Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литературы CLASS 5
1.1. Характеристика щелочных гидротерм 5
1.2. Микробные сообщества щелочных гидротерм 7
1.3. Метан в водоемах 10
1.3.1. Изотопный состав углерода метана различного происхождения
1.4. Метилотрофное сообщество 14
1.4.1. Интенсивность окисления метана в водоемах 14
1.4.2. Особенности биологии метанотрофных бактерий 17
1.4.3. Систематика метанотрофных бактерий 25
1.4.4. Экология метанотрофных бактерий 28
1.4.5. Особенности биологии аэробных метилобактерий 31
1.4.6. Экология аэробных метилобактерий 32
1.5. Молекулярно-биологические методы исследования метанотрофов
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 40
2.1. Объекты исследования 40
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Определение физико-химических параметров среды обитания
2.2.2. Определение концентрации метана в воде 43
2.2.3. Методы учета численности микроорганизмов 43
2.2.4. Определение потенциальной скорости потребления метана 46
2.2.5. Выделение накопительных культур метанотрофов 46
2.2.6. Выделение накопительных и чистых культур метилобактерий
2.2.7. Изучение физиолого-биохимических свойств культур 48
2.2.8. Молекулярно-генетические методы 49
2.2.9. Статистические методы 51
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 52
3.1. Характеристика исследуемых гидротерм 52
3.2. Численность микроорганизмов в грунтах исследуемых гидротерм
3.3. Потенциальная скорость потребления метана 65
3.4. Культивируемые метанотрофные сообщества грунтов гидротерм
3.5. Культивируемые сообщества метилобактерий грунтов гидротерм
Заключение 89
Выводы 92
Список использованной литературы 93
- Особенности биологии метанотрофных бактерий
- Методы учета численности микроорганизмов
- Молекулярно-генетические методы
- Потенциальная скорость потребления метана
Введение к работе
Актуальность темы. Метанотрофы и метилобактерии — физиологически и биохимически специализированные подгруппы аэробных прокариот, использующих Сгсубстраты в качестве источников углерода и энергии. Метанотрофы и метилобактерии образуют биофильтр, препятствующий поступлению Сі-соединений в окружающую среду (Гальченко, 2001). В последние полвека весьма основательно исследованы процессы метанокисления и состав метилотрофных сообществ пресноводных, почвенных и морских экосистем (Hanson, Hanson, 1996; Doronina et al., 2000; Гальченко, 2001; Кравченко и др., 2005; Пименов и др., 2006). Менее изучены метанотрофы и метилобактерии биотопов с высокими значениями температуры (Троценко, Хмеленина, 2002).
Термальные источники являются экстремальными экосистемами, микробные сообщества которых представляют значительный интерес, как для фундаментальных исследований, так и для практического применения (Brock et al., 1971). Ранее из гидротерм Венгрии и Японии были выделены термофильные метанотрофы и изучены их свойства (Bodrossy et al., 1995, 1997, 1999; Tsubota et al., 2005). В гидотермах Байкальской рифтовой зоны активность и состав метанотрофного сообщества были исследованы эпизодически (Цыренжапова и др., 2007). Разнообразие и биология метилобактерии в гидротермальных экосистемах до сих пор не изучались. В связи с этим актуален анализ состава и активности метилотрофного сообщества гидротерм восточного побережья озера Байкал.
Цель и задачи исследования. Цель работы - исследование разнообразия и активности аэробных метанотрофов и метилобактерии в гидротермах восточного побережья озера Байкал. Для достижения этой цели были поставлены и решались следующие задачи:
Охарактеризовать условия среды обитания микроорганизмов;
Определить общую численность бактерий в грунтах гидротерм;
Определить скорости потребления метана в грунтах гидротерм;
Изучить разнообразие метилотрофных сообществ исследуемых гидротерм;
Выделить чистые культуры метилобактерий и определить их филогенетическое положение.
Научная новизна. Впервые в гидротермах Бурятии исследовано разнообразие и активность аэробных метилотрофных сообществ. На основе сравнительного анализа генартоА, методом денатурирующего гель-градиент электрофореза, а также методом флуоресцентной in situ гибридизации установлено, что культивируемое метилотрофное сообщество представлено преимущественно метанотрофами II типа, среди которых преобладают представители рода Methylocystis и Methylosinus. Кроме того, выделены и таксономически охарактеризованы чистые культуры метилобактерий. Установлено, что метилобактерий изученных гидротерм относятся в основном к алкалофильным и нейтрофильным мезофилам рода Bacillus.
