Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Межбактериальные взаимодействия и их роль в формировании биоценозов тела человека (обзор литературы) 12
ГЛАВА 2. Материалы и методы 29
2.1. Характеристика исследуемого материала 29
2.2. Методика исследования микробного биоценоза слизистой оболочки миндалин 30
2.3. Методы изучения факторов патогенности, чувствительности к антибиотикам 31
2.4'. Методика изучения факторов патогенности в условиях межбактериальных взаимодействий 34
2.5. Методика изучения чувствительности к антибиотикам в условиях межбактериальных взаимодействий 39
2.6. Методы статистической обработки 44
ГЛАВА 3. Микрофлора слизистой оболочки миндалин здоровых людей и больных хроническим тонзиллитом (таксономия, распространенность биологических свойств) 46
3.1. Таксономическое разнообразие микробных биоценозов 46
3.2. Распространенность факторов патогенности среди представителей микрофлоры слизистой оболочки миндалин 50
3.2.1. Распространенность отдельных факторов патогенности 50
3.2.2. Распространенность комплекса факторов патогенности среди представителей микрофлоры слизистой оболочки миндалин в норме и при хроническом тонзиллите 55
3.3. Чувствительность к антибиотикам 61
3.3.1. Чувствительность к антибиотикам различных таксонов 61
3.3.2. Ассоциированная резистентность к антибиотикам 65
ГЛАВА 4. Распространенность факторов патогенности у возбудителей в монофлоре и в ассоциациях 70
ГЛАВА 5. Модификация биологических свойств микроорганизмов в условиях межбактериальных взаимодействий in vitro 74
5.1. Модификация факторов патогенности при межбактериальных взаимодействиях ... 74
5.1.1. Модификация факторов патогенности при межбактериальных взаимодействиях разных таксонов 74
5.1.2. Модификация факторов патогенности при взаимодействии условно-патогенных видов микроорганизмов, с учетов выделения их из биоценозов, содержащих золотистый стафилококк или свободных от него 81
5.1.3. Модификация факторов патогенности при взаимодействии штаммов золотистого стафилококка между собой 93
5.1.4. Модификация факторов патогенности при взаимодействии штаммов условно-патогенных микроорганизмов и золотистого стафилококка 95
5.2. Модификация резистентности к антибиотикам при
межбактериальных взаимодействиях 103
5.2.1. Модификация резистентности к антибиотикам при межбактериальных взаимодействиях разных таксонов 103
5.2.2. Модификация антибиотикорезистентности при взаимодействии микроорганизмов с учетов выделения их из биоценозов, содержащих золотистый стафилококк или свободных от него... 106
5.2.3. Модификация резистентности к антибиотикам при взаимодействии штаммов золотистого стафилококка 112
5.2.4. Модификация резистентности к антибиотикам при взаимодействии условно-патогенных видов микроорганизмов и золотистого стафилококка 113
ГЛАВА 6. Практическое использование данных о характере межбактериальных взаимодействий в биоценозе слизистой оболочки миндалин 122
6.1. Микробиологические критерии диагностики хронического тонзиллита 122
6.2. Микробиологические критерии выбора антибиотика для элиминации возбудителя из биоценоза слизистой оболочки миндалин 128
Заключение 136
Выводы 146
Список литературы 148
Приложение 168
- Методика исследования микробного биоценоза слизистой оболочки миндалин
- Таксономическое разнообразие микробных биоценозов
- Модификация факторов патогенности при межбактериальных взаимодействиях
- Микробиологические критерии диагностики хронического тонзиллита
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Организм человека — экологическая ниша для множества разнообразных микроорганизмов, которые в норме заселяют его биотопы [102]. Микробиоценозы тела человека представляют собой сложные системы, отличающиеся многокомпонентностью и количественным разнообразием. Общепризнано, что в процессе эволюции при взаимодействии организма хозяина с окружающими его микроорганизмами произошел отбор определенных видов микробов, способных к прикреплению и колонизации слизистых оболочек соответствующих экологических ниш и использующих организм хозяина как новую среду обитания. Так сформировались симбиотические ассоциации, составляющие нормальную микрофлору человека и животных [18].
