Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Характеристика озера Байкал 8
1.2. Экологические факторы, определяющие развитие микроорганизмов в определенных районах озера
1.3. Физико-химическая характеристика донных осадков озера Байкал и поровых вод
1.4. Органическое вещество донных осадков озера Байкал 17
1.5. История микробиологических исследований донных осадков озера Байкал
1.6. Численность микроорганизмов донных осадков озера Байкал 21
1.7. Разнообразие микроорганизмов донных осадков озера Байкал 24
1.8. Исследование структуры микробных сообществ методами молекулярной биологии
1.9. Биоразнообразие бесцветных серных бактерий 27
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследования и методы отбора проб 31
2.2. Методы выделения суммарной бактериальной ДНК 35
2.3. Методы молекулярной микробиологии 36
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Сравнение стратегий методов выделения суммарной бактериальной ДНК из донных осадков озера Байкал 47
3.2. Анализ таксономического состава поверхностных и глубинных слоев донных осадков Посольской банки
3.2.1. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов поверхностного слоя осадков станции Посольская банка
3.2.2. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов глубинного слоя осадков станции Посольская банка
3.3. Исследование микробного сообщества бесцветных серных бактерий
3.3.1. Распространение и морфология бесцветных серобактерий 80
3.3.2. Филогенетическое положение байкальской бактерии рода Thioploca
3.3.3. Сопутствующее микробное сообщество бактерии рода Thioploca
3.3.4. Филогенетическое положение серной бактерии рода Thiothrix 103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 106
ВЫВОДЫ 109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 111
ПРИЛОЖЕНИЯ 131
- Характеристика озера Байкал
- Объекты исследования и методы отбора проб
- Сравнение стратегий методов выделения суммарной бактериальной ДНК из донных осадков озера Байкал
Введение к работе
Актуальность проблемы. Байкал - это уникальное, олиготрофное озеро, возраст которого оценивается в 20-30 млн. лет (Атлас Байкала, 1993). Его характеризуют большие глубины, низкая температура воды и постоянство химического состава вод в глубинной части. Высокая насыщенность кислородом всей толщи воды, низкая концентрация органических веществ и минерализация воды - обуславливают специфические условия жизнедеятельности организмов. 60% флоры и фауны являются эндемиками (Тимошкин, 2001).
В последние годы на Байкале открыты места приповерхностного залегания газовых гидратов и нефтепроявлений, но признаков губительного влияния газов и загрязнения вод Байкала нефтью не выявлено. Очевидно, в этих районах наблюдаются активные процессы, ключевую роль в которых играют микроорганизмы донных осадков и водной толщи.
Ранее микробиологические исследования донных отложений Байкала проводили по следующим направлениям: определение общей численности микроорганизмов и сезонной динамики (Яснитский и др., 1927; Мессинева, 1957; Младова, 1975; Романова, 1963), изучение различных физиологических групп (Никитин, 1967; Луста, Намсараев, 1988; Лаптева, 1990). В исследованиях использовали методы электронной микроскопии, биохимии и радиоизотопии (Максимов, Черных, 1979; Штевнева, Судакова, 1986; Земская и др., 1997). Однако большая часть микроорганизмов не культивируется (более 90%), поэтому при исследовании природных образцов классическими методами часть сообщества остается неизученной (Amann et al., 1995).
Использование методов молекулярной биологии позволяет идентифицировать и выявлять отдельные виды микроорганизмов в различных природных сообществах без культивирования.
5 Цель работы - исследование структуры микробных сообществ в осадках районов, различающихся по экологическим условиям. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Подобрать эффективные методы выделения суммарной бактериальной ДНК из донных осадков озера Байкал, чтобы избежать ингибирующего действия гуминовых кислот.
Исследовать разнообразие микроорганизмов в донных отложениях, сформированных в голоцене и плейстоцене (на примере станции Посольская банка).
Исследовать разнообразие микроорганизмов в районе гидротермального источника б. Фролиха и сопоставить с мировыми базами данных.
Подтвердить филогенетическое положение бесцветных серных бактерий родов Thioploca и Thiothrix.