Практическая значимость. Полученные данные расширяют наши знания о таксономическом составе метилотрофных сообществ термальных экосистем и создают основу для сравнительных исследований микробных сообществ. Способность выделенных метилобактерий использовать широкий спектр органических соединений может найти применение в биологических способах очистки вод. Результаты данной работы могут быть использованы для оценки экологического состояния гидротерм, а также в учебном процессе при изучении микробиологии и экологии водоемов.
\
Особенности биологии метанотрофных бактерий
Облигатные метанотрофные бактерии (метанотрофы) составляют физиологически и таксономически обособленную группу бактерий, способных использовать метан и метанол в качестве источника углерода и энергии. Метан - наиболее распространенный на Земле органический газ, поэтому метанокисляющие бактерии повсеместно встречаются в природе и обладают различными структурными, физиолого-биохимическими и генетическими особенностями, позволяющими использовать этот субстрат (Романовская и др., 1991; Hanson and Hanson, 1996; Гальченко, 2001). Идентификация метанотрофов на основе фенотипических свойств часто затруднена ввиду изменчивости в размерах, форме, пигментации клеток и колоний (Романовская с соавт., 1991; Малашенко с соавт., 1993). Для большинства штаммов характерен полиморфизм клеток, при этом варьирует не только их форма, но и размеры. Некоторые метанотрофные бактерии II типа способны формировать упорядоченные конгломераты - «розетки» благодаря осмофильным фибриллам. Чаще всего скопления клеток образуются в конце экспоненциальной - начале стационарной фаз роста культур (Гальченко с соавт., 1986; Малашенко и др., 1978, 1993). Экзополисахариды, синтезируемые метанотрофами, представляют собой кислые гетерополисахариды, устойчивые к биологическому разложению и нагреванию (Гринберг и др., 1985). Для большинства метанотрофных бактерий характерно наличие внутриклеточных включений (полисахаридов, полигидроксибутирата и полифосфатов), синтез которых, как и синтез экзополисахаридов, зависит от условий культивирования и фазы роста. Размножение клеток обьино происходит путем бинарного деления, однако имеются и почкующиеся формы {Methylosinus trichosporium). Подвижность метанотрофных бактерий обеспечивается наличием полярного жгутика {Methylomonas, Methylobacter, Methylomicrobium) или пучка жгутиков {Methylosinus). Однако этот признак проявляется преимущественно в экспоненциальной фазе роста. Покоящиеся формы клеток у метанотрофов различны: экзоспоры (Methylosinus), липидные цисты (Methylocystis), зрелые (Methylobacter) и незрелые (Methylococcus, и Methylomonas) цисты типа Azotobacter . Экзоспоры, липидные и зрелые цисты устойчивы к нагреванию и высушиванию. Незрелые цисты незначительно отличаются от вегетативных клеток и чувствительны к нагреванию и высушиванию (Гальченко и с соавт., 1986). Для покоящихся форм метанотрофов характерно отсутствие развитых систем ВЦМ, наличие толстой (иногда многослойной) стенки и, нередко, мощной капсулы. Специализация метаболизма на использование СКЦ — предельно восстановленного газообразного субстрата, нашла свое отражение в ультраструктурной организации клеток, обладающих развитыми внутрицитоплазматическими мембранами (ВЦМ), основная функция которых - монооксигенирование СЬЦ и синтез необходимой для этого процесса энергии, образующейся на последующих этапах - при окислении метанола, формальдегида и формиата. ВЦМ, очевидно, обеспечивают пространственную неразрывность этих двух процессов - получения метаболической энергии и ее использования в окислении химически достаточно инертной молекулы метана (Chetina et al., 1986). Для большинства метанотрофов известны два типа ВЦМ (Whittenbury et al., 1975), коррелирующих с рибулозомонофосфатным (I тип) или сериновым (II тип) путями Срассимиляции. Как правило, ВЦМ I типа представляют собой стопки уплощенных везикул, заполняющих большую часть содержимого клетки. Для II типа характерно периферическое расположение ВЦМ параллельное клеточной стенке, но иногда спаренные мембранные пластинки проходят через всю клетку. Причины такой структурно-функциональной корреляции, возможно, связаны с различной эффективностью энергетических процессов, происходящих на мембранах I и II типов и разной энергоемкостью РМФ и серинового путей. ВЦМ формируются путем инвагинации цитоплазматической мембраны или перераспределением структурных элементов при делении клеток (Boer, Hazeu, 1972; Тюрин, Гальченко, 1976; Сузина, Фихте, 1986). У открытых относительно недавно ацидофильных метанотрофов обнаружена необычная организация ВЦМ. Бактерии рода Methylocella