Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Ацетогенные бактерии . 10
1.1. Определение ацетогенных бактерий. 10
1.2. Автотрофний ацетил-КоА-путь ацетогенеза (путь Вуда-Льюнгдала). 12
1.3. Способы консервации энергии у хемотрофных анаэробных бактерий. 18
1.4. Консервация энергии у ацетогенов. Натриевый и протонный циклы. 19
ГЛАВА 2. Галофильные бактерии . 26
2.1. Типы галофильных бактерий. 26
2.2. Характеристика гиперсоленых экосистем. 26
2.3. Микробные сообщества гиперсоленых водоемов. 28
2.4. Стратегии выживания микроорганизмов в соленых и гиперсоленых местах обитания. 31
2.5. Применение галофильных микроорганизмов. 3 8
ГЛАВА 3. Алкалофильные бактерии . 39
3.1. Определение алкалофильных бактерий. х . 39
3.2. Происхождение содовых озер, их характеристика и ионный состав. 40
3.3. Содовые озера как возможные центры возникновения биоразнообразия в прошлом. 43
3.4. Микробные сообщества содовых озер и трофические взаимоотношения внутри них. 46
3.5. Особенности биоэнергетики алкалофилов. 54
Экспериментальная часть 59
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования . 59
4.1. Микроорганизмы, среды и условия культивирования. 59
4.2. Определение роста. 60
4.3. Аналитические определения. 60
4.4. Получение бесклеточных экстрактов и сферопластов. 62
4.5. Определение активности ферментов. 62
4.6. Определение внутриклеточных концентраций ионов Na+, К+ и С Г. 63
4.7. Фотометрические измерения светорассеивания клеток . 63
Результаты и их обсуждение
ГЛАВА 5. Описание Natroniella acetigena (штамм Z-79371) и Natronincola histidinovorans (штаммы Z-7939 и Z-79401).
5.1. Описание Natroniella acetigena (штамм Z-7937T).
5.2. Описание Natronincola histidinovorans (штаммы Z-'>'939 и Z-7940T).
ГЛАВА 6. Стратегии адаптации галофильных и галоалкалофильных ацетогенов к экстремальным условиям окружающей среды .
6.1. Изучение действия катионов и анионов на рост экстремально галофильной ацетогенной бактерии Acetohalobium arabaticum .
6.2. Определение внутриклеточных концентраций ионов Na+, К+ и СГ у Natroniella acetigena и Tindallia magadiensis.
6.3. Влияние солей на активность ключевых ферментов метаболизма галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий.
6.3.1. Свойства гидрогеназы экстремально галофильной ацетогенной бактерии Acetohalobium arabaticum.
6.3.2. Влияние солей на активности СО-дегидрогеназ (СО-ДГ) N. acetigena и Natr. histidinovorans.
6.3.3. Свойства гидрогеназы и СО-дегидрогеназы галотолерантной умеренно алкалофильной ацетогенной бактерии Т. magadiensis.
6.4. Влияние рН на активность ключевых ферментов алкалофильных ацетогенов.
ГЛАВА 7. Сравнительное изучение энергетического метаболизма галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий .
7.1. Исследование компонентов цепи переноса электронов у A. arabaticum.
7.2. Биоэнергетические аспекты ацетогенеза из разных субстратов у экстремально галофильной ацетогенной бактерии A arabaticum.
13. Биоэнергетика ацетогенеза алкалофильных ацетогенных бактерий N. acetigena, Natr. histidinovorans и Т. magadiensis.
7.3.1. Особенности биоэнергетики экстремально галоалкалофильных ацетогенов N. acetigena и Natr. histidinovorans.
7.3.2. Влияние ионофоров и ингибиторов на рост и синтез ацетата умеренно алкалофильного ацетогена Tindallia magadiensis.
Заключение
Выводы
Список литературы
- Автотрофний ацетил-КоА-путь ацетогенеза (путь Вуда-Льюнгдала).
- Содовые озера как возможные центры возникновения биоразнообразия в прошлом.