Научная новизна. Впервые проведено изучение микробных сообществ донных осадков озера Байкал, различающихся по экологическим условиям и времени формирования осадка. На основе сравнительного анализа фрагментов гена 16S рРНК установлено, что в осадках преобладают некультивируемые формы бактерий, последовательности которых имеют невысокую степень гомологии с известными в мировой базе данных. Филогенетический анализ последовательностей показал, что они в основном группируются с последовательностями альфа-, гамма-, бета- и дельта-протеобактерий, Holophaga/Acidobacteria, Planctomycetes, Actinobacteria, Firmicutes, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Nitrospirae, Chloroflexi. Найдены последовательности гомологичные археям, относящиеся к царствам Crenarchaeota и Euryarchaeota. Впервые подтверждено филогенетическое положение бесцветных серных бактерий родов Thioploca, Thiothrix обитающих в Байкале, а также исследовано
сопутствующее микробное сообщество бактерии рода Thioploca. Впервые обнаружены бесцветные серные бактерии в районах впадения рек и местах естественных нефтепроявлений озера Байкал.
Защищаемые положения.
Донные осадки, сформированные в различные временные периоды и отличающиеся по экологическим условиям, характеризуются разнообразными микробными сообществами. Для современных голоценовых осадках описано более 18 филогенетических групп, для плейстоценовых глубинных - 5.
Бесцветные серные бактерии широко распространены в озере Байкал и обнаружены в районе гидротермального источника бухты Фролиха, местах впадения рек и естественных нефтепроявлениях. Структура гена 16S рРНК байкальской бактерии рода Thioploca на 99% является идентичной последовательностям пресноводных представителей бактерии из других мест обитания: озер Бива и Констанц.
Практическая значимость. Для исследований оценены различные методы выделения ДНК из донных осадков озера Байкал, что особенно важно при работе с осадками различной литологии. Создан банк данных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК, 92 последовательности зарегистрированы в базе данных NCBI, им присвоены следующие номера: DQ916135, DQ780007, DQ338566, DQ371461-DQ371460, DQ364475-DQ364473, DQ359154, DQ359155, DQ35932-DQ356934, AY833517-AY833519, AY839107-AY839135, AY739914-AY739938, DQ178146-DQ178162. Эта информация может быть использована для построения филогенетических деревьев, выяснения родственной связи между бактериями из других географических мест. Также полученные последовательности могут быть использованы для конструирования групп- и
7 видо-специфичных праймеров и зондов для быстрого и эффективного анализа микробного сообщества донных осадков и воды.
Полученные данные расширяют представления о таксономическом составе донных осадков озера Байкал, позволяют проводить сопоставление с результатами исследования микробных сообществ других озер и океанов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на научно-практической конференции "Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе", Иркутск, 2002; всероссийской конференции "Биоразнообразие и функционирование микробных систем Центральной Азии", Улан-Уде, 2003; международном Байкальском симпозиуме по микробиологии "Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ", Иркутск, 2003; международном рабочем совещании ""Происхождение и эволюция биосферы", г. Новосибирск, 2005; Четвертой Верещагинской Байкальской конференции, Иркутск, 2005; молодежной конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии", Москва, 2005, 2006; международном симпозиуме "Speciation in Ancient Lakes", SIAL IV, Berlin, 2006.
Публикации. По материалам опубликовано 22 научных работы, из них З в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы (164 источника, 65 из них зарубежных) и приложения. Диссертация содержит 34 рисунка, 12 таблиц, 3 приложения.
Характеристика озера Байкал
Байкал - древнейшее пресноводное озеро, характеризующееся уникальными экологическими условиями. Площадь территории водостока для Байкала составляет 570 тыс. км , длина береговой линии 2000 км, площадь водного зеркала 31500 км . Средняя глубина 1637 м, наибольшая ширина 79,5 км, длина 636 км (Кожов, 1962). Байкальская вода отличается самыми высокими питьевыми качествами, в том числе по насыщенности кислородом, низким содержанием минеральных и органических веществ (Вотинцев и др., 1975; Falkner et al., 1991). Прозрачность воды Байкала достигает 40 м. Глубинная вода Байкала может быть использована в качестве референтной для интеркалибрации гидрохимических лабораторий, поскольку обладает постоянством содержания главных ионов в пространстве и времени во всех трех котловинах (Falkner et al., 1991; Грачев и др., 2004). Содержание биогенных элементов, органического вещества и компонентов газового состава имеет выраженную стратификацию и сезонные изменения (Грачев, 2002).
