Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Географические и экологические характеристики озер Байкал, Хубсугул и водохранилищ ангарского каскада 10
1.2. Систематика цианобактерий 12
1.3. Морфология и ультраструктура цианобактерий 13
1.3.1. Морфология цианобактерий порядка Chroococcales 13
1.3.2. Ультраструктура цианобактерий 16
1.4. Экология цианобактерий 21
1.5. Пресноводные пикоцианобактерии 22
1.6. Байкальские пикоцианобактерии 23
1.7. Молекулярно-биологический подход в экологических исследованиях цианобактерий 25
1.8. Заключение 29
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 31
2.1. Отбор проб 31
2.2. Культивирование цианобактерий 31
2.3. Эпифлуоресцентная микроскопия 32
2.4. Электронная микроскопия 32
2.4.1. Сканирующая электронная микроскопия 32
2.4.2. Трансмиссионная электронная микроскопия 33
2.5. Молекулярно-биологические методы 34
2.5.1. Выделение ДНК 34
2.5.2. Полимеразная цепная реакция 34
2.5.3. Определение иуклеотидных последовательностей генов 35
2.5.4. Клонирование 36
2.5.5. Филогенетический анализ и построение деревьев 37
ГЛАВА 3 МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПИКОЦИАНОБАКТЕРИИ ОЗЕРА БАЙКАЛ 39
3.1, Байкальские пикоцианобактерии in situ 39
3.2. Морфологическая характеристика байкальских культивируемых пикоцианобактерии 49
ГЛАВА 4. УЛЬТРАСТРУКТУРА БАЙКАЛЬСКИХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ 68
ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА 16S рРНК ПИКОЦИАНОБАКТЕРИИ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ 81
5.1. Определение первичных последовательностей гена 16S рРНК у некультивируемых пикоцианобактерии озер Байкал, Хубсугул и филогенетический анализ 81
5.2. Определение первичных последовательностей гена 16S рРНК культивируемых пикоцианобактерии озера Байкал и филогенетический анализ 83
ГЛАВА 6. ВЫЯВЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ МАРКЕРОВ ТОКСИЧНОСТИ ЦИАНОБАКТЕРИЙ ОЗЕРА БАЙКАЛ 90
Выводы. 94
Список литературы 96
- Географические и экологические характеристики озер Байкал, Хубсугул и водохранилищ ангарского каскада
- Культивирование цианобактерий
- Байкальские пикоцианобактерии in situ
- УЛЬТРАСТРУКТУРА БАЙКАЛЬСКИХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ
- Определение первичных последовательностей гена 16S рРНК у некультивируемых пикоцианобактерии озер Байкал, Хубсугул и филогенетический анализ
Введение к работе
Актуальность темы. Автотрофный пикопланктон (АРР) - это мельчайшие планктонные водоросли и цианобактерий размером 0,2-2,0 мкм (Sieburth et al, 1978; Stockner, Antia, 1986). Особенно велико значение автотрофного пикопланктона в олиготрофных водах, где он создает до 70 % первичной продукции (Stockner, 1991; Weisse et al, 1993; Voros et al., 1998).
Байкал является крупнейшим пресноводным олиготрофным водоемом
Центральной Азии. Геологические, географические и гидрологические
особенности озера определяют уникальность и высокую степень эндемизма его
обитателей (Lake Baikal, 1998). Численность АРР достигает в озере 1 млн кл/мл,
а вклад в первичную продукцию составляет 60-80 % (Вотинцев и др., 1972;
Бондаренко, Гусельникова, 1989; Nagata et al., 1994). Байкальский АРР на 90 %
состоит из цианобактерий, а на 10 % - из эукариотических водорослей
(Поповская, Белых, 2003). Несмотря на важное значение, которое играют в
Байкале пикопланктонные цианобактерий, степень их изученности
недостаточна из-за небольших размеров объекта и ограниченного набора морфологических признаков. Для уточнения систематического положения пикоциано бактерий ранее были весьма успешно использованы молекулярно-биологические методы (Britschgi et al, 1991; Nelissen et al., 1996; Nubel et al, 1997; Ernst et al., 1995, 2003). Поэтому предполагается применить комплексный подход в изучении биоразнообразия байкальских пикоцианобактерий с использованием методов морфологии и молекулярной биологии.