Совершенно очевидно, что в природе не существует так называемых чистых биосистем и подавляющее большинство явлений, наблюдаемых в естественных условиях, является результатом эволюционно сложившихся форм существования различных ассоциаций [31]. Широкое распространение микроорганизмов, существование в близких территориальных границах, конкуренция за питательные ресурсы, борьба за сохранение вида - все это неизбежно приводит к тесному взаимодействию биологических существ во всем многообразии их проявлений [7].
Среди ассоциаций многочисленны примеры симбиотических форм взаимоотношений двух и более микроорганизмов разных видов, при которых создаются взаимовыгодные условия, и ассоцианты совместно участвуют в регуляции отношений с внешней средой [14]. Периодический анализ и осмысление на новом уровне многочисленных проявлений ассоциаций позволяют выяснить патогенез ряда инфекционных заболеваний различной этиологии или правильно оценить происхождение тех или иных аномалий в структуре микроорганизмов, приводящих к изменению их типичных свойств
(например, изменению специфического клеточного тропизма), или проявлению совершенно новых необычных биологических свойств (например, возникновение химерных фенотипических антигенных вариантов у вирусов) [78]. Бактерии не остаются безучастными к антибактериальному воздействию на них ассоциантов, а так же к различным изменениям условий существования. Они адаптируются к ним, изменяя свои свойства и, прежде всего, обменные процессы. В результате этих изменений происходит образование устойчивых к антибактериальному воздействию форм, отличных от исходной культуры по своим морфологическим, биохимическим, антигенным и другим свойствам. Образование таких устойчивых форм наблюдается как в лабораторных условиях, так и в условиях естественного роста и является выражением приспособления бактерий к условиям внешней среды [71].
При изучении ассоциаций микроорганизмов решаются две проблемы. С одной стороны, оцениваются механизмы межмикробных взаимодействий в микросистемах и их роль в формировании биоценозов. С другой стороны, взаимодействия микроорганизмов-представителей одного биотопа, используются как инструмент для решения прикладных задач медицины и биологии [102].
Особенности межмикробных взаимодействий могут существенно влиять на формы и течение инфекционного процесса. Возбудители при ассоциированной инфекции чаще характеризовались антибиотикорезистентностью, антилизоцимной активностью [142], адгезивной, гемолитической, антилизо-цимной, антиинтерцидной, лецитовителлазной, ДНК-азной активностями [1]. В то же время, межбактериальные взаимодействия как один из механизмов формирования ассоциаций микроорганизмов при микст-инфекциях, изучены недостаточно.
На слизистой оболочке миндалин обнаружены ассоциации стафилококков [123, 132, 133], пептострептококков, условно- и облигатно-патогенных бактерий [9, 10, 99] и дрожжеподобных грибов рода Candida [40, 68, 100]. Условно-патогенные микроорганизмы представители микрофлоры
миндалин характеризуются наличием факторов патогенности (АЛА, ЛА, АИА, АКрА) [39] и множественной лекарственной устойчивостью [156, 168]. Микрофлора слизистой оболочки миндалин чувствительна к различного рода воздействиям на организм в целом [32, 51, 76, 117] и может служить индикатором общего состояния макроорганизма.
Изменения в проявлении патогенных свойств представителями микрофлоры миндалин с учетом их симбиотических связей изучены недостаточно. Вместе с тем данные об изменчивости биологических свойств микробов-ассоциантов могут быть использованы как критерии для диагностики патологического процесса и выбора антибактериального препарата для элиминации возбудителя из микробиоценоза.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ, Целью настоящего исследования явилось изучение межбактериальных взаимодействий на слизистой оболочке миндалин и оценка возможности их клинико-лабораторного использования.
Для реализации этой цели были поставлены следующие ЗАДА ЧИ:
Изучить распространенность комплекса факторов патогенности и анти-биотикорезистентности у микроорганизмов, выделенных со слизистой оболочки миндалин, с учетом состояния биоценоза, а также ассоциации возбудителей.
