Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Лимнологические характеристики озера Байкал, обусловливающие особенности функционирования водной экосистемы 8
1.2. Развитие микробиологических исследований озера Байкал 9
1.3. Молекулярно-биологические методы в изучении состава и структуры микробных сообществ 13
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Методы 29
2.2. Состав буферов и сред, использованных в работе 40
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 44
3.1. Количественный анализ таксономического состава водного микробного сообщества озера Байкал 45
3.2. Изучение филогенетического разнообразия некультивируемых глубоководных микроорганизмов озера Байкал 53
3.3. Сопоставление результатов идентификации культивируемых гетеротрофных бактерий по морфо-биохимическим тестам и секвенированию гена 16S рРНК 67
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 78
ВЫВОДЫ 81
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 84
ПРИЛОЖЕНИЕ 99
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ - аденозин трифосфат
ДАФИ - 4',6-диамидино-2-фенилиндол
ддНТФ - дидезоксинуклеотид трифосфаты
ДДТ - дитиотрейтол
ДМСО - диметилсульфоксид :
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ - дезоксинуклеотид трифосфаты
ед.акт. - единицы активности !
КОЕ - колониеобразующая единица
п.н. - пара нуклеотидов
ПФА - параф ормальдегид
ПЦР — полимеразная цепная реакция
РИА - рыбо-пептонный агар |
рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота
трис-НС1 - трис-оксиметиламцнометана гидрохлорид
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
K-MES - 2|Тч[-морфолино]этанрульфонат калия
PBS - фосфатный буфер
SDS - додецилсульфат натрия
Taq ДНК-полимераза - термофильная ДНК-полимераза Thermus aquaticus
X-gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-(3-0-галактопиранозид
- Лимнологические характеристики озера Байкал, обусловливающие особенности функционирования водной экосистемы
- Состав буферов и сред, использованных в работе
- Изучение филогенетического разнообразия некультивируемых глубоководных микроорганизмов озера Байкал
Введение к работе
Актуальность проблемы. Байкал — древнейшее из пресноводных озер мира, характеризующееся уникальными экологическими условиями существования водной экосистемы. Главнейшей особенностью химизма вод озера Байкал является их крайне низкая минерализация; суммарная концентрация растворенных солей составляет около 100 мг/л. Своеобразие гидрологических и гидрохимических факторов озера Байкал - большие глубины, длительный ледовый период, низкая температура воды в летний период даже в поверхностных слоях и постоянство в глубинной зоне озера, высокое содержание кислорода по всей толще воды, низкая концентрация органических веществ, - обуславливает специфические условия жизнедеятельности организмов. Бактериальные сообщества составляют важную часть экосистемы водоема. Несомненно, что микроорганизмы, населяющие воды Байкала, определенным образом адаптированы к существованию в такой среде. Идентификация бактерий и изучение особенностей их распространения в зависимости от экологических условий являются одними из ключевых задач в исследованиях состава и структуры микробных сообществ озера. Однако в то время как из других природных экосистем культивируется не более 10-15% от общей численности бактерий, из байкальской воды удается культивировать от 17 до 575 КОЕ/мл при общей численности 0.2 - 4.6* 106 кл/мл, что составляет в среднем 0.5 - 0.8x10"^ %. При этом существенная часть микробного сообщества озера остается неизученной. В данном случае большое значение приобретает использование методов молекулярной биологии, которые позволяют идентифицировать и выявлять отдельные бактериальные клетки непосредственно в природных образцах без культивирования.
Развитие молекулярной биологии как самостоятельной дисциплины, привело к возникновению новых направлений исследования не только
отдельных бактериальных штаммов, но и микробного сообщества в целом. Путь от простого к более сложному прошла молекулярная микробиология в последние 15 - 20 лет. Накоплены обширные данные о различиях между гомологичными генами, лежащие в основе существующего разнообразия. Молекулярная идентификация микроорганизмов привела к возникновению нового понятия - филогенетическая таксономия. В настоящее время создан большой банк данных последовательностей рибосомальных генов, сравнительный анализ которых лежит в основе современной филогенетической классификации микроорганизмов. Этот банк данных включает в себя нуклеотидные последовательности не только культивируемых штаммов, но и последовательности, полученные молекулярными методами из различных природных сообществ. Построение филогенетических деревьев позволяет выявлять близкие и отдаленные группы микроорганизмов, составляющих природные микробные сообщества, восстанавливать возможные филогенетические связи между этими группами и, таким образом, делать заключение о родстве и вносить изменения в существующую классификацию микроорганизмов, проводить ее реконструкцию. Кроме того, в настоящее время проводится поиск наиболее достоверных маркерных белок-кодирующих генов для построения эволюционных взаимоотношений разных групп микроорганизмов. Сравнительно недавно широкое развитие получил такой метод, как гибридизация in situ, позволяющий выявлять отдельные бактериальные клетки непосредственно в природных образцах, и, следовательно, изучать состав природного микробного сообщества без культивирования. В основе этого метода лежат особые свойства рибосомальных генов, такие как, присутствие во всех микроорганизмах, высокая копийность, наличие как высококонсервативных, так и вариабельных фрагментов. Именно благодаря этим характеристикам и наличию большого банка данных их нуклеотидных последовательностей стал возможным расчет и использование групп-специфичных маркеров на
отдельные таксономические группы, рода и виды бактерий. В настоящее время отработаны эффективные методы быстрой детекции многих патогенных и условно патогенных штаммов в медицинской микробиологии, патогенной микрофлоры в пищевых продуктах и питьевой воде. Кроме того, это направление нашло широкое развитие в экологической микробиологии при анализе состава природных микробных сообществ.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - изучить филогенетическое разнообразие и распределение представителей основных таксономических групп в водной толще озера Байкал методами молекулярной биологии. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать эффективные методы выделения суммарной ДНК из природных образцов и из чистых культур микроорганизмов, подобрать оптимальные условия амплификации на консервативных бактериальных праймерах фрагмента гена 16S рРНК, обеспечивающие максимальное представительство последовательностей, имеющихся в природном образце, и определить их нуклеотидные последовательности;
провести количественный анализ распределения представителей основных филогенетических групп микробного сообщества в водной толще озера Байкал;
провести филогенетическую идентификацию полученных последовательностей на основе их сравнения с международным банком данных;
сопоставить результаты идентификации культивируемых микроорганизмов методами классической и молекулярной микробиологии.
6 Научная новизна. Впервые с использованием молекулярных методов доказано, что адаптационной особенностью водного микробного сообщества озера Байкал является наличие большого количества некультивируемых форм бактерий. На основании филогенетической идентификации этих последовательностей показано, что некультивируемые формы бактерий представляют не только покоящиеся стадии известных культивируемых бактерий, но и большое разнообразие не идентифицированных бактерий, которые являются характерными для экосистемы озера.