- Фотометрические измерения светорассеивания клеток
- Изучение действия катионов и анионов на рост экстремально галофильной ацетогенной бактерии Acetohalobium arabaticum
Введение к работе
Актуальность темы. Ацетогенные бактерии представляют собой группу облигатных анаэробов, использующих ацетил-КоА-путь Вуда-Льюнгдала как механизм для восстановительного синтеза ацетата из СОг, для накопления энергии и синтеза клеточного углерода. Они присутствуют повсеместно в аноксических местах обитания, играя важную роль в глобальном цикле углерода. В настоящее время известно около 100 видов из следующих 18 родов [Drake et al., 2002]: Acetitomaculum, Acetobacterium, Acetohalobium, Acetonema, Butyribacterium, Caloramator, Clostridium, Eubacterium, Holophaga, Moorella, Natroniella, Oxobacter, Ruminococcus, Sporomusa, Syntrophococcus, Thermoacetogenium, Thermoanaerobacter, Treponema. Ацетогены - филогенетически очень разобщенная группа бактерий, которые различаются по морфологии, по наличию, форме и локализации спор, по подвижности и типу жгутикования, по физиологическим и биохимическим характеристикам. Они имеют высокий биотехнологический потенциал как продуценты уксусной кислоты при анаэробных ферментациях углеводов или при восстановлении оксидов углерода. Ацетогенные бактерии являются метаболически гибкими анаэробами, и способны к трансформации разнообразных органических субстратов, таких как углеводы, спирты, органические кислоты, ароматические соединения, а также к использованию Нг и СОг, что определяет их участие в различных микробных сообществах. В процессе гетеротрофного роста АТФ может синтезироваться в достаточных количествах на уровне субстратного фосфорилирования. При автотрофном росте синтез ацетата из СОг, когда Нг является донором электронов, должен быть сопряжен с синтезом АТФ за счет электрон-транспортного фосфорилирования по хемиосмотическому механизму. Необходимым условием электрон-транспортного фосфорилирования является присутствие мембран-связанных переносчиков электронов и донорно-акцепторной системы, а также АТФ-синтазы. К началу наших исследований у ряда ацетогенов были найдены цитохромы, менахиноны и Fe-S-белки [Gottwald et al., 1975; Yang et al., 1980; Elliott and Ljungdahl, 1982; Hugenholtz and Ljungdahl, 1989]. Показано, что ключевые ферменты ацетил-КоА-пути -гидрогеназа, СО-дегидрогеназа/ацетил-КоА-синтаза и формиатдегидрогеназа - являются мембран-связанными [Ljungdahl, 1994]. АТФ-синтаза FiFo-типа была подробно изучена у Moorella thermoacetica [Mayer etal., 1986]. Thermoanaerobacter kivui, Ruminococcus productus и Acetobacterium woodii отличаются от других исследованных ацетогенов зависимостью от Na+ для метаболической активности [Geerligs et al., 1989; Heise et al., 1989; Yang and Drake, 1990]. Однако, физиология, биохимия и энергетический метаболизм ацетогенов из экстремальных мест обитания не изучены, поскольку такие местообитания до последнего
времени не исследовались в достаточной степени на наличие процессов ацетогенеза и соответствующих микроорганизмов.
Исследование микробных сообществ из экстремальных мест обитания представляет большой интерес с естественно-научной точки зрения для понимания функционирования биосферы прошлого. В связи с этим в лаборатории микробных сообществ ИНМИ РАН было исследовано галофильное микробное сообщество из цианобактериальных матов лагун Арабатской стрелки, расположенных на восточном побережье озера Сиваш. В результате был выделен ряд первичных и вторичных анаэробов, участвующих в разложении органического вещества, среди которых - первый представитель галофильных ацетогенов Acetohalobium arabaticum, способен развиваться в области солености от 10 до 25 % [Жилина и Заварзин, 1990]. Изучение анаэробного пути деградации органических веществ в содовом озере Магади (Кения) привело к описанию ряда новых родов, вовлеченных, главным образом, в ацетогенез. В связи с этим представилась возможность для изучения ранее неисследовавшихся алкалофильньгх ацетогенов. Большой интерес представляет изучение механизмов адаптации микроорганизмов, и в том числе ацетогенов, к экстремальным условиям окружающей среды.
Цель и задачи работы. Целью работы было изучение особенностей физиологии, биохимии и биоэнергетики ацетогенных бактерий, выделенных из высокоминерализованных мест обитания.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Описание первых облигатно галоалкалофильных ацетогенных бактерий Natroniella acetigena и Natronincola histidinovorans, выделенных из содового озера Магади.
Изучение механизмов адаптации галофильных и алкалофильньгх ацетогенных бактерий к экстремальным условиям окружающей среды, таким как осмотический стресс и высокие значения рН, включая:
а) определение внутриклеточных концентраций ионов Na+, К+ и СГ у
алкалофильных и галоалкалофильных ацетогенов.
б) исследование ключевых ферментов метаболизма ацетогенных бактерий и их
способности функционировать в средах с высоким содержанием солей и при
высоких значениях рН.
Исследование компонентов цепи переноса электронов у экстремально галофильной ацетогенной бактерии Acetohalobium arabaticum.