Байкал обладает уникальной флорой и фауной, до 60% которых являются эндемиками. Функционирование сообществ организмов Байкала обеспечивает в комплексе с другими факторами высокие качества и чистоту вод озера. Одним из существенных компонентов биоты озера являются микроорганизмы. Они играют ведущую роль в формировании химического состава воды и донных отложений, а также в процессах самоочищения (Атлас Байкала, 1993; Атлас и определитель пелагионтов, 1995).
Большая масса воды и большие глубины озера позволяют формирующимся в нем осадкам наиболее четко реагировать на глобальные изменения климата, отмечая его изменения на огромных территориях Центральной Азии - от зоны развития северных и высокогорных ледников до пустынных территорий Центральной Азии. Это определяет уникальность
Байкальского осадочного разреза. Практически только здесь, в единственном месте Северного полушария можно получить долговременный непрерывный континентальный разрез. Необходимо отметить, что в отличие от океанов и ряда хорошо исследованных озер в Байкале нет карбонатных осадков, которые широко используются при расшифровки палеоклиматов. Это препятствие было преодолено выбором других маркеров изменения климата (Безрукова и др., 1991; Гольдберг и др., 2005; Чебыкин и др., 2004). В качестве палеоклиматических индикаторов используются пыльца (Безрукова и др., 1991), глинистые минералы (Кузьмин и др., 2001), геохимические (Пампура и др., 1996; Гавшин и др., 1998) и другие параметры, демонстрирующие периодические изменения окружающей среды (Williams et al., 1997). Наиболее чутким индикатором региональных климатических колебаний, связанных с изменениями режима солнечной инсоляции, является содержание в донных осадках Байкала кремнистых скелетов диатомовых водорослей (Грачев и др., 1997) и соответственно содержание биогенного кремнезема (Williams et al., 1997).
Благодаря данным многоканального сейсмического профилирования (Хатчинсон и др., 1989) в озере выделено четыре депоцентра с мощностью осадков, достигающей примерно 7 км в Южном бассейне; 7,5 км в Селенгинском и Центральном бассейнах и 4,4 км - Северный бассейн. Различия в мощности осадков и характере осадконакопления свидетельствуют, что Северный бассейн развивался отдельно и может быть моложе других бассейнов.
Обнаружено, что морские осадки на глубине 90 м содержат жизнеспособные клетки прокариотов и обладают метаболической активностью (Schippers et al., 2005). Исследования глубинных пресноводных осадков также позволили выявить активные бактериальные клетки на глубине 3 м от поверхности осадка, что датируется примерно 7 тыс. лет назад. Численность бактерий в поверхностных осадках (10 клеток на грамм влажного осадка) была выше, чем на глубине 6 м от поверхности осадка (10 клеток на грамм влажного осадка). Этот глубинный слой имел возраст примерно 10 тыс. лет. ПЦР анализ выявил наличие эубактериальных и архейных последовательностей характерных для глубоководных осадков Тихого океана, а также присутствие метаногенных архей. Таким образом, показано что бактерии и археи способны к длительному выживанию в глубинных древних пресноводных осадках (Miskin et al., 1998). При исследовании керна глубоководного бурения BDP-93 методом эпифлуоресцентной микроскопии показана высокая численность (около 0,2 млрд кл) бактерий на глубине осадка 11 м (Беликов и др., 1994). При этом выявлен слой с высокой фосфатазной активностью (20-50 м). Проведенные микробиологические исследования керна глубоководного бурения BDP-97 показали наличие жизнеспособных клеток на глубине 167 м, их численность составила 3,5x10" КОЕ/г (Репин и др., 2001).
Объекты исследования и методы отбора проб
Пробы донных осадков со станции Посольская банка были отобраны в ходе летний экспедиции 2002 года на НИС "Верещагин" с помощью большой гравитационной трубы (5 метров).
