Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Биогеохимический цикл железа и марганца 9
1.2. Общая характеристика микроорганизмов, окисляющих железо и марганец 15
1.3. Биологическая роль окисления железа и марганца микроорганизмами 24
1.4. Микроорганизмы донных осадков оз. Байкал и экологические условия среды 30
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования 38
2.2. Методы исследования 46
ГЛАВА 3. Культивирование, морфология и систематика микроорганизмов, окисляющих железо и марганец в донных осадках оз. Байкал
3.1. Подходы к изучению и культивированию микроорганизмов, окисляющих железо и марганец 56
3.2. Морфологический и таксономический состав железо- и марганецокисляющих микроорганизмов 63
ГЛАВА 4. Экология микроорганизмов, окисляющих железо и марганец в донных осадках оз. Байкал
4.1. Физико-химические условия развития железо- и марганецокисляющих бактерий 75
4.2. Численность и распределение микроорганизмов, окисляющих железо и марганец в донных осадках 87
ГЛАВА 5. Изучение роли микроорганизмов в окислении железа и марганца и в осаждении их окислов в экспериментальных условиях
5.1. Окисление Fe(II) и Мп(И) микроорганизмами в условиях лабораторного моделирования 102
5.2. Исследование роли микроорганизмов в образовании железомарганцевых конкреций 112
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 119
ВЫВОДЫ 122
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 124
ПРИЛОЖЕНИЕ 144
- Биогеохимический цикл железа и марганца
- Объекты исследования
- Подходы к изучению и культивированию микроорганизмов, окисляющих железо и марганец
Введение к работе
Способность окислять двухвалентные соединения железа и марганца и осаждать окислы металлов на поверхности клеток, присуща многим прокариотным микроорганизмам. Круговорот железа и марганца имеет огромное значение для биосферы. Решающая роль в геохимическом цикле железа и марганца принадлежит микроорганизмам, использующим разные формы этих элементов для своих энергетических и конструктивных потребностей.
Согласно филогенетической классификации, основанной на данных секвенирования гена 16S рРНК, железо- и марганецокисляющие бактерии полифилетичны и принадлежат к нескольким таксономическим группам (Garrity, 2001). Они имеют грамотрицательный или грамположительный морфотип, очень разнообразны морфологически и гетерогенны в метаболическом плане. Физиологический смысл и конкретные способы окисления железа и марганца у них существенно варьируют от вида к виду. Микроорганизмы, окисляющие Fe(II) и Мп(П) широко распространены в домене Bacteria, а так же встречаются в домене Archaea и Eucarya (Hallberg, Johnson, 2001). Известные представители железо- и марганецокисляющих бюактерий принадлежат к семи таксономическим группам: Nitrospirae, Proteobacteria, Firmicutes, Planctomyces, Actinobacteria, Crenarchaeota, Euryarchaeota.
Железо- и марганецокисляющие бактерии часто встречаются в аэробных экосистемах. Благодаря их жизнедеятельности образуются обильные преципитаты оксидов железа и марганца, которые служат весьма характерным индикатором присутствия микроорганизмов данной группы.
Деятельность микроорганизмов, окисляющих железо и марганец, ранее изучалась в пресноводных (Кузнецов, 1970; Заварзин, 1972; Горленко и др., 1977; Nealson et al., 1988; Miyajima, 1992; Straub, Buchholz-Cleven, 1998; и
др.) и морских экосистемах (Jannasch, Taylor, 1984; de Vrind et al., 1986; Waasbergen et al., 1986; Tortell et al., 1999; Tazaki, 2000; Emerson, Moyer, 2002; Edwards et al., 2003 и др.).
В озере Байкал микробиологические процессы окисления железа и марганца мало изучены, и характеризуются единичными данными (Дубинина, 1978; Коробушкина и др., 1995; Granina et al., 2003). Между тем, в донных осадках озера создаются условия для развития микроорганизмов, окисляющих железо и марганец. Железо и марганец поступают в Байкал преимущественно (более 95%) с речным стоком, поток из атмосферы не превышает 4-5%. В речном стоке явно преобладают взвешенные формы, на растворенные приходится лишь около 1% Fe и 8% Мп. В воде озера концентрации этих элементов ниже, чем обычно в пресных водоемах, и близки к таковым в океане (Лейбович-Гранина, 1985). Постоянное насыщение гиполимниона озера кислородом приводит к практически полному переходу железа и марганца в донные илы, где происходит интенсивное диагенетическое перераспределение вплоть до образования конкреций. Оценка баланса железа и марганца в Байкале свидетельствует, что более 90% поступающих в озеро элементов, захоранивается в его донных отложениях (Лейбович-Гранина, 1987).