Другим важным аспектом в исследованиях цианобактерий является вопрос о потенциальной токсичности некоторых видов. Известно, что такое экологическое явление, как «цветение» водоемов, обусловленное массовым развитием цианобактерий, нередко приводит к появлению в воде токсинов. Наиболее распространенным среди них является микроцистин, который вызывает отравления и поражения печени у человека и животных (Dunn, 1996; Kurmayer et al, 2003). Молекулярно-биологическими методами было показано, что гены, участвующие в синтезе микроцистина, распространены спорадически среди 5 родов цианобактерий (Rantala et al, 1998). Описано, что некоторые представители родов Synechocystis и Synechococcus содержат гены микроцистинсинтетазы (Rantala et al, 1998; Christiansen et al, 2001). Так как численность цианобактерий высока в течение всего года, исследования байкальских цианобактерий на содержание гена токсичности весьма важны как с научной точки зрения, так и для оценки качества воды.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование морфологии, ультраструктуры и определение последовательности гена 16S рРНК байкальских пикопланктонных цианобактерий и выявление потенциально токсичных цианобактерий.
Для этого необходимо было решить следующие задачи: 1. Описать морфологию и ультраструктуру пикопланктонных цианобактерий озера Байкал in situ с помощью оптической и электронной микроскопии.
Выделить штаммы пикоцианобактерий озера Байкал и описать их, используя микроскопические методы.
Охарактеризовать генетическое разнообразие байкальских цианобактерий in situ в сравнение с цианобактериями из других водоемов.
Определить нуклеотидные последовательности фрагментов 16S рибосомного гена культивируемых байкальских цианобактерий и сравнить с последовательностями цианобактерий из других пресноводных экосистем.
5. Выявить генетический маркер токсичности цианобактерий - ген синтеза
микроцистина (тсуЕ) - в суммарной ДНК пико- и фитопланктонной фракций
озера Байкал и водоемов с различной степенью трофности.
Научная новизна работы. Впервые дана комплексная характеристика байкальских пикопланктонных цианобактерий, в работе приводятся данные микроскопических, ультраструктурных и молекулярно-биологических исследований пикоцианобактерий в культурах и in situ. Выявлено высокое морфологическое и генетическое разнообразие пикоцианобактерий озера Байкал и проведен сравнительный анализ байкальских пикоцианобактерий с цианобактериями олиготрофных, мезотрофных и эвтрофных озер. Впервые проведено исследование ДНК байкальских цианобактерий и цианобактерий ангарских водохранилищ с использованием специфических праймеров к гену тсуЕ и показано наличие потенциально токсичных цианобактерий в фитопланктоне Усть-Илимского водохранилища.
Практическая значимость работы. Исследование байкальского автотрофного пикопланктона позволило уточнить систематическое положение байкальских цианобактерий, ревизия была проведена согласно современной систематике. Нами получены значения биообъемов клеток различных морфотипов байкальских пикоцианобактерий, полученные данные можно использовать при мониторинговых исследованиях озера Байкал. Создан банк данных генетических последовательностей 16S рДНК байкальских пикоцианобактерий, зарегистрировано 24 последовательности культивируемых цианобактерий (DQ399905-DQ39907, DQ401110, DQ401111, DQ403805-DQ403807, DQ407506-DQ407518, DQ422952, DQ459297, DQ459298) и 6 последовательностей некультивируемых цианобактерий (DQ418752, DQ297458-DQ297462), получены и зарегистрированы генетические последовательности цианобактерий озера Хубсугул (DQ297464, DQ302754, DQ302755, DQ422951). Использованные в работе методы молекулярно-биологической детекции токсичных цианобактерий являются перспективными для быстрого выявления токсичных видов в различных экосистемах и могут быть применены для мониторинга любых водных объектов и оценки качества воды в них. Эти методы позволяют в короткий срок определить не только наличие токсичных цианобактерий, но и идентифицировать их видовую принадлежность.