характеризуются отсутствием аппарата ВЦМ? обычного для остальных метанотрофов. Клетки обладают широким периплазматическим пространством и системой шаровидных везикул, формирующихся путем инвагинации ЦМ. У бактерий рода Methylocapsa выявлен тип организации ВЦМ, отличающийся от I и II типа. Мембраны собраны в пакеты, что характерно для метанотрофов I типа, однако расположены они по периферии клеточной стенки, как у метанотрофов II типа. Такой тип упаковки мембран был классифицирован как новый, III тип организации ВЦМ у метанотрофов (Dedysh et al., 2000,2002; Dunfield et al., 2003; Дедыш, 2005). Клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана метанотрофов имеют типичное для грамотрицательных бактерий строение. Различия в организации клеточных стенок коррелируют с типом организации ВЦМ и, в случае метанотрофов I морфотипа, клеточная стенка может иметь более сложное (5-7 слоев) строение (Четина с соавт., 1982; Сузина, Фихте, 1986). Поверхностные образования метанотрофов отличаются большим видовым разнообразием и различной степенью сложности их организации. Поверхностные образования у метанотрофов II типа в основном представлены капсулами, состоящими из микрофибрилл различной длины и плотности упаковки. Капсулы вегетативных клеток метанотрофов представлены различными структурами: макрокапсулами (фибриллы) и микрокапсулами. По морфологии различают несколько типов: зубчатые, ровные, мозаичные и исчезающе тонкие (Гальченко с соавт., 1986). У Methylocystis echinoides описаны необычные по своей организации трубчатые структуры, неупорядоченно расположенные по всей поверхности клеток. Трубочки отличаются устойчивостью к физическим и химическим воздействиям и прочно связаны с клеточной стенкой, но не с цитоплазмой. Их структура имеет выраженную спиральную симметрию (Гальченко с соавт., 1977; Сузина, Фихте, 1986). Функциональная роль этих трубочек не выяснена, но показано, что с ними связана перекись-разлагающая активность (Сузина, Фихте, 1986). Доминирующим убихиноном у бактерий родов Methylobacter, Methylomicrobhim, Methylosinus и Methylocystis является Q-8 (Bowman et al., 1993; 1995). У большинства представителей родов Methylomonas и Methylococcus обнаружен метиленубихинон Q-8 (Tamaoka et al., 1985; Bowman et al., 1993). У M. rubra функцию убихинонов выполняет метилендиметилубихинон Q-6 (Collins et al., 1986). Жирнокислотный состав клеток. Метанотрофы обладают уникальным жирнокислотным составом, который позволяет, до некоторой степени, идентифицировать их в природных образцах. Состав жирных кислот коррелирует с разделением метанотрофов на группы: для I и X типов характерно преимущественное содержание Сіб-жирньїх кислот, для II типа Cis (Андреев и Гальченко, 1978; Гальченко и др., 1986; Guckert et al.,1991; Bowman et al., 1991). Наличие изомеров 16:1ю8 и 18:1со8 является уникальной особенностью метанотрофных бактерий, поскольку обычно у грамотрицательных бактерий в заметных количествах присутствует изомер 16:0. Метанотрофы принадлежат к группе облигатных аэробов, хотя многие являются микроаэрофилами. Для них характерно также высокое сродство к кислороду и хороший рост при концентрации С 2 от 0.45 до 20% v/v (Joergenson 1985; Green, Dalton, 1986; Ren et al., 1997). При содержании кислорода выше 63% окисление метана ингибируется, а при концентрации 02 ниже 0.01% - лимитируется, однако метанотрофные бактерии способны окислять СЕЦдажев присутствии незначительных примесей СЬ. По отношению к метанолу метанотрофы разделяют на три группы: в первую входят большинство метанотрофов, слабо растущих при концентрации метанола в среде не выше 0.01%. Метанотрофы второй группы растут при начальном содержании метанола в среде до 0.5%; третья группа включает штаммы, способные развиваться в среде с 3% метанола. Причины чуствительности или, напротив, устойчивости различных штаммов к метанолу, неизвестны. После культивирования на метаноле метанотрофы сохраняют способность использовать метан. Однако рост на метане у ряда штаммов начинался после значительной задержки, возможно связанной с восстановлением редуцированных при культивировании на метаноле BUM (Четина и др., 1982). В качестве источников азота большинство исследованных метанотрофов используют нитраты, нитриты и аммоний; некоторые — мочевину, аминокислоты и дрожжевой экстракт. Представители родов Methylomonas, Methylococcus, Methylosinus и Methylocystis способны фиксировать атмосферный азот (Романовская и др., 1991; Bowman et al., 1993). В целом, рассмотренные фенотипические особенности метанотрофов имеют биохимическую основу, которая может быть расшифрована молекулярно-биологическими соответствующими исследованиями.