Донные отложения озера Байкал представляют собой особую экологическую зону, характеризующуюся тонкой слоистостью физико-химических условий и распределения микрофлоры. Исследование деятельности железо- и марганецокисляющих бактерий важно для характеристики геохимического цикла железа и марганца и определения роли микроорганизмов в осаждении этих рудообразующих элементов в донных осадках озера Байкал. До настоящего времени видовое разнообразие и количественная оценка железо- и марганецокисляющих бактерий не проведена, поэтому изучение структуры и численности данной группы микроорганизмов в озере Байкал является актуальной задачей.
Цель настоящей работы: выявить разнообразие и особенности распределения микроорганизмов, способных к окислению железа и марганца в донных осадках оз. Байкал.
Задачи исследования
1. Определить видовое разнообразие микроорганизмов, окисляющих
железо и марганец в донных осадках оз. Байкал;
Показать влияние физико-химических факторов на выявляемость железо- и марганецокисляющих бактерий;
Изучить количественный состав и закономерности вертикального распределения железо- и марганецокисляющих бактерий;
Провести сравнительные исследования Fe(II) и Мп(П)окислительной активности у разных морфотипов железобактерий;
Получить в условиях лабораторного эксперимента минерализованные образования с культурами микроорганизмов, изолированными из донных осадков оз. Байкал.
Научная новизна. Впервые проведено исследование культивируемых микроорганизмов, окисляющих железо и марганец, в донных осадках озера Байкал. Выделено и идентифицировано 115 чистых культур железо- и марганецокисляющих микроорганизмов, отнесенных к шести родам: Metallogenim, Lepthotrix, Siderocapsa, Naumaniella, Bacillus и Pseudomonas. Установлено, что исследуемые бактерии широко распространены в донных отложениях Байкала. Экологические ниши железо- и марганецокисляющих микроорганизмов приурочены к поверхностным слоям грунта и границе окисленных и восстановленных осадков. Основными факторами, влияющими на численность и распределение железобактерий, являются окислительно-восстановительные условия среды, наличие растворенных форм железа и марганца, а также органического вещества, которые контролируются условиями осадконакопления в озере. Впервые в условиях лабораторного эксперимента показано получение железомарганцевых микроконкреций с участием микроорганизмов, изолированных из донных осадков оз. Байкал.
Практическая значимость. Получены активные штаммы микроорганизмов, окисляющих железо и марганец. Бактерии переводят металлы в нерастворимую форму и накапливают окислы на поверхностных структурах клеток. Культуры могут быть рекомендованы к применению в технологии извлечения железа и марганца из растворов, обогащенных этими металлами. Предлагается использовать данные штаммы на практических занятиях в ВУЗах для изучения процессов окисления железа и марганца в экосистемах.
Основные положения, выносимые на защиту:
В процессах окисления Fe(II) и Мп(П) в донных осадках озера Байкал принимают участие представители шести родов бактерий: Metallogenim, Lepthotrix, Siderocapsa, Naumaniella, Bacillus и Pseudomonas.
Численность и распределение микроорганизмов, окисляющих железо и марганец, зависит от литологического состава донных отложений и условий осадконакопления в озере. Основные факторы, влияющие на биогенное Fe(II) и Мп(П) окисление в осадках Байкала: глубокое проникновение кислорода, подток восстановленных форм железа и марганца, количество органического вещества и реакция среды.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на третьем международном симпозиуме «Ancient Lakes: speciation, development in time and space, natural history» (Иркутск, 2002), на Байкальском микробиологическом симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» (Иркутск, 2003), на международном совещании «Biochemical processes involving iron minerals in natural waters» (Monte Verita, Switzerland, 2003), на европейском микробиологическом конгрессе «1st FEMS congress of European microbiologist» (Ljubljana, Slovenia, 2003), на международной конференции «14th Annual Goldschmidt» (Denmark, 2004), на международном совещании «Biosphere Origin and Evolution» (Новосибирск, 2005), на 4-ой Верещагинской конференции (Иркутск, 2005), на молодежной
конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), на международном совещании «ESF Workshop» (Bayreuth, Germany, 2005), на всероссийской конференции «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.
