Содержание к диссертации
ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования 14
1.1. Районы исследования, используемые пробоотборники 14
1.2. Методы химического анализа 20
1.3. Методы микробиологического анализа 21
1.4. Молекулярно-микробиологические методы исследования микроорганизмов: ПЦР, клонирование, секвенирование, гибридизация in situ
1.5. Измерение скоростей аэробных и анаэробных процессов 35
ГЛАВА 2. Литературный обзор 36
ГЛАВА 3. Донные осадки озера Байкал - среда обитания микроорганизмов
3.1. Геолого-геофизические характеристики, влияющие на деятельность микробных сообществ
3.2. Органическое вещество донных отложений озера Байкал 57
3.3. Газовый состав и газовые гидраты 60
3.4. Химический состав поровых вод осадков озера Байкал 77
ГЛАВА 4. Численность микроорганизмов в донных осадках Байкала
4.1. История исследования микрофлоры донных осадков на Байкале
4.2. Количественная характеристика культивируемых и некультивируемых микроорганизмов, обитающих в донных осадках
ГЛАВА 5. Аэробные процессы, осуществляемые микробными сообществами в донных осадках озера Байкал
5.1. Численность и активность микроорганизмов, осуществляющих аэробные процессы деструкции органического вещества
5.2. Нефтеокисляющие микроорганизмы в районах естественного выхода нефти: пространственное распределение, наличие генов алкангидроксилаз
5.3. Бактериальное окисление метана 144
5.4.Численность, морфология и таксономический состав метанотрофных бактерии в Байкале
5.5. Анализ аэробного метанотрофного сообщества озера Байкал, методом анализа фрагментов гена 16S рРНК и гена мембрансвязанной метанмонооксигеназы (ртоА)
ГЛАВА 6. Деятельность анаэробных микроорганизмов в донных отложениях озера Байкал: процессы ацетогенеза, сульфатредукции, метаногенеза
6.1. Численность анаэробных культивируемых микроорганизмов, участвующих в деструкции органического вещества в осадках озера Байкал
6.2. Микроорганизмы, осуществляющие процессы ацетогенеза и сульфатредукции
6.3. Скорости процесса метаногенеза в донных отложениях озера Байкал
6.4. О возможном анаэробном окислении метана в пресноводном Байкале
ГЛАВА 7. Микробные сообщества осадков в районах субаквальних разгрузок
7.1. Процессы и филогенетическая структура микробных сообществ в районах грязевых вулканов
7.2. Микробные маты в районе гидротермального подводного источника в Б. Фролиха
7.3. Микробные сообщества осадков, сформированных в различные временные периоды: голоцене и плейстоцене
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 278
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 282
Введение к работе
Актуальность исследований. Процессы круговорота углерода, серы, азота и других биогенных элементов тесно сопряжены с деятельностью микроорганизмов. Активность связанная с продукцией углекислого газа, метаногенезом, денитрификацией, сульфат-, и железоредукцией и продукцией жирных кислот зарегистрирована в морских и озерных осадках (Кузнецов, 1970; Заварзин, 1972; Ekendahl & Pedersen, 1994; Phelps et al., 1994; Krumholz et al., 1997; Wellsbury et al., 1997; Иванов, Каравайко, 2004; Parkes et al., 2005).
Движущей силой биосферных процессов является цикл углерода, а его весьма важной частью является цикл метана. Повышенный интерес к циклу метана инициирован несколькими открытиями. Исследования глубоководных гидротермальных источников и холодных сипов в приконтинентальных участках океана показали обилие уникальных организмов: трубчатых червей, креветок и гигантских серных бактерий (MacDonald et al., 1989; Fisher, 1990; Sahling et al., 2002; Boetius, Suess, 2004). В таких районах синтез органического вещества осуществляется микроорганизмами за счет энергии неорганических восстановленных соединений и углекислоты окружающей морской воды. Исследованиями последних лет на Байкале установлены многочисленные зоны субаквальных разгрузок (Гранин, Гранина, 2002; Клерке и др., 2003; Хлыстов, 2006), где в водную толщу озера поступают разнообразные углеводороды. Открытие гидротермального вента в б. Фролиха на Байкале показало наличие богатого сообщества представителей высших организмов - губок, хирономид, моллюсков, основой для жизнедеятельности которых является древний метан (Кузнецов, 1974; Grachev et al., 1994).