Методы учета численности микроорганизмов
Для определения общей численности микроорганизмов в отложениях готовили исходную болтушку грунта следующим образом: в колбу со стерильной (предварительно профильтрованной через мембранный фильтр) водопроводной водой (100 мл) вносили навеску грунта (1 г). Суспензию гомогенизировали на установке УЗДН 2 мин при частоте 22 кГц для отделения адсорбированных на частицах ила бактерий. Отстаивали суспензию 1 сутки.
Содержание метана в воде было определено сотрудником Института общей и экспериментальной биологии СО РАН к.б.н. СП. Бурюхаевым. Суспензию фильтровали на фильтровальной установке через мембранные фильтры («Millipore», диаметр пор - 0,22 мкм, диаметр фильтрующей площади — 19мм). На фильтр помещали 3-5 мл суспензии. Фильтры окрашивали 5% эритрозином.
Фильтры просматривали на микроскопе Axiostar Plus («ZEISS», Германия) при увеличении 1,25х 10х 100 в 20 полях зрения по диагонали. Площадь поля зрения — 3,14 х 104 мкм2. Подсчет общей численности производили по известной методике (Романенко, Кузнецов, 1974). Учет численности жизнеспособных клеток микроорганизмов осуществляли методом 10-кратных разведений на элективных средах (Романенко, Кузнецов, 1974; Кузнецов, Дубинина, 1989). Инкубация производилась при 30С в течение 5-30 суток. Численность сапрофитов определяли подсчетом колоний, выросших в чашках Петри при глубинном посеве проб на среду РПА:10 (рыбо -пептонный агар, разведенный в 10 раз). Учет численности целлюлозоразлагающих бактерий вели на модифицированной среде Пфеннига (Кузнецов, Дубинина, 1989) следующего состава (г/л дистиллированной воды): КН2Р04 - 0,33 NH4CI - 0,33 СаС12 - 0,33 MgCl2 - 0,33 дрожжевой экстракт -0,15 Раствор микроэлементов по Липперту (Pfenning, Lippert, 1966) - 1,0 мл. В качестве субстрата для целлюлозоразлагающих бактерий использовали стерильную полоску фильтровальной бумаги, по разложению которой судили о наличии роста бактерий. Культивирование проводили в пробирках, заполненных средой доверху и закрытых резиновыми пробками. Численность сульфатредуцирующих бактерий определяли на жидкой среде Видделя (Кузнецов, Дубинина, 1989) следующего состава (г/л дистиллированной воды): КН2Р04 - 0,2 MgCl2-6H20 -ОД NH4CI - 0,5 КС1 -0,2 Na2S04 -3,0 Na2S-9H20 -0,05 ацетат натрия -2,0 дрожжевой экстракт - 0,01 Раствор микроэлементов по Липперту (Pfenning, Lippert, 1966) - 1,0 мл. Культуральную среду наливали в пробирки с металлическими скрепками и добавляли FeS04 до конечной концентрации 5%. О росте сульфатредукторов судили по образованию черного налета сульфида железа, свидетельствующего о наличии в среде восстановленной серы. Численность метанотрофов определяли методом десятикратных разведений, высевая пробы грунтов в аэробную жидкую среду «П» (Гальченко, 2001), разбавленную в два раза («0.5П»), следующего состава Растворы фосфатов стерилизовали отдельно и вносили непосредственно перед засевом. Инкубировали с радиоактивно меченым метаном в течение 6-10 дней. О наличии и