Практическая значимость. Широко распространенный метод
молекулярно-биологических исследований адаптирован для изучения
микробного сообщества водной толщи озера Байкал с учетом его
экологических особенностей. Отработанный метод может быть применен
для экологического мониторинга экосистемы озера, для быстрой
диагностики состояния микробных сообществ. Полнота информации о
составе микробных популяций имеет огромное практическое значение для
выявления и выделения микроорганизмов, обладающих различными
ферментативными активностями. Применение молекулярно-
биологических методов для изучения филогенетического разнообразия
байкальских микроорганизмов, соотнесение этих результатов с данными
микробиологических исследований позволяет сформировать более полную
картину разнообразия природного сообщества и функционирования
экосистемы в целом, потому что позволяют учитывать не только
культивируемые микроорганизмы. Создан банк данных
последовательностей фрагментов гена 16S рРНК культивируемых и некультивируемых бактерий, 78 из них зарегистрированы в международном EMBL-банке данных и им присвоены следующие номера Х99983-Х99989, AJ222832-AJ222835, AJ222839-AJ222858, AJ289926-AJ289961, AJ289966-AJ289981. Эта информация может быть использована
для конструирования групп- и видоспецифичных праймеров и зондов для быстрого и эффективного анализа состава водного микробного сообщества.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на международных конференциях: Второй и Третьей Верещагинских Байкальских конференциях, проходивших в Иркутске в октябре 1995 г. и августе 2000 г., на научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе», проходившей в Иркутске (март, 2002), на международных конференциях «Biodiversity in Ancient Lakes», проходивших в Японии (сентябрь, 1997) и Иркутске (сентябрь, 2002), на международных симпозиумах в Японии (сентябрь, 1998) и Корее (март, 2000), на VIII международном экологическом конгрессе INTECOL, проходившем в Сеуле, Корея (август, 2002), на I микробиологическом конгрессе европейского микробиологического общества FEMS, проходившем в Любляне, Словения (июнь-июль, 2003) и на международном Байкальском симпозиуме по микробиологии «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ», проходившем в Иркутске (сентябрь, 2003). По материалам диссертации опубликована 21 работа (7 из них в рецензируемых журналах).
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Предлагаемая диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (118 источников, из них 87 - зарубежных) и приложения. Объем работы составляет 109 страниц машинописного текста, включающего 6 таблиц, 15 рисунков и 1 приложение.
s ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Лимнологические характеристики озера Байкал,
обусловливающие особенности функционирования водной экосистемы
Озеро Байкал является самым древним (25 млн. лет), самым глубоким (1637 м) и самым крупным пресноводным водоемом земли. Главнейшей особенностью химизма вод озера Байкал является их крайне низкая минерализация. Суммарная концентрация растворенных солей в ней составляет около 100 мг/л. Байкальские воды также бедны соединениями биогенных элементов и органических веществ. Вода в Байкале относится к слабоминерализованным мягким водам гидрокарбонатного класса, группы кальция первого типа. В среднем на долю гидрокарбонатов кальция и магния приходится 84%, хлоридов и сульфатов - 7% и щелочных металлов - 9% эквивалент ионов. Основной запас вод (около 65%), отличающихся высоким качеством и большим содержанием кислорода, сосредоточен в глубинной зоне ниже 300 м. Деструкция органического вещества и реминерализация органических форм биогенных элементов протекает в основном в верхней зоне выше 300 м, а глубже замедляется из-за опускания лишь трудно разлагаемых форм органического вещества (Вотинцев и др., 1975).
Впадина озера Байкал в морфологическом отношении представляет три самостоятельные котловины: южную с наибольшей отметкой глубины 1430 м, среднюю (1637 м) и северную (920 м). Средний химический состав вод в разных частях байкальской котловины различается незначительно. Время, в течение которого происходит полное замещение вод Байкала, составляет 330 лет (Афанасьев, 1960). Вода на глубинах 300-400 м от поверхности дна имеет самый «старый» возраст и обновляется через 10-12 лет (Грачев, 2002).
Микроорганизмы играют важную роль в процессах, проходящих в водных экосистемах. Обладая большой скоростью размножения и создавая значительную биомассу, они участвуют в процессах самоочищения водоемов, минерализуя органические вещества, и тем самым, обогащая воду биогенными элементами. Озеро Байкал представляет особый интерес, т.к. оно является крупнейшим в мире пресноводным водоемом, видообразование в котором происходило в течение более 20 млн. лет в уникальных экологических условиях - под воздействием постоянных физических и химических параметров. Своеобразие гидрологических и гидрохимических факторов озера Байкал - большие глубины, длительный ледовый период, низкая температура воды в летний период даже в поверхностных слоях и постоянство в глубинной зоне озера, высокое содержание кислорода по всей толще воды, низкая концентрация органических веществ - обуславливает специфические условия жизнедеятельности микроорганизмов. Бактерии определенным образом адаптированы к существованию в такой среде. Культивирование и идентификация микроорганизмов являются одними из ключевых задач в исследованиях состава и структуры микробных сообществ озера. Поэтому филогения и выявление байкальских микроорганизмов in situ вызывает большой интерес исследователей.
1.2. Развитие микробиологических исследований озера Байкал
Микроорганизмы озера Байкал являются наименее исследованной в систематическом отношении группой его обитателей. Изучение видового состава микроорганизмов Байкала необходимо и очень важно для понимания различных процессов, протекающих в озере. Данные по структуре микробного сообщества, вертикальное и горизонтальное распределение микроорганизмов позволяют проводить мониторинговые работы и давать санитарно-микробиологическую оценку качества воды
to (Дрюккер и др., 1993), изучать развитие процессов обмена вод верхних и глубинных слоев озера (Шимараев и др., 2000; Парфенова и др., 2000).
Для исследования таксономического разнообразия микроорганизмов
озера Байкал традиционно используются классические
микробиологические методы, в основе которых лежит культивирование
микроорганизмов на питательных средах. При этом выявляют
морфологические, культуральные, физиолого-биохимические,
серологические признаки исследуемых микроорганизмов, по которым устанавливают их принадлежность к тому или иному таксону. В настоящее время одним из дополнительных, а иногда и ключевым компонентом идентификации микроорганизмов становится секвенирование фрагментов рибосомальных генов. Этот подход является точным и надежным, а в совокупности с биохимическими тестами дает полную характеристику исследуемых штаммов.
Изучению видового состава микроорганизмов озера Байкал была посвящена многолетняя деятельность многих исследователей (Кузнецов, 1951; Романова, 1958; Кожова, Казанцева, 1961; Дрюккер, Штевнева, 1987). Как правило, все работы по определению видового состава байкальской микрофлоры велись классическими микробиологическими методами. Анализ публикаций за последние двадцать лет показал, что в воде и грунтах Байкала обнаружены представители практически всех систематических групп бактерий. Кроме того, были проведены исследования общей численности микроорганизмов, гетеротрофных бактерий, изучали распределение отдельных физиологических групп бактерий в воде и осадках озера (Верхозина, 1985; Парфенова, 1985; Парфенова, Илялетдинов, 1985; Гоман и др., 1986; Лаптева, 1990; Намсараев и др., 1995а, б, в).