Есть еще один аспект, который инициирует исследование микроорганизмов круговорота углерода, как в мире, так и на Байкале, это открытие больших скоплений газовых гидратов (Кузьмин и др., 1998; Клерке и др., 2003). На настоящее время озеро Байкал является единственным пресноводным водоемом, где обнаружены значительные запасы гидратов метана. Каким образом поддерживается его баланс, и какие микроорганизмы
У участвуют в образовании и деструкции метана в ультрапресном водоеме, до сих пор оставалось неизвестным.
Следует отметить, что большая часть из перечисленных явлений нова для Байкала и не имеет аналогов в других пресноводных экосистемах, поэтому исследование микроорганизмов и процессов, происходящих в таких районах, имеет теоретическое значение.
Цели и задачи работы:
Целью данной работы было комплексное исследование микроорганизмов,
участвующих в круговороте углерода в донных осадках озера Байкал, различающихся геохимическими обстановками: в глубоководной зоне южной, средней и северной котловин, в районах грязевых вулканов, нефтепроявлений и подводного термального источника в б. Фролиха. Были поставлены следующие задачи.
1. Исследовать численность микроорганизмов, участвующих в деструкции органического вещества в донных осадках различных зон и районов озера Байкал.
2. Изучить с помощью радиоактивно-меченных субстратов скорости процессов деструкции органического вещества и выявить ключевые для донных осадков озера Байкал процессы.
3. Изучить микробные сообщества в районах субаквальных разгрузок: грязевые вулканы, подводный термальный источник в б. Фролиха (Северный Байкал).
4. Установить филогенетическое положение байкальских микроорганизмов
из этих районов по данным анализа гена 16 S рРНК и провести сравнение со структурами пресноводных и морских последовательностей.
5. Оценить возможность существования процесса анаэробного окисления метана в ультрапресном водоеме.
6. На основе анализа структуры гена 16 S рРНК исследовать сообщества микроорганизмов в донных осадках, сформированных в различные временные периоды.
Научная новизна работы: Впервые для исследования микроорганизмов обитающих в осадках Байкала, применен комплексный подход, который включает одновременное изучение физико-химических, геохимических и молекулярно-микробиологических параметров в одних и тех же образцах воды и донных осадков. С использованием данного подхода охарактеризована количественная структура микроорганизмов в разных слоях осадков с учетом экологических условий и времени их формирования. Исследование распространения различных видов аэробных и анаэробных, автотрофных и гетеротрофных, психрофильных, мезофильных и термофильных бактерий показало, что их количество определяется конкретными условиями: наличием кислорода, необходимых для их жизнедеятельности биогенных элементов. Выделены доминирующие в определенных биотопах группы микроорганизмов, оценен их вклад в процессы круговорота углерода и других биогенных элементов.
Впервые проведены масштабные измерения скоростей процессов деструкции органического вещества в донных осадках озера Байкал, в том числе в районах грязевых вулканов и гидротермального вента. Установлено, что на конечных этапах деструкции органического вещества в донных осадках озера Байкала преобладает метаногенез, в большинстве осадков озера Байкал скорость этого процесса значительно превышает сульфатредукцию. При этом большая часть органического вещества используется для синтеза метана. И только в местах поступления антропогенного органического вещества и сульфатов скорость восстановления сульфатов опережает процесс метаногенеза. Поэтому увеличение численности и активности сульфатредукторов в донных осадках отдельных районов озера Байкал может служить индикатором экологического неблагополучия.
Показано, что наиболее интенсивно процессы деструкции осуществляются в местах поступления и концентрации органического вещества. К ним относятся поверхностные слои осадков, куда из фотических слоев водной толщи поступают остатки фитопланктона, и прибрежные районы, особенно приустьевые участки, куда с терригенным и речным сносами поступает значительное количество растительного опада и других органических веществ. Впервые в районе гидротермального вента в бухте Фролиха (Северный Байкал) исследованы микробные сообщества - микробные маты, основу которых составляют бесцветные серные бактерии рода Thioploca. Получены первые данные по их распространению, экофизиологии и филогенетическом положении.
Впервые с помощью комплекса радиоизотопных, микроскопических, молекулярно-биологических методов исследованы микробные сообщества в районах приповерхностного залегания газовых гидратов, оценена филогенетическая структура сообществ в разных слоях осадка. Биогеохимические данные показывают, что основой сгущения жизни в районах субаквальных разгрузок является деятельность метаногенных, метаноокисляющих и бесцветных серных бактерий, использующих энергию восстановленных газов. Установлено, что в районах поступления флюидов микроорганизмы формируют своеобразный биологический фильтр, препятствуя поступлению сероводорода, метана и других соединений из донных осадков в водную толщу.