активности метанотрофов судили по потреблению CHj. Потенциальную скорость потребления метана в грунтах определяли радиоизотопным методом. В стерильные флаконы (V = 12 мл) вносили по 1 см3 грунтов, заливали 2 мл среды «0.5П» и вносили 14СН4 (0.5-2.0 мкКи, В/О "Изотоп"). Флаконы инкубировали при температуре, близкой к температуре in situ, в стационарных условиях 10 суток. Процесс останавливали добавлением 0.5 мл 10% NaOH. Пробы объемом 200 мкл наносили в двух-повторностях на стекловолокнистую бумагу Whatman GF/F (1.5x1.5 см) и высушивали. Затем первую серию фильтров отмывали 200 мкл воды для удаления адсорбированного 14СН4, вторую серию отмывали 200 мкл 6 N НС1 для удаления 14С02. После высушивания фильтры помещали во флаконы со сцинтилляционной жидкостью и просчитывали радиоактивность на счцинтиляционном счетчике Intertechnique (Франция). Метанотрофные бактерии выращивали на минеральной среде «0.5 П». Культуры выращивали в колбах объемом 0.75 л, заполненных 100 мл среды, при температуре 29, 37 и 45С. Колбы закрывали резиновыми пробками, в сквозные отверстия которых были вставлены две стеклянные трубки с ватными фильтрами (Малашенко и др., 1978), заполняли смесью метан воздух (1:1) и встряхивали на роторной качалке (140 об/мин) при соответствующей температуре. Монокультуры выделяли методом истощающего посева на агаризованной среде «0.5П». Чистоту культур контролировали с помощью световой микроскопии.
Молекулярно-генетические методы
Клетки в экспоненциальной фазе роста осаждали центрифугированием при 4500 g 25 мин, дважды отмывали ТЕ-буфером (10 мМ Трис НС1, рН 8.0 и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 8.0) и ресуспендировали в 5 мл этого же раствора. Добавляли лизоцим (1 мг/мл суспензии), перемешивали и инкубировали 1 ч при 37С. Затем добавляли 250 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия и инкубировали 1 ч при 37С. Проводили 3 цикла замораживания при -70С и оттаивания при 65С по 30 мин. Добавляли 100 мкл протеиназы "К" (20 мг/мл) и инкубировали 30 мин при 37С. Для связывания полисахаридов добавляли 5М NaCl до конечной концентрации 1М и 10% цетилтриметиламмонийбромид в 0.7 MNaCl до 1%. Инкубировали 20 мин при 65С. Затем раствор ДНК очищали обработкой смесью фенола (0.5 объема), хлороформа (0.25 объема) и изоамилового спирта (24:1) (0.25 объема). Полученную суспензию перемешивали и центрифугировали при комнатной температуре (5000 g, 15 мин) для разделения фаз. Верхний слой переносили в новую пробирку и экстрагировали ДНК равным объемом смеси хлороформ:изоамиловый спирт до исчезновения белкового слоя на границе раздела фаз. ДНК осаждали изопропанолом (0.75 объема) 30 мин при комнатной температуре. Центрифугировали 10 мин при 14500 g. Осадок ДНК промывали последовательно 70%, 80%, 96%-ными растворами этанола и подсушивали на воздухе. ДНК растворяли в 1 мл ТЕ-буфера. ДНК осаждали из раствора, промывали этанолом, как описано выше, и ресуспендировали в 500 мкл ТЕ-буфера. Растворы ДНК хранили при -20С.