Разработать методы исследования факторов патогенности и антибиотико-резистентности при межбактериальных взаимодействиях.
Выявить особенности проявления факторов патогенности и антибиотико-резистентности при межбактериальных взаимодействиях в биоценозе здоровых и больных хроническим тонзиллитом.
Предложить методические подходы к диагностике хронического тонзиллита и выбору антибиотика для эффективной элиминации возбудителя с учетом межбактериальных взаимодействий на слизистой оболочке миндалин.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Установлено, что тонзиллярная микрофлора больных, по сравнению со здоровыми, чаще обладает комплексом факторов патогенности (гемолитической, лецитовителлазной, лизоцимной и антилизо-цимной активностями) и антибиотикорезистентностью. Показано, что возбудители в монокультуре реже, чем в ассоциациях проявляют факторы патогенности и резистентность к двум и более антибиотикам. Разработаны методы исследования биологических свойств бактерий при межбактериальных взаимодействиях. Обнаружена разнотипная направленность модификации факторов патогенности и антибиотикорезистентности в зависимости от видовых характеристик бактерий-симбионтов и состояния микробного биоценоза. Выявлено, что в парах «патоген-индиген» и «индиген-индиген», выделенных от больных, наблюдается взаимное усиление патогенности и антибиотикорезистентности, тогда как в биоценозах здоровых людей и стафилококковых бактерионосителей взаимодействия между симбионтами носят индифферентный характер.
Предложен методический ключ, основанный на оценке функциональных особенностей индикаторных пар бактерий-симбионтов, открывающий новые подходы к диагностике и терапии заболеваний с учетом межбактериальных взаимодействий. Использование нового методического подхода позволило разработать способ диагностики хронического тонзиллита (патент РФ на изобретение №2188422 от 27 августа 2002 года) и способ выбора эффективного антибиотика для элиминации возбудителя хронического тонзиллита из биоценоза слизистой оболочки миндалин (решение о выдачи патента РФ на изобретение от 5 января 2004 года по заявке №2002125475/13 от 20.09.2002).
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Полученные в работе данные расширяют представления о функциональной активности при межбактериальных взаимодействиях представителей микрофлоры слизистой оболочки миндалин в норме и при хроническом тонзиллите.
Практическое значение работы определяется разработкой методов изу-
чения модификации факторов патогенности и антибиотикорезистентности при межбактериальных взаимодействиях. Разработанные методические приемы могут быть использованы для диагностики и лечения хронического тонзиллита, а также при проведении экспериментальных исследований сим-биотических взаимоотношений бактерий.
Издано информационно-методическое письмо ГУ ЗО Оренбургской области «Микробиологические основы диагностики хронического тонзиллита» (Оренбург, 2003).
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Возбудители в ассоциации и условно-патогенные микроорганизмы в биоценозе миндалин больных хроническим тонзиллитом чаще характеризуются проявлением комплекса факторов патогенности и антибиотикорези-стентностью, по сравнению с микрофлорой здоровых лиц.
Направленность эффекта модификации биологических свойств зависит от вида бактерий-симбионтов и состояния микробиоценоза (нормоценоз, па-тоценоз). Микроорганизмы, выделенные из патоценоза, в условиях межбактериальных взаимодействий чаще оказывают синергидное влияние на проявление факторов патогенности и формирование антибиотикорезистентности, тогда как симбиотические взаимодействия тонзиллярной микрофлоры от здоровых носят индифферентный характер.
Предложен новый методический подход для диагностики патологического процесса и выбора антибиотика с целью элиминации возбудителя из биоценоза, основанный на оценке особенностей межбактериальных взаимодействий в индикаторных парах штаммов-симбионтов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы доложены и обсуждены на: областной конференции оториноларингологов, посвященной 100-летию со дня рождения А.О. Шульги (Оренбург, 2000); на 54-й, 55-й и 56-й конференциях СНО ОГМА (Оренбург, 1999; 2000; 2001); третьей Российской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2000); П-м Международном конгрессе по оториноларингологии, аллергологии, эндоскопиче-
ской и лазерной хирургии (Греция, Афины, 2001); итоговой Всероссийской научной студенческой конференции (Москва, 2002); четвертой Российской конференции с международным участием «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2003); научной конференции по итогам работы в рамках программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (Москва, 2003).