Впервые в пресноводном озере с использованием молекулярных методов исследовано сообщество микроорганизмов, ассоциированное с газовыми гидратами. На основе сравнительного анализа фрагментов гена 16S рРНК установлено, что в осадках преобладают некультивируемые формы бактерий, имеющие низкую степень гомологии со структурами в мировой базе данных. Выявлено, что байкальские последовательности образуют отдельные кластеры, которые могут свидетельствовать о наличии эндемичных бактерий. В районе повышенных концентраций метана с помощью электронной трансмиссионной микроскопии обнаружено большое количество морфологически разнообразных форм бактерий, спор и цист. Наличие внутри клеток внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ) позволило идентифицировать их как метанотрофные бактерии. Эти результаты подтверждены данными сравнительного анализа функциональных генов-метанмонооксигеназ, присущих метанотрофным бактериям. Впервые исследовано разнообразие архей в донных осадках озера Байкал, установлено наличие последовательностей, относящихся к царствам Crenarchaeota и Euryarchaeota. Основные защищаемые положения диссертации.
1. Распределение и структура сообществ микроорганизмов в донных отложениях озера Байкал определяются химической обстановкой, спектром органических субстратов и наличием субаквальных разгрузок углеводородсодержащих флюидов.
2. В процессе деструкции органического вещества микроорганизмами в донных осадках озера Байкала значительная его часть идет на образование метана. Окисление метана осуществляется аэробными метанотрофами в придонной воде и поверхностном слое осадков, анаэробное окисление возможно лишь в зонах субаквальных разгрузок минерализованных флюидов.
3. В местах субаквальных разгрузок газонасыщенных флюидов на дне Байкала формируются особые микробные сообщества, использующие энергию восстановленных газов для образования органического вещества. Изотопный состав углерода в бентосных организмах и органическом веществе осадков свидетельствует о вовлечении глубинного метана в круговорот углерода.
4. Совокупность молекулярно-биологических данных позволяет утверждать, что байкальские микроорганизмы являются эндемичными, поскольку их подавляющее большинство не имеет близких аналогов в мировой базе данных. Байкал мог быть, и по-видимому, продолжает оставаться потенциальным резервуаром микроорганизмов, способных при благоприятных условиях, завоевывать новые экологические нишы. Практическая значимость. Для микробиологических исследований
донных отложений озера Байкал адаптированы и внедрены молекулярные методы. Создана автоматизированная система подсчета бактерий, которая апробирована и используется при проведении мониторинговых работ в Южном Байкале.
Проведенные исследования скоростей образования и деструкции метана необходимы для оценки его вклада в общий круговорот углерода, а также оценки потока поступления из донных осадков в водную толщу и в атмосферу. Эти результаты будут полезны для прогноза возможности катастрофических выбросов метана в водную толщу. Данные по распределению различных видов микроорганизмов, в том числе метанотрофных, могут быть использованы в качестве индикаторных показателей мест разгрузки метана и мониторинга деятельности микроорганизмов.
Создан банк данных байкальских последовательностей фрагментов гена 16S рРНК и гена рток метанотрофных бактерий, включающий 430 последовательностей, 92 из них зарегистрированы в EMBL-банке данных. Полученные нуклеотидные последовательности могут служить основой для конструирования зондов для гибридизации, что позволит проводить количественную оценку структуры микробного сообщества донных осадков озера Байкал и оценивать качество его вод.
Личный вклад соискателя. В цикле исследований, входящих в диссертационную работу, соискателю принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, использовании методических и экспериментальных подходов, а также в обобщении полученных материалов. Автор принимал непосредственное участие во всех экспедициях, результаты которых вошли в диссертацию. В работах, выполненных в соавторстве, вклад соискателя заключался в постановке научных задач, в непосредственном участии в получении материалов и участии на всех этапах исследований, а также в их обсуждении и подготовке публикаций. Диссертантом сформировано направление, основанное на комплексном подходе исследования микробных сообществ с использованием микробиологических, молекулярных, физико-химических методов.