Отбор проб осуществлялся на пологом северо-западном склоне Посольской банки на глубине 200 м, на значительном удалении от ее вершины. Отбор керна осуществлялся таким образом, чтобы не захватить склоновую поверхность, где выявляются оползневые тела. Стабильность осадконакопления была подтверждена сейсмоакустическими исследованиями (Hutchinson et al., 1992; Коллектив участников бурения, 2004). Длина отобранного керна составила 360 см. Для контроля целостности слоев проводился литологический и диатомовый анализы с шагом 1-2 см. Керн после поднятия вскрывали за максимально короткий промежуток времени. Из одной его половины внутренняя часть помещалась в стерильные пакеты и затем в жидкий азот до момента проведения молекулярно-биологических работ в лабораторных условиях.
Пробы донных осадков озера Байкал, содержащие нити бактерии рода Thioploca, были отобраны в конце августа - начале сентября 2003 г., в июне 2005 и июле 2006 гг. с использованием различных пробоотборников (дночерпатель «Океан», бентосная трубка) во время экспедиции на НИС «Верещагин». Нити Thioploca легко определялись визуально, они имели общий чехол и образовывали большие скопления в поверхностных слоях осадков. Отдельные нити достигали длины 2 см.
Бесцветные серные бактерии этого рода обнаружены в глубоководной (гл. 403 м) и прибрежной частях (гл. 125 м) бухты Фролиха, а также в дельте реки Селенга, Баргузинском заливе, районе нефтепроявлений мыс Толстый и мыс Горевой Утес, в Малом Море (губа Семисосенная) (рис. 1). Образцы бактерии рода Thioploca из этих районов фиксировали глутаральдегидом. В лаборатории проводили измерение морфологических параметров с использованием эпифлюоресцентного микроскопа «Olympus» при различных увеличениях. Анализировали следующие морфологические характеристики: диаметр общего чехла, диаметр пучка трихомов, диаметр трихома, длина клетки, а также размерную и видовую структуру сообществ. Из отмытых нитей выделяли суммарную бактериальную ДНК (Teske et al., 1995).
Сравнение стратегий методов выделения суммарной бактериальной ДНК из донных осадков озера Байкал
Многочисленные исследования показали, что подавляющее большинство бактерий не может быть выделено и культивировано на питательных средах с использованием только классических методов культивирования.
В настоящее время большое внимание уделяется изучению биоразнообразия бактерий, обитающих в донных осадках различных районов озера. Филогенетический анализ популяции байкальских бактерий проводился с помощью методов молекулярной биологии:
1. отбор проб и выделение ДНК бактерий
2. амплификация фрагмента ДНК, соответствующего гену 16S рРНК
3. клонирование амплифицированного материала
4. секвенирование фрагмента гена 16S рРНК
5. анализ полученных последовательностей путем сравнения с последовательностями банка EMBL.
Существует две стратегии экстракции бактериальной ДНК из почв и осадочных пород. Первая основана на прямом лизисе бактериальных клеток без их отделения от частиц породы (Ogram et al., 1987), вторая предполагает предварительное отделение бактерий от частиц породы и последующее проведение лизиса (Holben et al., 1988). В методе прямого лизиса каждая стадия выделения и очистки ДНК зависит от типа породы и качественного ее состава. Выделенная таким образом ДНК более полно отражает состав микробного сообщества (Roose-Amsaleg et al., 2001). При второй стратегии, как правило, не происходит полного отделения бактериальных клеток от породы и поэтому исследуется лишь небольшая часть природного сообщества.
При попытке выделить суммарную бактериальную ДНК из осадков озера Байкал методом, используемым при выделении ДНК из чистых культур, мы столкнулись с рядом трудностей. Выделенная ДНК имела темно-коричневую окраску и не давала ампликонов в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Поэтому для получения пригодной для амплификации ДНК мы попытались подобрать наиболее эффективный метод ее экстракции из донных осадков озера Байкал.
Предпочтение методу отдается исходя из его оценки по следующим критериям:
1. выход ДНК;
2. чистота ДНК (должна протекать ПЦР);
3. количество выделенной ДНК должно как можно более широко отображать таксономический набор.
Процедуры выделения ДНК представлены на рис. 6, за основу взяты методики, описанные (Ogram et al., 1987; Holben et al., 1988; Rochelle, 1992).