Материалы работы были представлены в 2001 году на Всероссийский конкурс научно-исследовательских работ студентов (Медаль Министерства образования РФ). Результаты диссертационного исследования экспонировались на областной выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2003 (Оренбург, 2003) и на областной выставке «Наука - сельскому хозяйству» (Оренбург, 2003).
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе патент РФ на изобретение №2188422 от 27 августа 2002 года.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, приложение. Указатель литературы содержит 151 отечественный и 33 зарубежных источника литературы. Текст иллюстрирован 21 таблицей и 27 рисунками.
СВЯЗЬ РАБОТЫ С НАУЧНЫМИ ПРОГРАММАМИ. Диссертационное исследование является фрагментом научно-исследовательской работы «Межбактериальные взаимодействия и их роль в формировании микробных биоценозов тела человека», проводимой в рамках темы открытого плана НИР ИКиВС УрО РАН «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела человека» (№ гос.регистрации 01.2.00 104756) и программы Президиума Российской академии наук «Фундаментальные исследования — медицине, 2003». Исследования поддержаны грантом Президиума УрО РАН для молодых ученых и аспирантов УрО РАН.
Методика исследования микробного биоценоза слизистой оболочки миндалин
У выделенных штаммов микроорганизмов изучали факторы патогенности: плазмокоагулазную, гемолитическую, лецитовителлазную, лизоцимную и антилизоцимную активности.
Реакция на наличие у микроорганизма фермента плазмокоагулазы определялась путем посева суточной агаровой культуры в 0,5 мл разведенной 1:5 цитратной плазмы. Результаты реакции регистрировали через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации проб в термостате при температуре 37С. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка свидетельствовало о наличии у изучаемого штамма плазмокоагулазной активности.
Гемолитическую активность (способность вызывать гемолиз эритроцитов) оценивали на кровяном агаре, содержащем 5% отмытых стерильным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитов человека, по полному просветлению среды вокруг колоний (стафилококки и Р-гемолитические стрептококки) и неполному гемолизу в виде полупрозрачной зоны зеленоватого оттенка (а-гемолитические стрептококки).
Лецитовителлазная активность (способность разрушать лецитови-теллин яичного желтка) обнаруживалась при посеве испытуемых микроорганизмов на 20% желточно-солевой агар по образованию вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком.
Лизоцимная активность определялась путем посева исследуемой культуры микроорганизма на питательную среду, в которую предварительно вносили 0,1 мл 1 млрд. взвеси суточной агаровой культуры Micrococcus luteus (lysodeikticus) АТСС 15307 (ГИСК им. Тарасевича). Мутность взвеси соответствовала 10 ед. оптического стандарта мутности БАК-10. После инкубации при 37С в течение суток лизоцимную активность определяли по зоне лизиса индикаторного штамма вокруг изучаемых колоний.
Антилизоцимную активность изучали по методике О.В. Бухарина с соавт. [75]. Для этого к 1,5% питательному агару добавляли различные дозы яичного лизоцима (от 1 до 5 мкг) и разливали в чашки Петри. После застывания среды на подсушенную поверхность наносили каплю 1 млрд. взвеси суточной агаровой культуры изучаемого микроорганизма. Чашки инкубировали в термостате при 37С 24 часа, после этого выросшие колонии подвергались обработке парами хлороформа в течение 20 минут, затем наслаивался слой 0,7% питательного агара с 0.1 мл 1 млрд. взвеси суточной агаровой культуры Micrococcus luteus (lysodeikticus) АТСС 15307 (ГИСК им. Тарасевича). Учет проводился по наличию зоны роста микрококка вокруг тех штаммов, которые нейтрализовали внесенный в слой агара яичный лизоцим. Антилизоцимную активность выражали в мкг инактивированного в среде лизоцима.