Исследования были выполнены в рамках планов НИР Института «Механизмы диагенеза байкальских осадков: микробиальные и геохимические процессы» (2001-2003 гг.), «Разработка и апробация комплексной системы химического, биологического и дистанционного мониторинга экологической системы озера Байкал, прогноз состояния экосистемы на ближайшее десятилетие» (2004-2006 гг.), а также при поддержке грантов РФФИ-Байкал № 97-04-96206 и 97-04-96270, РФФИ № 97-04-485, 01-05-97256, 03-05-65289, № 05-05-65291, Интеграционных проектов СО РАН №147 «Природные и синтетические газовые гидраты», №58 «Углеводороды Байкала и роль архей и других микроорганизмов в их деградации и образовании», программ Президиума РАН: №13 «Изменения окружающей среды и климата: природные катастрофы», проект «Исследование биологических сообществ барьерных зон, обеспечивающих формирование чистых вод Байкала и ограничивающих проникновение чужеродных видов»; №18 «Происхождение и эволюция биосферы», проект «Исследование механизмов функционирования микробных сообществ барьерных зон, как основного фактора динамической устойчивости экосистемы озера Байкал».
Апробация работы. Материалы и основные положения диссертации докладывались на российских и международных конференциях: на I (1989), II (1995), III (2000) и IY (2005) верещагинских байкальских конференциях, на конференции НАТО «Байкал - природная лаборатория для исследования изменений окружающей среды и климата» (Иркутск, 1994); на семинаре Института морской микробиологии Макса Планка (Бремен, 2000), на III и IY международных симпозиумах "Ancient Lakes: Speciation, Development in Time and Space, Natural History" (SIAL III), (Иркутск, 2002), (SIAL IY) (Берлин, 2006), на всероссийской конференции «Биоразнообразие и функционирование микробных систем Центральной Азии», Улан-Удэ, 2003; на международном симпозиуме «Газовые гидраты в экосистеме Земли», 2003; международном симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» (Иркутск, 2003); на 1st FEMS Congress of European Microbiologists, Slovenia (Ljubljana, 2003); на XV Международной школе морской геологии (Москва, 2003); международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы» (Новосибирск, 2005).
Публикации: Основные материалы диссертации опубликованы в 105 публикациях, в том числе 1 монография, 25 статей в рецензируемых журналах, 3 авторских свидетельства, 77 публикаций в сборниках и материалах конференций.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному консультанту д.б.н. Б.Б. Намсараеву.
Автор искренне признателен ак. М.А. Грачеву за его постоянную поддержку, дельные советы, идеи и обсуждение результатов работы на всех этапах ее выполнения. Автор благодарит сотрудников Института профессора СИ. Беликова, д.б.н. Е.В. Лихошвай за помощь на завершающем этапе выполнения работы. Огромное спасибо зав. лаб. водной микробиологии к.б.н. В.В. Парфеновой, профессору В.В. Дрюккеру, Шубенковой О.В., Черницыной СМ., Павловой О.Н., Косторновой Т.Я., и другим, за разностороннюю поддержку и помощь в сборе материалов. Отдельное спасибо О. М. Хлыстову, без участия, которого эта работа навряд бы была выполнена.
Автор выражает глубокую признательность сотрудникам лаб. гидрохимии и химии атмосферы Т.П. Погодаевой, Л.П. Голобоковой, лаб. палеоклиматологии СС Воробьевой, Е.П. Чебыкину, А.Г. Горшкову, сотрудникам лаб. водных беспозвоночных д.б.н. О.А. Тимошкину, В.И. Провиз.
Автор выражает глубокую признательность сотрудникам лаборатории микробиологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН О.П. Дагуровой, С. Бурухаеву и всем остальным, за поддержку и помощь в сборе материала для диссертации. Автор искренне благодарен сотруднику Институт океанологии РАН А.В. Егорову за конструктивные дискуссии и помощь в сборе и обработке материала для диссертации, а также сотрудникам Института микробиологии РАН Г.А. Дубининой и Н.М. Дульцевой за обсуждение полученных материалов. Работа выполнена в тесном сотрудничестве с зарубежными учеными, и автор выражает благодарность проф. Э Ваде, X. Шоджи, Я. Клерксу, М. Батисту, Бо Б. Иергенсу, Р. Амману, Е.Ф. Зайчикову и др.
Автор выражает глубокую признательность команде НИС «Верещагин» и капитанам О.Г. Калинину и А.В. Священкову за помощь в отборе материалов.
Автор благодарит всех сотрудников Лимнологического института СО РАН, чью поддержку и внимание автор чувствовал постоянно.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения и 7 глав, списка литературы, содержащего 406 источников, в том числе на иностранном языке -210. Диссертация изложена на 330 стр., содержит 50 текстовых таблиц, иллюстрирована 69 рисунками и фотографиями.