Изучение роли окислительного фосфорилирования и ионных градиентов в энергетическом метаболизме галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий при использовании различных энергетических субстратов.
Научная новизна. Проведено сравнительное изучение первых представителей ацетогеыных бактерий из высокоминерализованных мест обитания. Исследованы и описаны галоалкалофильные ацетогенные бактерии из озера Магади, которые составили два новых рода и вида: Natroniella acetigena gen.nov., sp.nov. является первым алкалофильным ацетогеном в порядке Halanaerobiales; Natronincola histidinovorans gen.nov., sp.nov. — первый алкалофильный представитель в кластере XI грамположительных бактерий с низким содержанием Г+Ц порядка Clostridiales. Получены балансовые уравнения разложения основных субстратов. Изучена экофизиология N. acetigena при различных значениях рН среды и различных сочетаниях NaCl, Na2CC>3/NaHC03, которые характерны для содовых озер.
Обнаружены сходные стратегии адаптации к осмотическому стрессу, возникающему в присутствии высоких концентраций солей: накопление высоких внутриклеточных концентраций ионов Na+ и СГ у галоалкалофильной N. acetigena и умеренно алкалофильной галотолерантной ацетогенной бактерии Tindallia magadiensis, и способность всех исследованных ферментов экстремофильных ацетогенов функционировать в средах с высоким содержанием солей. Впервые обнаружена периплазматическая гидрогеназа у облигатно галофильной ацетогенной бактерии Acetohalobium arabaticum и показано, что ее активность стимулируется в присутствии высоких концентраций NaCl и КС1, вплоть до насыщающих.
Показано, что одним из способов адаптации микроорганизмов к высокощелочным средам является способность их ферментов функционировать при высоких значениях рН.
Впервые проведено сравнительное изучение роли окислительного фосфорилирования и ионных градиентов в энергетическом метаболизме галофильных и алкалофильных ацетогенов. Ингибиторный анализ показал, что данные микроорганизмы используют разные механизмы запасания энергии в ходе ацетогенеза — электрон-транспортное или субстратное фосфорилирование, в зависимости от используемого энергетического субстрата.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют наши представления о разнообразии, функционировании и значении ацетогенов в природе. Галофильные и алкалофильные бактерии представляют интерес для биотехнологических исследований, связанных с применением солеустоичивых и устойчивых к высоким значениям рН ферментов.
Апробация работы. Отдельные материалы диссертации были представлены на 7-м Международном Симпозиуме по микробному росту на С і-соединениях (Уорвик, Великобритания, 1992), на 5-й конференции Российской Федерации "Новые направления в
биотехнологии" (Путино, 1992), на 5-ой международной конференции "Молекулярная биология гидрогеназ" (Альбертвилль, Франция, 1997), на международном симпозиуме "Водородный метаболизм азотрофных и анаэробных бактерий" (Умеа, Швеция, 1998), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), а также на конкурсах научных работ Института Микробиологии РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей, 4 тезиса, 1 статья находится в печати.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, экспериментальной части, заключения, выводов и списка используемой литературы. Работа содержит 36 рисунков, 14 таблиц и 5 фотографий. Список литературы содержит 181 публикацию.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность д.б.н. Т.Н. Жилиной, к.б.н. В.В. Кевбрину, к.б.н. Л.Е. Дулову, к.б.н. Н.Д. Савельевой, д.х.н. Г.А. Осипову, к.б.н. Н.А. Кострикиной, к.б.н. A.M. Лысенко за помощь на определенных этапах работы. Особую благодарность автор выражает научному руководителю д.б.н. М.А. Пушевой и заведующему лабораторией реликтовых микробных сообществ академику Г.А. Заварзину за предложенную тему, обсуждение результатов и общее научное руководство.
Список работ по материалам диссертации:
Пушева М.А., Е.Н. Деткова, Н.П. Болотина, Т.Н. Жилина. Свойства периплазматической гидрогеназы экстремально галофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium arabaticum. II Микробиология, 1992, т.61, вып.б, стр.933-938.
Быховский В.Я., М.А. Пушева, Н.И. Зайцева, Т.Н. Жилина, Д.Б. Папковский, Е.Н. Деткова. Биосинтез корриноидов и их возможных предшественников экстремально галофильной гомоацетатной бактерией Acetohalobium arabaticum gen. nov., sp. nov. II Прикладная биохимия и микробиология, 1994, т.ЗО, вып.1, стр.95-103.
