойствами. Наибольший практический интерес представляют мутанты (3Phe71 с увеличенной энантиоселективностью действия как катализаторы получения индивидуальных энантиомеров аминокислот, а также мутантные формы фермента по остатку aArgl45, на основании которых могут быть созданы более эффективные биокатализаторы получения полусинтетических Р-лактамных антибиотиков пенициллинового и цефалоспоринового ряда.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на международных конференциях: «Biocatalysis-2002: Fundamentals and applications», г. Москва, 2002 г. и «Biocatalysis-2005: Fundamentals and applications», г. Санкт-Петербург, 2005 г., на 1 и 3 Биотехнологических конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития», г. Москва, 2002 и 2003 гг., "Ломоносов-2004", г. Москва, 2004 г., 2-ой Международной конференции «Инженерия ферментативных реакций», г. Цавтат, Хорватия, 2005 г., Научно-практической конференции «Живые системы» в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002 - 2006 гг.», г. Москва, 2006 г., Симпозиуме по сотрудничеству Европейского Союза и России в области пищи, сельского хозяйства и биотехнологии, г. Санкт-Петербург, 2006 г., обсуждены на заседаниях кафедры химической энзимологии Химического факультета, семинарах НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского и Факультета Биоинженерии и Биоинформатики МГУ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 164 ссылки. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 2 схемы и 19 рисунков.