Биогеохимический цикл железа и марганца
Железо и марганец - одни из самых распространённых в природе элементов. По наличию в континентальной коре железо занимает второе место после алюминия. В целом процентное содержание в земной коре, или кларк, для железа равен 4,65, для марганца - 0,08. Распределение этих элементов строго связано с возможностью их существования в разных степенях окисления (Вернадский, 1994).
В недрах Земли одинаково стабильны двухвалентное железо (в составе сидерита FeCCh и пирита FeS2) и трехвалентное железо (в составе смешанного минерала магнетита FeO " YQIOT). При доступе кислорода стабильно только трехвалентное железо, входящее в состав окисных и сульфидных минералов (гематита Fe203, гетита FeO(OH), грейгита РезБД железных руд, железистых песков и глин. Марганец в массивных горных породах находится в виде Мп2+, с участием кислорода он переходит в состояния Мп3+ и Мп4+ и включается в состав минералов марганца (браунита МпгОз, гаусманита МП3О4, пиролюзита МпОг) и осадочных пород (Вернадский, 1994). Оксидами железа и марганца бывают обогащены почва и водоёмы, железомарганцевые конкреции встречаются в донных осадках озер и на дне океанов (Богданов, 1994; Бухаров, 1996; Tazaki, 2000;.Straub et al, 2001).
Круговорот железа и марганца имеет огромное значение для биосферы. Ведущая роль в геохимическом цикле этих элементов принадлежит микроорганизмам, использующим разные формы железа и марганца для конструктивных и энергетических потребностей.
В природных экосистемах железо и марганец существуют в двух главных степенях окисления (+2 и +3) и (+2 и +4) соответственно.
Устойчивость соединений марганца зависит от физико-химических условий среды - прежде всего от рН и восстановителей, а также от веществ, способных адсорбировать его ионы.
Для реакции (1) характерна высокая энергия активации. Поэтому при обычных в природе концентрациях и рН 8 катион Мп2+ устойчив и практически не окисляется абиотическим путём (Заварзин, 1972; Nealson et al., 1988).
Показано, что иммобилизация Мп(П) на биогенных и абиогенных структурах снижает энергию активации реакции (1), и последняя становится автокаталитической (Nealson et al., 1988). Диоксид марганца так же может играть роль адсорбента, создавая сайты для катионов (Nealson et al., 1988; Lovley, 1993). Mn(IV) существует в основном в составе нерастворимого в воде оксида МпОг или оксигидрооксида МпО(ОН)2, которые проявляют окислительные свойства и устойчивы только в восстановительной среде.
Микроорганизмы активно способствуют обратимому переходу марганца из валентного состояния Мп(ІІ) в Mn(IV). Известно, что микроорганизмы могут ускорить окисление Мп" в 100 тыс. раз по сравнению с абиотическим процессом (Brouwers et al., 2000).
В стратифицированных водных системах марганецокисляющие и марганецвосстанавливающие микроорганизмы контролируют цикл марганца на границе раздела между аэробной и анаэробной зонами (Кузнецов, 1970; Горленко и др., 1977).
Объекты исследования
Исследования донных осадков озера Байкал проводились в 2001 - 2006 годах в разных районах, различающихся по темпам накопления осадков, содержанию органического вещества и минерализации (рис 1). Это глубоководные районы Южного и Северного Байкала, мелководные - района Баргузинского залива, придельтовые р. Селенги, районы подводных возвышенностей Среднего Байкала (Академический хребет, Посольская банка). Также были изучены места выхода гидротермальных вод (бухта Фролиха), распространения газовых гидратов (Кукуйский каньон, кратеры Маленький, Большой) и нефтепроявлений (м. Толстый, Горевой Утес).
Пробы донных осадков были отобраны в ходе экспедиций на НИС «Верещагин» при помощи пластиковых бентосных трубок, гравитационных труб и дночерпателя «Океан». Всего было отобрано и исследовано 605 проб донных осадков на 56 станциях оз. Байкал (рис. 3). В таблицах (1, 2, 3) представлена характеристика отобранных проб.
Грунт в колонках исследовали послойно через 1- 2 см. Обработку проб для микробиологических определений производили непосредственно после отбора, а также после замораживания в стерильной стеклянной посуде и полиэтиленовых пакетах.