Байкальский пикопланктон без сомнения является одним из самых интересных компонентов экосистемы озера и проблематичным для изучения (Белых и др., 1999). Его доля в первичной продукции водоема в
11 летнее время составляет до 80% (Бондаренко, Гусельникова, 1989). Впервые пикопланктонное сообщество Байкала было описано Г.И. Поповской в 1968 году (Поповская, 1968). Ей же был впервые описан один из доминирующих видов - цианобактериальный штамм Synechocystis limnetica Popovsk. Однако пикоцианобактерии (размеры около 2 мкм) до сих пор остаются одной из самых малоизученных и труднокультивируемых групп. Наши современные представления о цианобактериях озера ограничиваются несколькими видами, а их изучение сводится зачастую только к экологическим исследованиям. На основе морфологических исследований выявлены и описаны новые виды автотрофного пикопланктона озера, а именно цианобактерии: Synechocystis sp., который существенно отличается от вида Synechocystis limnetica Popovsk, а также виды рода Synechococcus. Таксономическое положение большинства штаммов сейчас устанавливается методами молекулярной биологии (Belykh et al., 2000).
Большое разнообразие аэробных гетеротрофов отмечали многие исследователи. Это одна из наиболее изученных групп байкальских микроорганизмов, которая представлена большим разнообразием культивируемых штаммов. Среди грам-отрицательных аэробных гетеротрофных микроорганизмов в разное время были выделены и охарактеризованы представители следующих родов: Acinetobacter, Alcaligenes, Achromobacter, Azotobacter, Caulobacter, Chromobacterium, Flavobacterium, Paracoccus, Pseudomonas (Парфенова, Илялетдинов, 1985; Гоман и др., 1986; Лаптева, 1990). Грам-положительные бактерии представлены родами Bacillus, Desulfotomaculum, Desulfovibrio, Micrococcus и Clostridium (Младова, 1971, Намсараев и др., 1995а). Было показано активное участие этих микроорганизмов в процессах круговорота азота и фосфора (Верхозина, 1985; Парфенова, 1985; Парфенова, Илялетдинов, 1985). Особый интерес представляют серо-окисляющие бактерии, обнаруженные в микробиальных матах Северного Байкала
(Намсараев и др., 1994). Они представлены родами Beggialoa, Thiothrix и Thioploca. Высокую ферментативную активность байкальских микроорганизмов отмечали многие исследователи микрофлоры озера. Было показано, что высокий процент тестируемых штаммов обладает различными ферментативными активностями, например фосфатазной, хитиназной, липазной, протеазной, и др. (Иванова и др., 1992; Бакунина и др., 1994). Именно среди гетеротрофных микроорганизмов были выявлены активные штаммы-продуценты эндонуклеаз рестрикции (Дедков и др., 1990). Однако к этой же группе относятся трудно культивируемые бактерии. Так, еще в 1990 году Лаптевой были обнаружены, культивированы и описаны некоторые виды рода Caulobacter (Лаптева, 1990). Однако до сих пор выделение, определение и поддержание в чистой культуре представителей этого рода представляет определенную трудность.
Не менее интересной группой являются байкальские актинобактерии. Список видов, которые были описаны микробиологическими методами, в последнее время существенно дополнился информацией, полученной при анализе некультивируемого сообщества. Ранее были описаны микроорганизмы родов Micrococcus, Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium (Максимова, Колесницкая, 1976; Парфенова, Илялетдинов, 1985). Методами молекулярной микробиологии было показано, что актинобактерии занимают свою экологическую нишу. Наибольшее количество нуклеотидных последовательностей, имеющих максимальную гомологию с актинобактериальными последовательностями, было получено из бактериальной ДНК, выделенной с глубины 400 м.
Среди облигатных анаэробов, не образующих спор, следует отметить метанообразующие бактерии. Эти бактерии по филогенетической систематике (Woese, 1987) относят к архебактериям. В озере Байкал
выделены и определены представители двух родов Methanobacterium и Methanosarcina (Намсараев и др., 19956; Намсараев, Земская, 2000).
Видовой состав микроорганизмов озера Байкал изучен далеко не полностью. Исследования в этой области продолжаются. Но как уже говорилось выше, использование классических микробиологических методов для этих целей недостаточно, т. к. далеко не все микроорганизмы культивируются на питательных средах. В этих случаях находят применение методы молекулярной биологии. Основанные на анализе фрагментов рибосомальных и белок-кодирующих генов они открывают новые возможности для изучения таксономии, филогении и экологии микроорганизмов (Беликов и др., 1996; Семенова, Кузнеделов, 1998).
1.3. Молекулярно-биологические методы в изучении состава и структуры микробных сообществ
Изучение разнообразия, свойств и активности микроорганизмов
является фундаментальным направлением в водной микробиологии.
Однако долгое время исследования ограничивались методологическим
подходом, требующим выделения чистой культуры, и использовании
субъективных критериев в классификации микроорганизмов. Развитие в
последнее десятилетие методов молекулярной эволюции и молекулярной
филогении бактерий дает новые перспективы, новые подходы и новые
инструменты для исследований. Наиболее распространенный среди них -
сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, в частности
рибосомальных генов, позволяет не только идентифицировать
неизвестные штаммы, но и выявить филогенетические взаимоотношения микроорганизмов, Рибосомальные гены имеют ряд преимуществ перед другими нуклеотидными последовательностями в плане их использования для изучения биоразнообразия. Эти гены имеются во всех организмах, они высококопийны и содержат как очень консервативные, так и вариабельные
фрагменты. Высококонсервативные последовательности используются в качестве мишеней при оценке общей численности организмов, а вариабельные могут служить сайтами узнавания для зондов, специфичных к конкретным группам или родам при видовой идентификации микроорганизмов. Таким образом, 16S рибосомальная ДНК стала удобным инструментом для видовой диагностики, а расхождения нуклеотидных последовательностей среди индивидуальных рибосомальных генов определяют очертания естественной классификации бактерий (рис. 1; Woese, 1987).
Первые попытки охарактеризовать микробное сообщество в природных образцах по рибосомальным генам были предприняты чуть больше 15 лет назад. В 1985 году была показана возможность использования рибосомальных генов для идентификации микроорганизмов (Lane et al., 1985) и для изучения микробного сообщества в природных образцах без культивирования (Stahl et al, 1985). Эти исследования были сделаны на основании анализа 5S рибосомальной ДНК. В первой серии экспериментов были определены нуклеотидные последовательности 12 штаммов рода Thiobacillus (Lane et al., 1985). Сравнение их между собой и с имеющими на тот момент последовательностями в банке данных показало, что филогенетический кластер, включающий последовательности тиобацилл, группируется вместе с «пурпурными фотосинтезирующими микроорганизмами» и может быть эволюционно привязан к этой группе. Этой же группой авторов было охарактеризовано некультивируемое сообщество микроорганизмов, обнаруженное в гидротермальных источниках с температурой воды 91 С национального парка Йеллоустоун (Stahl et al., 1985). Было показано, что микробное сообщество представлено микроорганизмами, которые образовали три основных кластера на филогенетическом дереве. Доминирующими были определены серные бактерии, кластеризующиеся с представителями архебактерий. Эубактериальные последовательности
Бета-подгруппа
Гамма-подгруппа
Альфа-подгруппа
Дельта-подгруппа
Высокое содержание Г+Ц пар
Низкое содержание Г+Ц пар
Флавобактерин
Актинобактерии
Планктомицеты
Я S
ю о
н о
а.