В диссертацию вошли результаты, полученные при финансовой поддержке грантов РФФИ № 02-04-49756, 05-04-48624; РФФИ-Байкал № 01-04-97217, 05-04-97222; молодежный проект СО РАН № 140; НШ-2195.2003.4 (поддержка ведущих научных школ) и гранта 2006 - РИ - 112 /001/007.
Защищаемые положения:
В автотрофном пикопланктоне озера Байкал доминируют цианобактерии родов Synechocystis, Synechococcus и Cyanobium. Байкальские пикоцианобактерии, несмотря на сходство с другими пресноводными цианобактериями, являются морфологически и генетически отличными.
Показано, что цианобактерии озера Байкал, Иркутского и Братского водохранилищ не содержат гена синтеза микроцистина. В Усть-Илимском водохранилище выявлены цианобактерии Microcystis aeruginosa, которые являются потенциально токсичными.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на научных мероприятиях: международные симпозиумы «SIAL» (Иркутск, 2002), «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» (Иркутск, 2003), «IAC 2004» (Люксембург, 2004), «Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами» (Улан-Удэ - Улан-Батор, 2004); международная конференция «Изменения климата и окружающей среды в Центральной Азии» (Улан-Батор, 2005); молодежная конференция-школа «Научные школы Сибири» (Иркутск, 2005); 4 международная Верещагинская конференция (Иркутск, 2005); III международная конференция по актуальным проблемам современной альгологии (Харьков, 2005); международная конференция «Первичная продукция водных систем» (Борок, 2005); международная конференция «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Паттайя, 2006), Всероссийская конференция с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).
Публикации и личный вклад автора. По результатам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них четыре статьи в центральных и зарубежных журналах. Экспериментальные данные были получены автором как самостоятельно, так и в совместных экспериментах. Результаты, представленные в диссертации, защищаются впервые.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на стр.,
состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы, содержащего 167 источников (129 на иностранных языках), содержит 5 таблиц, проиллюстрирована 15 рисунками с 83 микрофотографиями.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю к.б.н. О.И. Белых, а также своим соавторам: Е.Г. Сороковиковой, А.С. Гладких, Г.В. Помазкиной, Э.Э. Пензиной. Автор благодарен сотрудникам отдела Ультраструктуры Клетки за ценные указания и помощь в работе.
Географические и экологические характеристики озер Байкал, Хубсугул и водохранилищ ангарского каскада
Самое глубокое озеро мира, расположенное на северо-востоке Центральной Азии на высоте 455,9 над уровнем моря. Основные характеристики озера: протяженность 636 км и ширина, которая варьирует в разных участках от 25 до 80 км (Байкал, Атлас, 1993; Атлас-определитель пелагионтов, 1995). Площадь акватории вместе с островами составляет 31500 км , это восьмое место по площади озер в мире. Водосборная площадь 540000 км2, длина береговой линии 1800 км.
Максимальные глубины в каждой из трех котловин существенно различаются, в Южной котловине Байкала - 1432 м, в Средней котловине -1637 м, в Северной котловине - 889 м. Стратификация озера происходит дважды - летом - прямая и зимой - обратная, озеро имеет два периода гомотермии - в середине весны и осени, когда благодаря перемешиванию ветрами и движению водных масс температура становится одинаковой. Замерзает озеро ежегодно, причем на севере и юге в разные сроки. Ледовый покров обычно держится 4 месяца, толщина льда варьирует от 80 до 120 см и более (Кожов, 1947; Lake Baikal, 1998).
Температура поверхности воды летом 12-14 С, на глубине 10 м составляет 10-12 С, в сорах и мелководных заливах вода прогревается до 17-18 С и 22-24 С, соответственно. Сезонные изменения охватывают лишь верхние слои - до 200-250 м, ниже температура всегда постоянна 3,3-3,6С.
Прозрачность воды наибольшая в зимнее время, в открытых глубоководных участках она достигает 25-40 м, летом снижается до 6-8 и даже 5-4 м, особенно вблизи устьев крупных рек. Вода Байкала формируется почти целиком за счет вод притоков. Особенности химического состава воды: крайне слабая минерализация (не более 100 мг/л), исключительная бедность кальцием (15 мг/л), обилие кислорода (не ниже 70% насыщения).