Сразу после извлечения грунта измеряли Т, рН и Eh при помощи портативных приборов EC/pH-meter WM-22EP (ТОА, Япония) и Eh-meter (HORIBA, Япония). Поровые воды осадков получали центрифугированием.
Подходы к изучению и культивированию микроорганизмов, окисляющих железо и марганец
Железобактерии - микроорганизмы, принимающие участие в окислении и осаждении окислов железа и марганца из растворенных соединений этих элементов. Участие микроорганизмов в окислении железа и марганца косвенно доказывается выделением культур железо- и марганецокисляющих бактерий из экосистемы, в которой идет этот процесс (Заварзин, 1972; Дубинина, 1976; Ghiorse, 1984; Emerson, Mayer, 1997). Современные исследования микроорганизмов, окисляющих железо и марганец, основываются на классических трудах Виноградского С.Н., Холодного Н.Г., Исаченко Б.Л., Перфильева Б.В. (Пиневич, 2005). В настоящее время изучению биоразнообразия и физиологии железобактерий уделяется большое внимание многих исследователей (Emerson, Moyer, 1997; 2002; Emerson et al. 1999; Nelson et al. 1999; Brouwers et al. 2000; Straub et al. 2001; др.). Описания микроорганизмов базируются в основном на морфологических признаках. Часто диагностические признаки (форма и размеры клеток, капсулы чехлов, строение ценобий) некоторых видов железобактерий являются непостоянными и зависят от условий внешней среды. Кроме того, сама способность к окислению железа и марганца проявляется при определенных условиях культивирования (Дубинина, 1976).
Большинство питательных сред, применяемых для выделения и культивирования марганец- и железоокисляющих микроорганизмов, не являются элективными для отдельных ее представителей. Вместе с тем для выделения некоторых представителей этой группы разработаны специальные методы культивирования с учетом своеобразия физиологических потребностей (Родина, 1965; Романенко, Кузнецов, 1974; Кузнецов, Дубинина, 1987).
При использовании известных селективных сред (№1; 2; 3; 4; 7; 8) для культивирования получить развитие железо- и марганецокисляющих микроорганизмов не удалось. Рост на средах №5; 6; сопровождался накоплением в колониях бурых окислов марганца, на среде №9 желто-оранжевых окислов железа. Слабое накопление в колониях окислов железа и марганца удавалось выявить только с помощью их окрашивания растворами желтой кровяной соли или бензидина соответственно (рис. 4).
Известно, что все попытки культивирования железобактерий на чисто минеральных средах при нейтральных или слабощелочных условиях среды были неудачными. В то же время рядом исследователей установлено, что присутствие в средах органических веществ и восстановленных соединений железа и марганца значительно стимулируют рост железобактерий (Калиненко, 1946; Савельева, 1965; Дубинина, 1978; Горленко, 1977;).
В природе очень распространены устойчивые комплексы железа с органическим веществом. Органическая часть комплексных соединений может служить источником углерода для железоокисляющих микроорганизмов, а железо адсорбируется на поверхности клеток. Железобактерии (как гетеротрофные микроорганизмы) минерализуют сложные органические вещества, вступающие в комплексы с минеральным железом.
В настоящее время показана возможность окисления оксидами марганца таких сложных органических веществ, как гуматы (Sunda, Kieber, 1994). Бактерии, у которых есть Мп- оксидаза, получают доступ к богатому ресурсу субстратов, недоступных другим организмам. При окислении гуматов не просто образуются низкомолекулярные продукты, а накапливаются ключевые метаболиты, в частности пируват. Следовательно, Мп - оксидаза дает бактериям преимущества в олиготрофных экосистемах.
Донные отложения озера Байкал - особая экологическая ниша, характеризующаяся несколько большим содержанием органических веществ, нейтральным рН, высоким окислительно-восстановительным потенциалом, интенсивной вертикальной миграцией железа и марганца (Выхристюк, Лазо, 1975; Гранина, 1991). Эти факторы определяют благоприятную среду обитания для микроорганизмов, влияющих на круговорот железа и марганца в осадках Байкала.
Для решения вопросов культивирования и оценки биоразнообразия железобактерий в донных осадках Байкала был применен экологический подход. Это дало возможность подойти к подбору оптимальных питательных сред для культивирования многих представителей группы железо- и марганецокисляющих микроорганизмов.