Бактериоциногения, характеризующая экологическую активность изучаемого штамма в микробиоценозе, изучалась по методу Мюррея-Шервуда в модификации Б.Я. Усвяцова [138]. Для этого готовили 1 млрд. взвеси всех исследуемых штаммов, выделенных из одного микробиоценоза, в стерильном физиологическом растворе. 0,1 мл взвеси культуры штамма-симбионта засевали в плотную питательную среду на чашке Петри. После подсушивания, на поверхность среды наносили в виде капель 1 млрд. взвесь суточной агаровой культуры исследуемого штамма. Через 24 часа инкубации при 37С проводили учет активности штаммов по наличию зоны задержки роста штамма-симбионта вокруг выросших колоний исследуемой культуры.
Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам использовался диско-диффузионный метод согласно «Методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам» /МЗ СССР 10.03.83 №2675-83/. На поверхность подсушенной питательной среды в чашке Петри наносили 1 мл взвеси исследуемой культуры, равномерно распределяли путем покачивания и удаляли избыток пипеткой. Посевы подсушивали при комнатной температуре 10-15 минут. Диски с антибиотиками промышленного производства (ТУ 9398-001-39484474-00 «Диски индикаторные картонные с противомикробными лекарственными средствами ДИ-ПЛС-50-01», производитель ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии» С.-Петербург) накладывали стерильным пинцетом на равном расстоянии друг от друга и на 2 см от края чашки. Исследовалась чувствительность выделенных из исследуемого материала микроорганизмов к наиболее части применяемым в практической медицине антибиотикам: окса-циллину, ампициллину, ванкомицину, клиндамицину, левомицетину, эритромицину, гентамицину. Чашки с посевами инкубировали 18-20 часов при t=37C. В процессе инкубации антибиотик диффундировал в агар и влиял на рост исследуемой культуры. Оценку результатов определения чувствительности бактерий к антибиотикам диско-диффузионным методом проводили по унифицированным таблицам, учитывая различия в диаметрах зон задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками.
Таксономическое разнообразие микробных биоценозов
Изучение таксономической структуры микробиоценоза любой экониши является одним из важнейших разделов ее микроэкологической характеристики. Исходя из этого, целью данного этапа исследований явилось изучение видового разнообразия представителей микрофлоры слизистой оболочки миндалин в норме и при патологии.
Всего выделено из биоценоза здоровых лиц 229 штаммов микроорганизмов, из биоценоза больных лиц - 226 штаммов микроорганизмов. Показа-тели микробной обсемененности изменялись в пределах 10-10 КОЕ/тампон в биоценозе здоровых и 5x105-108 КОЕ/тампон в биоценозе больных лиц.
Как видно из таблицы 1 и рисунка 11, микрофлора слизистой оболочки миндалин была представлена 8 родами микроорганизмов. В биоценозе здоровых людей, по сравнению с больными, чаще встречались штаммы рода Streptococcus (40,2% против 26,1%, при р 0,05). От больных хроническим тонзиллитом в большем проценте случаев, по сравнению со здоровыми, выделялись микроорганизмы родов Staphylococcus (54,9% против 44,1%, при р 0,05), Klebsiella и Neisseria (3,5%) против 0,8%, при р 0,05). Штаммы рода Enterobacter встречались только в биоценозе больных лиц (1,3%).
В дальнейшем был проанализирован видовой состав биоценозов (таблица 1). Установлено, что основными видами индигенной микрофлоры здоровых людей были Streptococcus mutans, S.mitis, S.salivarius, S.sanguis.
Стафилококковая флора формировалась за счет присутствия в биоценозе золотистого стафилококка и коагулазоотрицательных стафилококков различных видов. В 6,6% случаев от здоровых лиц высевались штаммы S.aureus, что позволило говорить о бактерионосительстве данного патогенного вида микроорганизмов здоровыми людьми. В биоценозе больных лиц в 10,6% случаев встречался золотистый стафилококк, в 1,3% - пиогенный стрептококк, который в норме не высевался.