Климат вокруг озера мягко континентальный, еще в 1947 году Г.Ю. Верещагин определил климат Прибайкалья как «особенный пресноводный тип морского климата» (Верещагин, 1947). Режим солнечной радиации является главным определяющим звеном байкальского климата, ее среднее ежегодное достигает 2200 часов. Максимальное значение солнечной радиации было установлено около острова Ольхон, а минимальное - на восточном побережье южной и северной котловины озера. Количество ультрафиолетовых лучей на Байкале сопоставимо с Альпийским регионом (Lake Baikal, 1998).
Хубсугул. Одно из крупнейших озер Центральной Азии, имеет, как и Байкал, тектоническое происхождение. Протяженность озера с севера на юг достигает 130 км, средняя ширина - 20 км. Площадь поверхности воды составляет 2760 км2, 85 % водной поверхности - это пелагиаль. Максимальная глубина озера равняется 262 м. Озеро является ультраолиготрофным, вода в нем имеет высокое содержание кислорода. Климат территории Хубсугула резко континентальный, солнечная радиация весьма высока - до 2600-2800 часов в год (Атлас озера Хубсугул, 1989). Ранее считалось, что пикоцианобактерии отсутствуют в озере (Кожов и др. 1965; Загоренко, Кожова, 1973), но недавние исследования показали высокую численность пикопланктоыных цианобактерий (Belykh et ah, 2005).
Культивирование цианобактерий
Пробы для культивирования отбирались в 200 мл стерильные колбы, колбы заполнялись до верха и закрывались притертой пробкой.
Монокультуры байкальских цианобактерий получали на среде Z-8, описанной ранее и приготовленной на байкальской воде (Rippka et al., 1979; Rippka, 1988). Пробы воды рассевали на 1 % агаризованную среду в чашки Петри, которые помещали в термостат (New Brunswick G25, USA) со световым режимом 1000-1500 люкс (использовали четыре лампы белого света), и температурой 11-12 С. После 6-8 недель проводили скрининг выросших колоний под эпифлуоресцентным микроскопом, колонии многократно пересевали до получения однородной культуры, а затем поддерживали на твердой среде Z-8. Полученные штаммы пикоцианобактерий хранятся в музее байкальских водорослей, Отдел Ультраструктуры Клетки, Лимнологический Институт СО РАН.
Байкальские пикоцианобактерии in situ
Исследования, проведенные с помощью эиифлуоресцентной микроскопии (ЭФМ) показали, что в автотрофном пикопланктоне озера Байкал преобладают фикоэритрин-доминирующие цианобактерии с характерным красно-оранжевым свечением при наблюдении под зеленым светом (рис. 1). На основании морфологических признаков, таких как размер, форма клеток, способ деления и наличие слизи (Komarek, Anagnostidis, 1999), они были отнесены к родам Synechocystis Sauv., Synechococcus Nag., Cyanobium Rippka.
Род Synechocystis представлен в озере Байкал эндемичным видом S. Umnetica, описанным Г.И. Поповской с помощью световой микроскопии и осадочного метода (Поповская, 1968). По данным флуоресцентной микроскопии и последующего морфометрического анализа, диаметр клеток составляет в среднем 1,2 мкм (рис. 1а). Средний объем клетки S. Umnetica достигает 1,76 мкм3. СЭМ-наблюдение клеток S. Umnetica не обнаружило каких-либо дополнительных структур на поверхности клеток, а именно спинов и пилей, которые найдены у морских представителей этого рода (Perkins et ah, 1981) (рис. 2а). По данным СЭМ, диаметр S. Umnetica составлял в среднем 1,1 мкм, варьируя от 1,3 до 0,9 мкм, при этом размер клеток был немного меньше, чем при ЭФМ, что связано с обезвоживанием и сжатием клеток при приготовлении препаратов для электронной микроскопии. Показано, что клетки S. Umnetica встречаются чаще всего по 2-4 вместе. Нами отмечено, что встречаются агрегаты цианобактерии рода Synechocystis, весьма похожие на S. Umnetica, но в колониях более 8 клеток. Эти байкальские цианобактерии были названы нами Synechocystis sp. (рис. 26).