ПЦР-амплификация. В работе были использованы праймеры на ген 16s рРНК и функциональный ген мембрансвязанной метаномонооксигеназы (ртоА). ПЦР-амплификацию проводили на ДНК термоциклере Hybaid (Англия) в режиме: 1 цикл - 95С, 2 мин; 25 циклов - 94С, 40 с; 56С (ртоА) и 60С (16s рРНК), 40 с; 72С, 40 с; последний цикл- 72С, 4 мин. Реакционная смесь (30 мкл) содержала: 10 мМ трис-НС1 буфер; 1 мг/мл БСА; 2,5 мМ MgCb; 5 пМ соответствующих праймеров; 0,2 мкМ каждого , дНТФ; IE Taq-ДНК полимеразы; 0,5-2 мкл образца ДНК. Продукты реакции разделяли электрофоретически в 1% агарозном геле и детектировали в УФ по окрашиванию этидий бромидом (5 мкг/мл).
Денатурирующий градиентный гель-электрофорез. ПЦР-продукты, содержащие функциональный ген ртоА, амплифицировали с праймером A189f, имеющим Щ-довесок. Полученные ПЦР-продукты были разделены в полиакриламидном геле с градиентом 35-80%. Градиентный гель-электрофорез проводили при 200 В в течение 5 ч на приборе Dcode, Bio-Rad (США). Отдельные полосы вырезали и элюировали. С элюированным продуктом был проведен повторный ПЦР анализ.
Нуклеотидные последовательности ПЦР-продуктов определяли на автоматическом секвенаторе CEQ 2000XL Beckman Coulter (США) с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Perkin Elmer», США), согласно инструкциям фирмы-производителя. Филогенетический анализ. Транслированные аминокислотные последовательности участка гена ртоА (460 п.н.) сравнивали с последовательностями из GenBank, используя программы NCBI BLAST (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast). Для выравнивания транслированных аминокислотных последовательностей участков генов ртоА и 16s рРНК использовали программу Clustal W (версия 1.6). Филогенетическое дерево было построено с использованием программы Treecon W (версия 1.3).
Гибридизация накопительных культур флуоресцентно-меченными олигонуклеотидными зондами (FISH). Для анализа накопительные культуры фиксировали с использованием 4% раствора формальдегида в фосфатном буфере (г/л): NaCl - 8.0, КС1 - 0.2, Na2HP04- 1.44, NaH2P04- 0.2, рН 7.0. Фиксированные образцы смешивали с 96%-ным этанолом в соотношении 1:1 (по объему) и хранили при -20С. Гибридизацию образцов с олигонуклеотидными зондами и учет целевых клеток микроорганизмов проводили согласно ранее описанной методике (Панкратов Т.А., Белова С.Э., 2005). Для учета клеток метанотрофов I типа использовали зонд М-84, а для учета клеток метанотрофов II типа {Methylosinus frichosporium, Methylocystis, Methylocapsa, Methylocelld) использовали следующие зонды: Msint-1268, Mcyst-1432, Mcaps-1032, Mcell-1026, соответственно. Синтез этих зондов, меченных флуоресцентным красителем СуЗ, выполнен компанией «Синтол» (Москва, Россия).
Статистическая обработка данных произведена с помощью программы Microsoft Excel 2003. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Характеристика исследуемых гидротерм
Температура воды уменьшалась по течению ручьев гидротерм: в Змеиной - от 45С на изливе до 19С, в Горячинске — от 51 С на изливе до 16С; в Сухой - от 41 С на изливе до 19 С (табл. 3.1.1). Температура воды в гидротерме Змеиной в разные годы не превышала 45С.
Воды гидротерм имеют щелочную реакцию. Значения рН на изливах составляли 9.0-9.4. Во всех гидротермах рН в период с 2006 по 2008 годы изменялся незначительно.
Термальные воды являются слабоминерализованными ( 0.6 г/л). Минимальные концентрации минеральных солей отмечены в гидротерме Змеиная (0.3 г/л). Минерализация в период с 2006 по 2008 год практически не изменялась.
Окислительно-восстановительный потенциал воды на изливах гидротерм характеризовался отрицательными значениями. Во всех исследованных гидротермах в перио с 2006 по 2008 годы вниз по течению ручья значение рН уменьшалось, тогда, как значение Eh увеличивалось. По газовому составу гидротермы Горячинск и Змеиная являются азотными термами, а гидротерма Сухая относится к метановым термам (Борисенко, Замана, 1978; Пиннекер, 1980).