Помимо истинных патогенных видов микроорганизмов, возбудителями хронической инфекции могли быть коагулазоотрицательные стафилококки, так как от обследованных больных лиц в 2 раза чаще высевался S.warneri (10,6% против 5,2%, при р 0,05), S.haemolyticus (6,2% против 4,8%) и S.epidermidis (7,1% против 3,5%). Некоторые виды кокков (S.schleiferi, S.mucilaginos, St.equorum, St.ferus), не высеваемые из данного биотопа здоровых, а так же отдельные штаммы энтерококков, энтеробактерий, нейссерий и клебсиелл были отнесены к случайной флоре из-за низкого процента встречаемости в эконише (0,4 - 2,2%). Представители родов Micrococcus и Aero-coccus встречались в биоценозе здоровых и больных людей в одинаковом проценте случаев, что позволяет судить о принадлежности их к индигенной флоре.
Для практики имеет существенное значение не только описание видового состава биоценоза, но и изучение роли тех или иных свойств микробов и их ассоциаций для организма. Широко распространенными среди бактерий, а потому изучаемыми в первую очередь, являются свойства, позволяющие микроорганизмам длительно персистировать в макроорганизме и поддерживать воспалительный процесс. К ним, прежде всего, относятся следующие факторы патогенности: гемолитическая, плазмокоагулазная, лецитовителлаз-ная, лизоцимная и антилизоцимная активности.
При изучении распространенности факторов патогенности у выделенной микрофлоры получены следующие результаты (рисунок 12).
Как видно из представленных данных, микрофлора слизистой оболочки миндалин больных хроническим тонзиллитом, по сравнению со здоровыми, характеризовалась более выраженной экспрессией гемолитической активности (61,5% против 37,5%, при р 0,05), лецитовителлазной активности (46,0% против 31,0%, при р 0,05), лизоцимной активности (38,1% против 25,8%, при р 0,05) и антилизоцимной активности (50,4% против 32,8%, при р 0,05). Тогда как плазмокоагулазная активность у микроорганизмов, выделенных из биоценоза здоровых и больных, проявлялась с одинаковой частотой (8,3% и 9,7% соответственно). Сравнительная оценка распространенности факторов патогенности среди представителей разных родов микроорганизмов дана в таблице 2.
Из всех таксонов микроорганизмов, штаммы стафилококков, выделенные от больных лиц, обладали более выраженной гемолитической (73,4% против 49,5% у здоровых, при р 0,05), лецитовителлазной (69,4% против 53,5% у здоровых, при р 0,05), лизоцимной (49,2% против 26,7% у здоровых, при р 0,05) и антилизоцимной (53,2% против 36,6% у здоровых, при р 0,05) активностями. Представители рода Streptococcus, выделенные от здоровых и от больных людей, проявляли ГА, ЛА и АЛА с одинаковой частотой (25,0%; 23,9%; 25,0% у здоровых и 32,2%; 20,3%; 39,0% у больных, соответственно). Микроорганизмы родов Aerococcus, выделенные от больных, чаще по сравнению со здоровыми, обладали гемолитической (88,2% против 45,5% р 0,05)
Модификация факторов патогенности при межбактериальных взаимодействиях
При изучении распространенности факторов патогенности у выделенной микрофлоры получены следующие результаты (рисунок 12).
Как видно из представленных данных, микрофлора слизистой оболочки миндалин больных хроническим тонзиллитом, по сравнению со здоровыми, характеризовалась более выраженной экспрессией гемолитической активности (61,5% против 37,5%, при р 0,05), лецитовителлазной активности (46,0% против 31,0%, при р 0,05), лизоцимной активности (38,1% против 25,8%, при р 0,05) и антилизоцимной активности (50,4% против 32,8%, при р 0,05). Тогда как плазмокоагулазная активность у микроорганизмов, выделенных из биоценоза здоровых и больных, проявлялась с одинаковой частотой (8,3% и 9,7% соответственно). Сравнительная оценка распространенности факторов патогенности среди представителей разных родов микроорганизмов дана в таблице 2.