Род Synechococcus представлен несколькими палочковидными формами, которые встречаются в течение всего года в планктоне озера Байкал. Первый морфотип был назван нами морфотипом «короткие прямые палочки» (рис. 16).
Ультраструктура байкальских цианобактерий
С помощью ТЭМ были исследованы три рода цианобактерий, доминирующих в пикопланктоне озера Байкал.
Эндемичный представитель Synechocystis limnetica имеет гладкую, без спинов и пилей поверхность (рис. 5а). Методом негативного контрастирования показано, что взрослые разделившиеся клетки удерживаются вместе при помощи слизистого чехла. Чехол состоит из тяжей, по структуре рыхлый и тонкий, четко повторяет ее сферическую форму. Клеточные покровы четырехслойные, толщина их вместе со слизистым чехлом достигает до 100 нм (рис. 56, 5в). Зона нуклеоида хорошо заметна у более взрослых клеток и представляет собой светлый, менее осмиофильный участок цитоплазмы. У делящихся клеток эта зона трудноразличима. Тилакоиды имеют пристенное положение, вдоль слоя цитоплазматической мембраны, всего отмечено три тилакоидных мембраны. На микрофотографиях пикоцианобактерий присутствуют различные клеточные включения - полиэдральные тела, гранулы цианофицина и полифосфатные гранулы. Полиэдральные тела представлены темно-серыми структурами кристаллоподобной формы диаметром до 190 нм, такие включения всегда располагаются в центре клетки. Цианофициновые зерна лежат в периферической части клетки, эти структурированные гранулы могут достигать размеров 500 нм (Drews, Niklowitz, 1956), а в случае S. limnetica достигают 300-420 нм. Полифосфатные включения представляют собой бесструктурные электронно-плотные образования (рис. 5в) размером до 160 нм, считается, что наибольших размеров они достигают в старых клетках (Fogg et ah, 1973). Ранее в олиготрофных озерах США были описаны пикопланктонные цианобактерий на разных стадиях жизненного цикла, соответствующим развитию цианобактерий рода Synechocystis (Copre, Jensen, 1992). Размеры и ультраструктура всех трех популяций были близки к S. limnetica (Koraarek, Anagnostidis, 1999).
Определение первичных последовательностей гена 16S рРНК у некультивируемых пикоцианобактерии озер Байкал, Хубсугул и филогенетический анализ
С помощью клонирования определено 6 последовательностей некультивируемых цианобактерий из озера Байкал и 5 - из озера Хубсугул длиной 600-633 пар нуклеотидов. Проведенный нами BLAST-анализ полученных последовательностей показал, что все они являются уникальными. Гомология некультивируемых байкальских цианобактерий с пикоцианобактериями из альпийских озер и озера Бива составила 98-99 %. Филогенетический анализ с высокой поддержкой выявил кладу клонов из озера Хубсугул (клоны 7, 14) и Байкал (клоны 1, 4, 5) (рис. 12). Эта отдельная клада содержит последовательности цианобактерий озер Бива, Павин (Франция) и небольших альпийских озер Европы. Остальные клоны были расположены спорадически, например, последовательность клона 6 (Байкал) принадлежит ветви фикоэритрин-доминирущих овоидных палочек из озер Окутама и Констанце (Katano, Fukui, 2003; Ernst et а/., 2003), Synechococcus rubescens (сейчас СуапоЫит rubescens) и клону MW15-2 пикоцианобактерии субальпийского озера (Crosbie et ah, 2003). Клоны 9 (Хубсугул) и 3 (Байкал) являются индивидуальными и лежат в кладе, образованной некультивируемыми цианобактериями Р 38-23, MW32B5 и MW38B3 из европейских озер. Также эту кладу дополняют представители р. СуапоЫит, Synechococcus из озера Бива. Клон 2 (Байкал) имеет следующих общих родственников - цианобактерия ARC-11 из озера Эри, клон из озера Мичиган и клон МН 301 из озера Мондси.