;
Рис. 7. Филогенетическое дерево представителей основных групп эубактерий, основанное на последовательностях международного EMBL-банка данных и показывающее их филогенетические отношения.
16 образовали два кластера, отдаленно связанных с родом Thermus. Это были действительно пионерские исследования и носили прогрессивный характер: был предложен принципиально новый подход для изучения микробиальной экологии, - филогенетический анализ рибосомальных генов. Однако информативное содержание 120-нуклеотидного фрагмента гена 5S рРНК оказалось недостаточным для корректного построения филогенетических деревьев и анализа большого разнообразия микроорганизмов. Поэтому в качестве объекта для следующих работ был выбран более протяженный участок гена 16S рРНК. Этот ген содержит около 1500 пар нуклеотидов, и он оказался настолько удобным для молекулярно-биологических исследований, что в настоящее время банк данных последовательностей рибосомальных генов практически ежегодно удваивается и на декабрь 2002 года составил более 166 тыс. последовательностей ().
С самого начала молекулярно-биологических исследований сформировалось два направления сравнительного анализа рибосомальных генов: с одной стороны, проводилась ревизия бактериальных родов, и устанавливались вероятные эволюционные связи (Olsen et ah, 1985; Giovannoni et al., 1988a; Turner et al., 1989; Roraanuik et al., 1987; Anzai et ah, 2000), а с другой стороны, были предложены новые методы анализа природных бактериальных популяций (De Long et al., 1989; Ward et al., 1990; Giovannoni et al., 1990; Amann et al., 1995).
Одним из самых крупных достижений следует отметить выделение на высшем таксономическом уровне в живом мире трех групп организмов: прокариоты, эукариоты и архебактерии (Woese, Fox, 1977). Эти исследования были проведены на основании сравнения частичных последовательностей рибосомальных генов, имеющихся к тому времени в банке данных. Были исследованы филогенетические отношения 450 различных организмов (включая эукариоты и прокариоты). В результате проведенных исследований был получен необычный результат. Было
показано, что одну группу образовали все эукариоты: высшие растения, животные, дрожжи и др. Вторую группу составило подавляющее большинство видов бактерий и цианобактерии. Они получили название истинных бактерий или эубактерии. В эту группу также входят митохондрии и хлоропласты эукариотических клеток. В третью группу вошли некоторые бактерии, живущие в экстремальных условиях обитания: метанобразующие анаэробные бактерии, экстремальные термофилы. Эта группа организмов получила название архебактерий.
Одни из первых молекулярно-микробиологических исследований
были проведены на термоацидофильной архебактерий Sulfolobus
solfataricus, нуклеотидную последовательность 16S рДНК которой
использовали для выяснения эволюционных взаимосвязей с
последовательностями галофильных и метанообразующих архебактерий,
эукариот и эубактерии (01 sen et al., 1985). Авторами было показано, что
нуклеотидная последовательность этой бактерии группируется с
последовательностями других архебактерий. Таким образом, на
конкретном примере была продемонстрирована возможность
использования молекулярного подхода для филогенетической идентификации микроорганизмов. Следующим революционным событием можно считать установление эволюционных связей цианобактерии и хлоропласт зеленых водорослей (Giovannoni et al., 1988а; Turner et al., 1989). В серии работ были представлены филогенетические деревья, указывающие, что различные виды цианобактерии разошлись в эволюционно короткий промежуток времени. Глубина ветвления исследуемых цианобактерии была в основном меньше, чем та, которая отделяла их от основных эубактериальных таксонов.
Возможности филогенетического анализа также включают в себя возможность проведения ревизии как внутри отдельных родов, так и внутри основных бактериальных групп. Попытки проанализировать корректность выделения некоторых бактериальных родов и
принадлежность родов к известным семействам были предприняты практически сразу же, как только был накоплен достаточный фактический материал в виде рибосомальных последовательностей культивируемых штаммов. А в настоящее время трудно назвать бактериальную группу, в которой не проводилось подобной ревизии. Одной из первых работ этого направления можно по праву считать филогенетический анализ рода Campylobacter (Romanuik et al., 1987). Авторами были определены последовательности рибосомальной ДНК типовых штаммов этого рода и проведен их филогенетический анализ. Было показано, что представители этого рода формируют ранее самостоятельную неописанную филогенетическую ветвь, которую можно охарактеризовать как одну из эубактериальных групп на основании раннего ветвления, которое наблюдается и для всех остальных основных групп эубактерий. Вид Campylobacter pylori, являющийся спиралевидной бактерией, вызывающей желудочные заболевания человека, на филогенетическом дереве оказался достаточно удален от других представителей рода Campylobacter, что позволило выделить его из этого рода,
Другой крупный пример реформирования родов - это предложенная в 2000 г., по сути своей, революционная перестройка рода Pseudomonas (Anzai et al., 2000). Фенотшгаческое определение, которое является достаточно субъективным, позволило роду Pseudomonas стать «свалкой» для не до конца охарактеризованных грам-отрицательных аэробных палочек, имеющих полярные жгутики. В настоящее время в этот род включено огромное количество видов. Нуклеотидные последовательности 128 достоверных и недостоверных представителей рода Pseudomonas были проанализированы авторами работы. Эти последовательности сравнивали с последовательностями представителей других родов протеобактерий. Семь подгрупп было выделено в кластере рода Pseudomonas, причем наличие и положение этих кластеров хорошо согласуется с исследованиями рРНК-ДНК гибридизации, проведенными ранее (Palleroni,
1984). Результаты показали, что 57 видов, включая штамм Pseudomonas
aeruginosa достоверно можно отнести к этому роду. Остальные виды
авторы не относят к этому роду ввиду их филогенетической позиции. Они
оказались отнесенными в кластеры, которые расположились в четырех
подгруппах протеобактерий (альфа, бета, гамма и гамма-бета). Род
Pseudomonas по филогенетической классификации относиться к гамма-
подгруппе протеобактерий. В то же время, двадцать четыре
проанализированных штамма, которые не вошли в род Pseudomonas и пока
не перенесены в другие рода, оказались следующими (в скобках указана
подгруппа, в которую попали нуклеотидные последовательнности
исследуемых штаммов по филогенетическому определению): Ps.abikonensi
(альфа-подгруппа, Sphingomonadaceae), Ps.antimicrobica (бета-подгруппа,
Burkholderiaceae), Ps. beijerinckii (гамма-подгруппа, Halomonadaceae),
Ps. beteli (гамма-подгруппа, Xanthomonadaceae), Ps. boreopolis (гамма-
подгруппа, Xanthomonadaceae), Ps. butanovora (бета-подгруппа,
Rhodocyclaceae), Ps.carboxydohydrogena (альфа-подгруппа,
Bradyrhizobiaceae), Ps.cissicola (гамма-подгруппа, Xanthomonadaceae),
Ps.doudoroffii (гамма-подгруппа, Oceanimonas), Ps.echinoids (альфа-
подгруппа, Sphingomonadaceae), Ps. elongate (гамма-подгруппа,
Alteromonadaceae), Ps.flectens (гамма-подгруппа, Enterobacteriaceae),
Ps.geniculata (гамма-подгруппа, Xanthomonadaceae), Ps.huttiensis (бета-
подгруппа, Oxalobacteraceae), Ps. iners (гамма-подгруппа,
Alteromonadaceae), Ps.lanceolata (бета-подгруппа, Comamonadaceae),
Ps.lemoignei (бета-подгруппа, Oxalobacteraceae), Ps.mephitica (бета-
подгруппа, Oxalobacteraceae), Ps.pictorum (гамма-подгруппа,
Xanthomonadaceae), Ps.saccharophila (бета-подгруппа, Comamonadaceae),
Ps.spinosa (бета-подгруппа, Comamonadaceae), Ps.stanier (гамма-
подгруппа, Alteromonadaceae), Ps.syzygii (бета-подгруппа, Ralstoniaceae) и
Ps.woodsii (бета-подгруппа, Burkholderiaceae). Авторы предложили
провести их переклассификацию.