Из всех таксонов микроорганизмов, штаммы стафилококков, выделенные от больных лиц, обладали более выраженной гемолитической (73,4% против 49,5% у здоровых, при р 0,05), лецитовителлазной (69,4% против 53,5% у здоровых, при р 0,05), лизоцимной (49,2% против 26,7% у здоровых, при р 0,05) и антилизоцимной (53,2% против 36,6% у здоровых, при р 0,05) активностями. Представители рода Streptococcus, выделенные от здоровых и от больных людей, проявляли ГА, ЛА и АЛА с одинаковой частотой (25,0%; 23,9%; 25,0% у здоровых и 32,2%; 20,3%; 39,0% у больных, соответственно). Микроорганизмы родов Aerococcus, выделенные от больных, чаще по сравнению со здоровыми, обладали гемолитической (88,2% против 45,5% р 0,05)
Примечание: ГА - гемолитическая активность; ЛецА - лецитовителлазная активность; КоА - плазмокоагулазная активность; ЛА - лизоцимная активность; АЛА - антилизоцимная активность, при р 0,05. и лизоцимной (52,9% против 9,1%, р 0,05) активностями. Штаммы микроорганизмов родов Micrococcus, Enterococcus, Enterobacter, Klebsiella, Neisseria, выделенные от здоровых проявляли факторы патогенности в 9,1-30,0% случаев. В организме больных представители условно-патогенных видов микроорганизмов данных родов в 2,5-3 раза чаще проявляли факторы патогенности, что предполагает их роль в патологии (возможно в ассоциации с патогенами).
Учитывая, что представители стафилококковой флоры высевались из биоценоза здоровых людей и больных хроническим тонзиллитом чаще других видов микроорганизмов, было изучено проявление факторов патогенности некоторыми видами стафилококков. Результаты представлены на рисунке 13.
Как видно из приведенных данных, штаммы S.aureus, выделенные от больных проявляли ГА в 87,5% случаев (тогда как в нормоценозе штаммы золотистого стафилококка обладали ГА в 53,3% случаев), ЛецА в 95,8% случаев (против 40,0%) в нормоценозе), АЛА в 66,7% случаев (против 46,7% у штаммов от здоровых). Штаммы S.warneri, выделенные от больных обладали ГА в 1,9 раз чаще по сравнению со штаммами, выделенными из нормоценоза (79,2%) случаев против 41,7%», р 0,05), ЛецА в 8 раз чаще (66,7% случаев против 8,3%), р 0,05), АЛА в 5 раз чаще (41,7% случаев против 8,3%, р 0,05). У других видов КОС (S.haemolyticus, S.epidermidis и др.) выделенных со слизистой оболочки миндалин больных, по сравнению со штаммами, высеянными от здоровых, обнаружена более высокая частота экспрессии ГА (67,1% против 50,0%, р 0,05), ЛА (46,0% против 22,9%, р 0,05) и АЛА (55,3% против 39,2%, р 0,05), что дает основания считать данный биоценоз нестабильным.
Микробиологические критерии диагностики хронического тонзиллита
Тонзиллярная патология является общемедицинской проблемой, так как последствия ее влияют на функции различных органов и систем организма. Актуальность и социальное значение данной проблемы определяется все возрастающим уровнем заболеваемости ангиной и хроническим тонзиллитом. По данным Минздрава РФ на 2001 год, среди взрослого населения распространенность хронического тонзиллита составляет 495,1 : 100 000; среди подростков 2749,7 : 100 000; среди детей от 0 до 14 лет 3106,6 : 100 000 населения соответствующего возраста [148].