В исследованных гидротермах преобладали гидрокарбонаты, максимальное содержание которых отмечено на выходе источника Сухая -396.2 мг/дм , минимальное- на выходе гидротермы Горячинск - 88.5 мг/дм (табл. 3.1.2). Преобладающее содержание гидрокарбонат-ионов характерно для сульфидных вод (Борисенко, Замана, 1978). Содержание карбонат-иона в источниках Змеиная и Горячинск уменьшалось по течению ручья, а в гидротерме Сухая - увеличивалось.
Потенциальная скорость потребления метана
Аэробные метанотрофы обнаружены нами во всех образцах грунтов, в большинстве из которых численность составляла 103-104 клеток/см3 (табл. 6). Наибольшая численность метанотрофов (10 клеток/см) отмечена в источнике Сухая. Полученные значения численности метанотрофов значительно выше, чем в глубоководных осадках озера Байкал, которые составляют 10-10 клеток/см (Гайнутдинова и др., 2005).
Потенциальная скорость потребления метана в грунтах изученных источников варьировала от 0.6 до 7.7 нмоль СНДсм сут) (табл. 3.3.1).
Наибольшая скорость потребления метана, как и численность метанотрофов, была отмечена в гидротерме Сухая. Потребление метана было одного порядка с интенсивностью процесса в других гидротермах Бурятии(Алла, Кучигер, Сея), но превышало метанокисление в глубоководных донных осадках озера Байкал (Гайнутдинова и др., 2005; Цыренжапова и др., 2007). В гидротермах Камчатки, характеризующихся более высокими значениями температуры (до 92С), интенсивность потребления метана ниже (Цыренжапова и др., 2007).
При включении 14СН4 значительная часть радиоуглерода (от 25 до 86%) переходила в биомассу клеток и внеклеточные метаболиты. В глубоководных донных осадках озера Байкал метан в основном окислялся до С02. В местах дополнительной разгрузки метана и подтока минерализованных вод, где создавались более благоприятные условия для развития метанотрофов, доля радиоуглерода в биомассе и метаболитах увеличивалась (Гайнутдинова и др., 2005). Можно заключить, что обстановка в термальных источниках довольно благоприятна для существования метанотрофов.
Исследовали динамику численности метанотрофов и потребления метана по течению ручьев гидротерм (рис. 3.3.1). На изливах гидротерм Горячинск и Змеиная, где отмечены высокие температуры, наблюдали небольшие значения численности метанотрофов и потребления метана, что, вероятно, лимитируется невысокой концентрацией метана в этих точках, обусловленой низкой растворимостью метана при высоких температурах. Далее, по течению термальных ручьев, с понижением температуры эти показатели увеличивались. изливе гидротермы Змеиная, где наблюдается высокая концентрация сероводорода, метанотрофное сообщество проявляет невысокую активность, а значения общей численности микроорганизмов, напротив, высоки. Численность и активность метанотрофов зависят от концентрации метана (г = 0.9) и сероводорода (г = -0.8), в отличие от общей численности микроорганизмов, которая зависит от концентрации органического вещества в грунтах (г = 0.9). Максимальные значения численности и активности метанотрофов наблюдались в зоне смешения с водами Байкала, где увеличивалась концентрация метана, и сероводород не оказывал ингибирующего действия. В гидротерме Горячинск максимальная численность метанотрофов и интенсивность потребления метана были обнаружены в илах станции G4, богатых органическим веществом, где выявлена повышенная концентрация метана.
Гидротерма Сухая является метановой и характеризуется высокими концентрациями метана, а также сероводорода. Неудивительно, что на изливе гидротермы Сухая отмечены низкая численность бактерий и интенсивность потребления метана, так как рост метанотрофов подавлялся высокими уровнями СН4 и H2S. Максимальное количество метанотрофов и интенсивности потребления метана были обнаружены на станции С4, где образуется заводь с илом, богатым органическим веществом. Концентрация метана (3.2 мл/дм ) оказалась оптимальной для развития метанотрофов и, хотя концентрация сероводорода оставалась довольно высокой, метанотрофное сообщество активно функционировало.
Таким образом, развитие метанотрофных сообществ гидротерм зависит от конкретной экологической обстановки. Выявлено, что на их функционирование существенное влияние оказывают концентрация H2S, температура и, в первую очередь, содержание метана.