В настоящее время другой группой авторов проводится ревизия семейства Vibrionaceae (Kita-Tsukamoto et al., 1993; Thompson et al., 2003). Сейчас это одно из самых изученных семейств, основные представители которого выделены из водных и почвенных экосистем. Только в последнее время было охарактеризовано 15 новых видов и один новый род Enterovibrio (Thompson et al., 2002). На основе анализа фенотипических и генотипических характеристик известных штаммов авторами предложено выделение трех новых семейств из семейства Vibrionaceae, а именно Enterovibrionaceae, Photobacteriaceae, Salinivibrionaceae (Kita-Tsukamoto et al., 1993; Huang et al., 2000; Thompson et al., 2002).
Кроме того, данный метод нашел широкое применение при анализе природных микробных сообществ, так как позволяет выявить более широкое разнообразие бактерий, включая и некультивируемые пока виды. На рис. 2 представлена схема проведения молекулярно-биологических экспериментов.
Процедура анализа природной микробной популяции включает пять ключевых стадий: выделение суммарной бактериальной ДНК, амплификация, клонирование, секвенирование и сравнительный анализ. В настоящее время практически все стадии этого процесса хорошо отработаны и стали рутинными методами исследований. Однако, следует отметить, что стадии выделения ДНК и амплификацию можно считать ключевыми и именно от их успешного выполнения полностью зависит результат анализа. На этих стадиях следует не только учитывать особенности состава и структуры отдельных бактериальных сообществ, но и предупредить возможное бактериальное загрязнение. Этим проблемам была посвящена серия публикаций, в которых подробно описывались требования к проведению этих работ. Кроме того, оказалось, что режим полимеразной цепной реакции (ПНР) и подбор праймеров также могут существенным образом влиять на результат (von Wintzingerode et al., 1997; Chandler et a., 1997). Оказалось, что при амплификации длинных
Природный образец
Накопительная культура
№ S
а « а. н и
к я
е.
Выделение нуклеиновых кислот
Пол име раз н ая Цепная Реакция
Амшшфицированные продукты гена рибосомальной РНК
Клоны с фрагментами рДНК
Секвенирование
Нуклеотидные последовательности гена рибосомальной РНК
я И X
в"
а ч
S S в!
Q-Я
S К « оа
о о.
и и
4>
р^и
Сравнительный анализ
ч н
«
я ч «
/Ус, 2, Схема проведения молекулярно-биологических исследований природных образцов (по Лтапп et ah, 1995).
фрагментов при режиме, обеспечивающем максимальное представительство бактерий, кроме истинных представителей, получается большое количество (иногда до 30%) химерных молекул (Wang, Wang, 1996). Эти последовательности образуются в результате неспецифической регибридизации не полностью удлиненных на предыдущем цикле амплификации цепей ДНК с «неродной» ДНК и разные участки в таких молекулах принадлежат разным микроорганизмам. Несомненно, что они получаются при амплификации с имеющихся в составе популяции рибосомальных фрагментов, однако при филогенетическом анализе и построении деревьев подобные последовательности нельзя использовать. Вскоре был предложен достоверный способ выявления таких нуклеотидных последовательностей, который возможен уже на стадии сравнительного анализа. И если после открытия полимеразнои цепной реакции через два года появились первые исследования по молекулярному анализу некультивируемых природных микробных сообществ, то на выработку оптимальных условий, уточнение ошибок, возникающих при использовании амплификации суммарной ДНК, и предложение методов устранения этих ошибок, ушли следующие 15 лет.
Однако, результаты молекулярно-биологического анализа
некультивируемых микроорганизмов, выделенных непосредственно из
природных сообществ, превзошли все возможные ожидания. Было
показано наличие большого количества нуклеотидных
последовательностей, которые имели низкий процент гомологии с последовательностями культивируемых штаммов (Ward et al., 1990; Bruce, 1993; Wise et al., 1997; Garcia-Martinez et al., 1999; Gray, Head, 2001). Было показано, что такие новые, ранее некультивируемые группы бактерий характерны, во-первых, для самых разнообразных природных экосистем, как морских, так и пресноводных или почвенных (Ward et al., 1990; Kuske et al., 1997; Borneman, Triplett, 1997). Причем, последовательности некультивируемых микроорганизмов, выделенные, например, из пресных
озер на филогенетическом дереве кластеризуются вместе с последовательностями, полученными аналогичными методами из других пресноводных и иногда почвенных экосистем (Wise et al., 1997). Кроме того, было показано, что такие кластеры некультивируемых бактерий выявляются в различных бактериальных группах (Bahr et al., 1996). Это позволило говорить о том, что это реально существующие группы, выделение которых возможно через накопительную культуру. В этой связи представляют интерес два кластера Nitrospira и Holophaga, которые были выделены сравнительно недавно в отдельные филогенетические группы ввиду их обособленного положения на филогенетическом дереве (Ehrich et al, 1995; Ludwig et al., 1997). Оба кластера представлены в банке данных преимущественно последовательностями некультивируемых видов. Однако проведены успешные попытки получения накопительной культуры бактерий рода Holophaga (Ludwig et al., 1997).