Хронический тонзиллит является одним из наиболее частых неблагоприятных исходов повторных ангин, особенно если возникает через короткие промежутки времени, в течение которых организм не успевает полностью ликвидировать местные воспалительные изменения в миндалинах и нарушения в других органах [38, 94, 143]. Есть данные, что хронический тонзиллит может сформироваться и как первичное медленно прогрессирующее заболевание [67]. Выделяют безангинные формы хронического тонзиллита. Частота их составляет 3-7% среди всех больных хроническим тонзиллитом, а диагностика представляет большие трудности. Среди часто болеющих детей безангинные формы хронического декомпенсированного тонзиллита составляют 38,3% [35]. Клинических признаков воспаления небных миндалин при осмотре выявить не удается, но в ходе обследования выявляются сопутствую 123 щие заболевания - ревматизм, полиартрит, нефрит и другие, в этиопатогенезе которых немалая роль принадлежит очагам хронической инфекции [133].
Известен способ диагностики безангинных форм хронического тонзиллита, основанный на определении величины миграции лейкоцитов на поверхности небных миндалин под действием преднизолона [133]. Недостатком данного способа является его сложность т.к. проводится двукратный подсчет лейкоцитов под микроскопом в 16 больших квадратах, т.е. во всей камере Фукса-Розенталя. Кроме того, известный способ может быть использован у ограниченной группы людей, так как, из-за необходимости внутримышечного введения гормона преднизолона нежелательно его использование у детей.
Известен способ диагностики хронического тонзиллита путем сопоставления фарингоскопических признаков заболевания и общих его проявлений [95]. Согласно данному способу, для хронического тонзиллита характерно поступление из лакун гнойного содержимого, часто в виде жидкого гноя или казеозных гнойных пробок, нередко с запахом. Наличие данного признака всегда следует трактовать как хроническое воспаление миндалин. Однако отсутствие такого признака еще не доказывает, что хронического тонзиллита нет, так как содержимое из лакун может уходить при проглатывании пищи. Другим достоверным признаком хронического тонзиллита, согласно известному способу, считаются частые ангины в анамнезе в течение ряда лет (2-3 раза в год). Таким образом, к недостаткам способа также можно отнести длительность оценки (несколько лет). Кроме того, у 4 - 6 % больных хроническим тонзиллитом ангины могут отсутствовать.
Известен способ определения лецитовителлазной активности (ЛецА) у чистых культур микроорганизмов [124]. Данное свойство определяется для установления принадлежности микроорганизма к возбудителям заболеваний. Учитывается только наличие или отсутствие зоны помутнения среды вокруг культуры, измерение ширины этой зоны не проводится. В источниках патентной и научно-технической информации сведений о применении признака лецитовителлазной активности или ее модификации в условиях межмикробных взаимодействий для постановки диагноза хронического тонзиллита не обнаружено. Экспериментально установлено, что усиление ЛецА среди мик-робов-ассоциантов, выделенных из биоценоза миндалин больных, встречалось в несколько раз чаще, чем подобные изменения при взаимодействии культур, выделенных со слизистой оболочки миндалин здоровых людей. Анализируя полученные данные, пришли к выводу, что наиболее информативным свойством микроорганизмов для диагностики хронического тонзиллита, является усиление ЛецА в индикаторных парах золотистый стафило-кокк-коагулазоотрицательные стафилококки.
На основе полученных результатов предложены микробиологические критерии диагностики хронического тонзиллита. Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что предложенный способ диагностики хронического тонзиллита позволяет повысить точность диагностики и сократить ее сроки.
Способ осуществляется следующим образом (рисунок 25). Со слизистой оболочки миндалин выделяются чистые культуры S.aureus и КОС (S.warneri, S.hominis, S.haemolyticus и др.). Готовят взвеси суточных культур микробов-ассоциантов на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд. КОЕ/мл и проводят посев взвесей двух культур микробов-ассоциантов: культура №1 - S.aureus и культура №2 - выделенная культура коагулазоотрица-тельного стафилококка (если выделено несколько культур КОС, то проводят посев каждой культуры с S.aureus). Взвеси культур микробов-ассоциантов засевают на плотную питательную среду с 20% содержанием желточной взвеси. Посев осуществляется стандартной микробиологической петлей (диаметр 2 мм) согласно разработанному методу изучения межбактериальных взаимодействий (глава 2). Посевы инкубируются при t=37C в течение 24 часов.