Таким образом, к началу 90-х годов уже появился банк данных рибосомальных последовательностей как культивируемых, так и некультивируемых микроорганизмов, дающий дальнейшее развитие такому направлению исследований, как выявление отдельных бактериальных клеток непосредственно в природном образце, без культивирования с помощью олигонуклеотидных зондов. Зонды - это короткие одноцепочечные нуклеотидные фрагменты, имеющие гомологию либо с высококонсервативными, либо с вариабельными последовательностями рибосомальных генов, несущие флуоресцентную или нефлуоресцентную метку и позволяющие селективно выявлять наличие ДНК определенного состава. Отдельная клетка E.coli содержит от 104 до 105 рибосом (Amann et al, 1990а) и, таким образом, столько же копий рибосомальных ДНК. Следовательно, рДНК является естественной амплифицированной мишенью для гибридизационных зондов, С.Дж. Гиованнони с соавторами впервые продемонстрировали (Giovannoni, 1988b), что благодаря наличию большого количества копий,
индивидуальные клетки могут быть идентифицированы однократно меченным радиоактивным зондом. Позднее флуоресцентно-меченные зонды были использованы для прямой идентификации отдельных клеток. Термин «филогенетический штамм» был выбран для описания единой характеристики этих зондов (Amann et al., 1990b, DeLong et al., 1989). Хотя флуоресцентные антитела тоже применялись для идентификации отдельных клеток в природных образцах, их специфичность в основном ограничена уровнем вида и подвида (Macario et al, 1989, Ward et al, 1990). Кроме того, использование флуоресцентных антител для детекции микроорганизмов in situ требует предварительного выделения организма-мишени. В противоположность этому, потенциальная специфичность меченых зондов, гомологичных рибосомальной РНК, распространяется на весь филогенетический спектр. Более того, зонды, рассчитанные по имеющимся в банке данных последовательностям гена 16S рРНК, могут быть разработаны на те группы микроорганизмов, которые не существуют в чистых культурах, еще не выделены в лабораторных условиях (Olsen et al., 1986).
На рис. 3 изображена схема этого подхода. Первоначально при создании зондов комплементарных консервативным участкам гена 16S рРНК, был предложен набор зондов на крупные таксоны, такие как архебактерии и эубактерии, и филогенетические группы протеобактерии, включая подгруппы альфа, бета и гамма, актинобактерии, планктомицеты, цитофаги и флавобактерин (Giovannoni et al., 1988b; DeLong et al., 1989; Amann et al., 1995). При использовании в качестве мишеней высоко вариабельных последовательностей, конструируются зонды видо-специфические, позволяющие выявить отдельные бактериальные виды. Кроме того, универсальные зонды могут быть использованы для измерения суммарного количества рибосомальной РНК в образце и для оценки различий в содержании клеточных рРНК (Stahl et al, 1988; Amann etal., 1990b).
Этот подход, нашедший огромное применение не только в микробиальной экологии, но и в медицинской и пищевой микробиологии, развивается в последнее время очень активно. В настоящее время предложено быстрое и качественное тестирование молочных и кисломолочных продуктов, питьевой воды на наличие патогенных микроорганизмов (Blackstone et al., 2003; Thoerner et al., 2003). Как одно из практических применений использования наборов из групп- и видо-специфичных зондов стало использование этого подхода для анализа природных и антропогенно-загрязненных экосистем (Snaidr et al, 1997; Perathaier et al., 1998; Gloeckner et al., 1999). Впервые метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с групп-специфичными зондами был предложен именно для описания структуры и состава природных экосистем. Однако вскоре было отмечено, что для большинства природных сообществ суммарный процент бактериальных групп, детектируемых зондами на известные высококонсервативные районы, оказывается существенно меньше, чем общая численность бактерий, определяемая по окрашиванию ДАФИ. Причины этого явления пытались объяснить вероятной детекцией ДАФИ вирусных частиц, присутствующих зачастую в природных образцах. Однако наиболее вероятным объяснением может быть большое разнообразие таких бактериальных групп, которые в настоящее время не культивируются на известных селективных средах, а определяются только при секвенировании суммарной выделенной ДНК из природных образцов (Gloeckner et al., 1996). Исследователями на протяжении последних лет была показана возможность использования этого подхода для анализа структуры и состава самых разнообразных микробных сообществ: природных водных и почвенных популяций, и созданных искусственно в пищевой промышленности или промышленных ферментных культиваторах, либо для анализа промышленных сточных вод, - быстро и без культивирования. Одновременное использование
Природный образец
Гибридизация in situ
Накопительная культура
Суммарная бактериальная ДНК
Гибридизация целых клеток
Количественная гибридизация
и в
Я et S
& ю
1-І
Клоны с фрагментами рибосомальных генов
Дот-блот ибридизация
Олигонуклеотидный зонд
Я X
а о
Нуклеотидные последовательности
а
Сравнительный анализ
Банк данных по структурам рДНК
В-
h Я « О
а» В* и Я
Рис. 3. Схема, демонстрирующая различные возможности использования олигонуклеотидных зондов для характеристики природных образцов (по Атапп et al, 1995).
нескольких зондов, меченных разными флуоресцентными красителями, позволяет определять разные типы клеток в одном и том же поле зрения. Кроме того, количественная микрофлуометрия показала, что количество рРНК-специфичного зонда, которое связывается с клеткой Е. coli варьирует от концентрации рибосом, а, следовательно, отражает стадию и скорость роста клеток (DeLong et al., 1989).
Одно из новых направлений в молекулярной микробиологии -
клонирование крупных фрагментов бактериальных геномов, и анализ не
только генетического, но и функционального разнообразия
некультивируемых микроорганизмов (Rondon et al., 2000). Для разработки
методов изучения не только полного разнообразия микробных популяций,
но и активности и функционирования, был использован бактериальный
искусственный хромосомный (ВАС) вектор. Из почвенных образцов были
получены две метагеномные библиотеки, которые содержали ДНК более
1x10 п.н. Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК,
восстановленных для одной из библиотек, показал, что она содержит ДНК
большого разнообразия бактериальных групп, включая
последовательности таких различных таксонов, как грам-положительные бактерии с низким и высоким содержанием ГЦ пар, ацидобактерии, цитофаги и протеобактерии. Первоначальный скрининг библиотек в E.coli, выявил несколько клонов, которые экспрессируют гетерологичные гены со вставок. Таким образом, было показано, что ВАС-вектор может быть использован для поддержания, экспрессии и анализа ДНК из природных образцов. Фенотипы, экспрессированные с этих клонов, показали антибактериальную, липазную, амилазную, нуклеазную и хемолитическую активности. Метагеномные библиотеки - мощное орудие в исследовании разнообразия почвенных микроорганизмов, дающие информацию не только о генетическом разнообразии почвенных микроорганизмов. Подобные библиотеки могут быть новым подходом в развитии изучения генома, которые связывают филогенетическую и функциональную
информации о микробиоте популяции, в которой доминируют микроорганизмы, трудно поддающиеся культивированию (Rondon et al., 2000; Courtois et al., 2003).
Лимнологические характеристики озера Байкал, обусловливающие особенности функционирования водной экосистемы
Микроорганизмы озера Байкал являются наименее исследованной в систематическом отношении группой его обитателей. Изучение видового состава микроорганизмов Байкала необходимо и очень важно для понимания различных процессов, протекающих в озере. Данные по структуре микробного сообщества, вертикальное и горизонтальное распределение микроорганизмов позволяют проводить мониторинговые работы и давать санитарно-микробиологическую оценку качества воды (Дрюккер и др., 1993), изучать развитие процессов обмена вод верхних и глубинных слоев озера (Шимараев и др., 2000; Парфенова и др., 2000). Для исследования таксономического разнообразия микроорганизмов озера Байкал традиционно используются классические микробиологические методы, в основе которых лежит культивирование микроорганизмов на питательных средах. При этом выявляют морфологические, культуральные, физиолого-биохимические, серологические признаки исследуемых микроорганизмов, по которым устанавливают их принадлежность к тому или иному таксону. В настоящее время одним из дополнительных, а иногда и ключевым компонентом идентификации микроорганизмов становится секвенирование фрагментов рибосомальных генов. Этот подход является точным и надежным, а в совокупности с биохимическими тестами дает полную характеристику исследуемых штаммов.
Изучению видового состава микроорганизмов озера Байкал была посвящена многолетняя деятельность многих исследователей (Кузнецов, 1951; Романова, 1958; Кожова, Казанцева, 1961; Дрюккер, Штевнева, 1987). Как правило, все работы по определению видового состава байкальской микрофлоры велись классическими микробиологическими методами. Анализ публикаций за последние двадцать лет показал, что в воде и грунтах Байкала обнаружены представители практически всех систематических групп бактерий. Кроме того, были проведены исследования общей численности микроорганизмов, гетеротрофных бактерий, изучали распределение отдельных физиологических групп бактерий в воде и осадках озера (Верхозина, 1985; Парфенова, 1985; Парфенова, Илялетдинов, 1985; Гоман и др., 1986; Лаптева, 1990; Намсараев и др., 1995а, б, в).
Байкальский пикопланктон без сомнения является одним из самых интересных компонентов экосистемы озера и проблематичным для изучения (Белых и др., 1999). Его доля в первичной продукции водоема в летнее время составляет до 80% (Бондаренко, Гусельникова, 1989). Впервые пикопланктонное сообщество Байкала было описано Г.И. Поповской в 1968 году (Поповская, 1968). Ей же был впервые описан один из доминирующих видов - цианобактериальный штамм Synechocystis limnetica Popovsk. Однако пикоцианобактерии (размеры около 2 мкм) до сих пор остаются одной из самых малоизученных и труднокультивируемых групп. Наши современные представления о цианобактериях озера ограничиваются несколькими видами, а их изучение сводится зачастую только к экологическим исследованиям. На основе морфологических исследований выявлены и описаны новые виды автотрофного пикопланктона озера, а именно цианобактерии: Synechocystis sp., который существенно отличается от вида Synechocystis limnetica Popovsk, а также виды рода Synechococcus. Таксономическое положение большинства штаммов сейчас устанавливается методами молекулярной биологии (Belykh et al., 2000).
Большое разнообразие аэробных гетеротрофов отмечали многие исследователи. Это одна из наиболее изученных групп байкальских микроорганизмов, которая представлена большим разнообразием культивируемых штаммов. Среди грам-отрицательных аэробных гетеротрофных микроорганизмов в разное время были выделены и охарактеризованы представители следующих родов: Acinetobacter, Alcaligenes, Achromobacter, Azotobacter, Caulobacter, Chromobacterium, Flavobacterium, Paracoccus, Pseudomonas (Парфенова, Илялетдинов, 1985; Гоман и др., 1986; Лаптева, 1990). Грам-положительные бактерии представлены родами Bacillus, Desulfotomaculum, Desulfovibrio, Micrococcus и Clostridium (Младова, 1971, Намсараев и др., 1995а). Было показано активное участие этих микроорганизмов в процессах круговорота азота и фосфора (Верхозина, 1985; Парфенова, 1985; Парфенова, Илялетдинов, 1985). Особый интерес представляют серо-окисляющие бактерии, обнаруженные в микробиальных матах Северного Байкала (Намсараев и др., 1994). Они представлены родами Beggialoa, Thiothrix и Thioploca. Высокую ферментативную активность байкальских микроорганизмов отмечали многие исследователи микрофлоры озера. Было показано, что высокий процент тестируемых штаммов обладает различными ферментативными активностями, например фосфатазной, хитиназной, липазной, протеазной, и др. (Иванова и др., 1992; Бакунина и др., 1994). Именно среди гетеротрофных микроорганизмов были выявлены активные штаммы-продуценты эндонуклеаз рестрикции (Дедков и др., 1990). Однако к этой же группе относятся трудно культивируемые бактерии. Так, еще в 1990 году Лаптевой были обнаружены, культивированы и описаны некоторые виды рода Caulobacter (Лаптева, 1990). Однако до сих пор выделение, определение и поддержание в чистой культуре представителей этого рода представляет определенную трудность.
Не менее интересной группой являются байкальские актинобактерии. Список видов, которые были описаны микробиологическими методами, в последнее время существенно дополнился информацией, полученной при анализе некультивируемого сообщества. Ранее были описаны микроорганизмы родов Micrococcus, Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium (Максимова, Колесницкая, 1976; Парфенова, Илялетдинов, 1985). Методами молекулярной микробиологии было показано, что актинобактерии занимают свою экологическую нишу. Наибольшее количество нуклеотидных последовательностей, имеющих максимальную гомологию с актинобактериальными последовательностями, было получено из бактериальной ДНК, выделенной с глубины 400 м.
Среди облигатных анаэробов, не образующих спор, следует отметить метанообразующие бактерии. Эти бактерии по филогенетической систематике (Woese, 1987) относят к архебактериям. В озере Байкал выделены и определены представители двух родов Methanobacterium и Methanosarcina (Намсараев и др., 19956; Намсараев, Земская, 2000).
Состав буферов и сред, использованных в работе
Не смотря на долгую историю микробиологических исследований оз. Байкал, видовой состав водных микроорганизмов изучен далеко не полностью. Применение классических микробиологических методов для этих целей недостаточно, т. к. далеко не полное разнообразие бактерии культивируются на питательных средах в лабораторных условиях. Известно, что из природных экосистем культивируется не более 10-15% от общей численности бактерий (Amann et al., 1995), а из байкальской воды удается культивировать от 17 до 575 КОЕ/мл при общей численности 0.2 4.6х 106 кл/мл, что составляет в среднем 0.5-0.8 10 %. В данном случае большое значение приобретает использование методов молекулярной биологии, которые позволяют идентифицировать и визуализировать бактерии в природном образце без культивирования.
Для молекулярно генетического анализа природного водного микробного сообщества озера Байкал использовали подход, предложенный ранее Р. Аманном и соавторами и представленный на рисунке 2 (Amann et al., 1995). В рамках данной работы была выделена суммарная бактериальная ДНК из проб воды, отобранных с разных глубин центральных станций южной и средней котловин озера. Всего было проанализировано 7 проб. Амплификацию проводили на высококонсервативных праймерах при условиях, обеспечивающих наибольшее представительство различных бактериальных последовательностей. Получена библиотека, содержащая более 200 клонов, которые сгруппированы на основании однобуквенного секвенирования. Нуклеотидные последовательности длиной от 450 до 800 п.н. были определены для 138 полученных фрагментов, 78 из них зарегистрированы в EMBL-банке данных. Все они проанализированы сравнительным и филогенетическим анализом с ближайшими родственниками из банка данных. В настоящей работе для 29 последовательностей, которые получены из суммарной бактериальной ДНК, отобранной с глубины 1200 м южной котловины, проведен детальный сравнительный анализ с последовательностями, имеющимися в международном банке данных.
Для филогенетического анализа этих последовательностей наряду с ближайшими родственниками из международного банка данных использовали последовательности байкальских некультивируемых микроорганизмов, полученные с других глубин озера. Состав глубоководного микробного сообщества изучался флуоресцентыми методами: проводили подсчет общей численности бактерий при окрашивании ДАФИ и определяли долю представителей основных филогенетических групп микроорганизмов методом гибридизации ш situ с флуоресцентными групп-специфичными зондами (табл. 2). Схематически метод гибридизации и его применение для анализа природных бактериальных популяций представлены на рисунке 3 (Amann et al., 1995). Численность представителей отдельных бактериальных групп, а именно эубактериЙ, детектируемая зондом EUB338 (рис. 5), основных подгрупп протеобактерий, а именно, альфа, бета, гамма (рис. 6), детектируемых зондами ALF, BET, GAM, соответственно, и группы цитофаги-флавобактерии (рис. 7) представлена в таблице 4 в процентном соотношении от общей численности бактерий. Представители группы планктомицеты были обнаружены как единичные кокковидные клетки (рис. 8), они детектировались не в каждом поле зрения, поэтому не учитывались при общем подсчете и данные по этой группе не представлены в итоговой таблице. Следует отметить, что все расчеты были скорректированы с учетом гибридизации зонда NONEUB, который выявляет сигнал неспецифической гибридизации. Кроме того, было отмечено, что некоторые палочковидные клетки гамма-подгруппы протеобактерий, выделенные с глубоководных горизонтов озера обладают автофлуоресценцией (рис. 6, В).
Изучение филогенетического разнообразия некультивируемых глубоководных микроорганизмов озера Байкал
Результаты сравнительного анализа показали, что небольшое количество последовательностей имеют гомологию с последовательностями культивируемых штаммов, или штаммов, полученных в накопительной культуре, из других природных водоемов (прил. 1). Это такие последовательности, как 1200-9, 1200-12, 1200-25, 1204-37, 1204-42, 1200-63 и 1200-64. Следует отметить, что большинство из этих нуклеотидных последовательностей показали высокий процент гомологии (выше 97%) с последовательностями культивируемых штаммов, относящихся к альфа-подгруппе протеобактерий и грам-положительным бактериям с низким содержанием Г+Ц пар. Так, культивируемые штаммы Sphingomonas sp. (АВ033949) и Sphingomonas sp. (AF385529) сходны на 99.5% с байкальскими некультивируемыми микроорганизмами, представленными последовательностями 1200-9 и 1200-63, а последовательности 1204-37 и 1204-42 показали одинаковую гомологию (95.2%) с нуклеотидной последовательностью другого штамма Sphingomonas sp. (Z23157). Несколько последовательностей бактерий рода Methylobacterium имеют гомологию 98.9 (Z23160), 98.8 (D32231) и 98.7% (AF395035) с последовательностью 1200-64. Последовательность 1200-25 имеет высокую гомологию с последовательностью другого представителя альфа-подгруппы протеобактерий. Это культивируемый штамм Caulobacter leidyi (AJ227812), который на 99.4% сходен с байкальским микроорганизмом. Однако необходимо обратить внимание, что, хотя все близкородственные штаммы являются культивируемыми, точная видовая идентификация большинства из них не проведена (прил. 1; Hugenholtz et al., 1995; Abraham et al., 1999; Takeuchi et al., 2001; Paster et al., 2002). Кроме того, несомненно, обращает на себя внимание определение филогенетической группы ближайших родственников для последовательности 1200-63. Два из трех ближайших родственников отнесены авторами в подгруппу альфа-протеобактерии, это Sphingomonas sp. (AF385529) и звездчатая микроколония (AJ001344), выделенная из биопленок (прил. 1; Glockner et al., 1998; Paster et al., 2002).
Культивируемый штамм Pseudomonas sp. (AF3 31664) был отнесен авторами в гамма-подгруппу протеобактерий, куда относится большинство бактерий рода Pseudomonas (прил. 1). Однако, молекулярно-генетические исследования, проведенные в последнее десятилетие для типовых штаммов этого рода, показали некорректное определение некоторых видов рода Pseudomonas и неоднократно высказывались предложения об их переименовании (Segers et al., 1994; Denner et al., 1999). Недавно в результате ревизии рода Pseudomonas, проведенной Ю. Анзаем и соавторами в 2000 г., была показана полифилетичность этого рода, а штаммы, имеющие генетическое сходство с представителями других родов, было предложено переименовать на основе именно филогенетической идентификации (Anzai et al., 2000). Среди этих реформированных штаммов оказались и относящиеся к альфа-подгруппе протеобактерий. Это типовые штаммы Pseudomonas abikonensi, (альфа-подгруппа, Sphingomonadaceae), Pseudomonas carboxydohydrogena (альфа-подгруппа, Bradyrhizobiaceae) и Pseudomonas echinoids (альфа-подгруппа, Sphingomonadaceae) (Anzai et al., 2000). Для корректного определения филогенетической позиции последовательностей некультивируемых байкальских микроорганизмов: 1200-9, 1200-63, 1204-37, 1204-42, 1200-25 и 1200-64, - показавших высокое сходство с представителями культивируемых штаммов альфа-подгруппы протеобактерий, был проведен их филогенетический анализ как с ближайшими родственниками из банка данных, так и с типовыми штаммами гамма-подгруппы протеобактерий (рис. 10). В качестве типовых штаммов, относящихся к гамма-подгруппе, были выбраны Pseudomonas aeruginosa (AY162138), Pseudomonas stutzeri (AB098613) и Pseudomonas putida (AY308050). Филогенетический анализ (рис. 10) показал, что некультивируемые бактерии 1200-9, 1200-63, 1204-37 и 1204-42 являются представителями семейства Sphingomonadaceae. При этом, культивируемый штамм Pseudomonas sp. (AF331664) с высокой статистической достоверностью (98%) входит в кластер, образованный последовательностями, близкими к определенной нами (1200-63) и относящимися к семейству Sphingomonadaceae. С другой стороны, нуклеотидные последовательности типовых штаммов гамма-подгруппы псевдомонад образуют отдельный кластер на филогенетическом дереве. На основании этих данных можно считать, что культивируемый штамм Pseudomonas sp., близкий к роду Sphingomonas, относится к альфа-подгруппе протеобактерий и отнесен авторами в гамма-подгруппу ошибочно. Две другие последовательности, 1200-25 и 1200-64, входят в кластеры, образованные представителями семейств Caulobacteraceae и Methylobacteriaceae, соответственно (рис. 10).