Быховский В.Я., П.Дж. Сантандер, Э. Ступперих, Н.И. Зайцева, М.А. Пушева, Е.Н. Деткова, Д.С. Валюшок, А.И. Скотт. Биосинтез корриноидов облигатно анаэробными микроорганизмами: выделение и идентификация промежуточных соединений биогенеза витамина В12 и его аналогов, накапливаемых при развитии Clostridium thermoaceticum, Sporomusa ovata и Acetohalobium arabaticum. II Прикладная биохимия и микробиология, 1996, т.32, вып.2, стр. 185-193.
Пушева М.А., Е.Н. Деткова. Биоэнергетические аспекты ацетогенеза из разных субстратов у экстремально галофильной ацетогенной бактерии Acetohalobium arabaticum. II Микробиология, 1996, т.65, вып. 5, стр.589-593.
Zhilina T.N., G.A. Zavarzin, E.N. Detkova, F.A. Rainey. Natroniella acetigena gen. nov., sp. nov., an extremely haloalkaliphilic, homoacetic bacterium: a new member of Haloanaerobiales. II Current Microbiology, 1996, vol. 32, pp. 320-326.
Zhilina T.N., E.N. Detkova, F.A. Rainey, G.A. Osipov, A.M. Lysenko, N.A. Kostrikina, G.A. Zavarzin. Natronincola histidinovorans gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic acetogenic anaerobe.// Current Microbiology, 1998, vol. 37, pp.177-185.
Пушева M.A., А.В. Питрюк, Е.Н. Деткова, Г.А. Заварзин. Биоэнергетика ацетогенеза экстремально алкалофильных гомоацетогенных бактерий Natroniella acetigena и Natronincola Микробиология, 1999, т.68, вып. 5, стр.651-656.
Питрюк А.В., Е.Н. Деткова, М.А. Пушева. Сравнительное изучение энергетического обмена анаэробных алкалофилов из содовых озер. // Микробиология, в печати.
Pusheva М., Е. Detkova, N. Bolotina and Т. Zhilina. 1992. Salt dependent hydrogenase in extremely halophilic methylotrophic homoacetogenic bacterium Acetohalobium arabaticum. II In 7th International symposium on microbial growth on C-l compounds.
Pusheva M.A. and E.N. Detkova. Properties of the periplasmic hydrogenase of the extremely halophilic homoacetogenic bacterium Acetohalobium arabaticum. Vth International conference on the molecular biology of hydrogenases. Albertville (France)
July 12-17, 1997. ll.Pusheva M.A., E.N. Detkova. Properties of the periplasmic hydrogenase of extremely
halophilic homoacetogenic bacterium Acetohalobium arabaticum. COST action 818.
Hydrogenase and their biotechnological application. Workshop. Hydrogen metabolism of
azotrophic and anaerobic bacteria. Umea, Sweden, 11-14 June,1998. 12. Питрюк A.B., Е.Н. Деткова, М.А. Пушева. 2000. Особенности энергетического
метаболизма галоалкалофильных гомоацетогенных бактерий Natronincola
histidinovorans и Natroniella Горизонты физико-химической биологии —
Пущино — т.1, стр.203.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Автотрофний ацетил-КоА-путь ацетогенеза (путь Вуда-Льюнгдала).
Автотрофный ацетил-КоА-путь "Вуда-Льюнгдала" является отличительным признаком ацетогенов, хотя он также может использоваться и другими бактериями, включая метаногенов и сульфатредукторов, как для катаболизма, так и для анаболизма. Таким образом, путь широко распространен в природе и играет важную роль в круговороте углерода [Drake et al., 1997].
Ацетил-КоА-путь восстанавливает СОг до ацетата и клеточного углерода, и он может быть схематично разделен на метальную и карбонильную ветви (рис.2) [Ljungdahl, 1986; Drake, 1994; Drake et al., 1997; Drake et al., 2002]. Одна часть пути включает восстановление СОг до формиата и его последовательное превращение в метальную группу метилтетрагидрофолата (метил-ТГФ). Вторая часть включает образование одноуглеродного интермедиата из СО, СОг и Нг, и его конденсацию с КоА и метилированным корриноидным белком с образованием ацетил-КоА. Энзимология автотрофного синтеза ацетата из СОг через ацетил-КоА-путь была детально исследована на гетеротрофно растущих клетках М. thermoacetica [Pezacka and Wood, 1984; Pezacka and Wood, 1986] и Moorella thermoautotrophica (ранее Clostridium thermoautotrophicum, [Collins et al, 1994]) [Clark et al., 1982]. Неизвестно, является ли путь и, связанная с ним система консервации энергии, используемые при гетеротрофных условиях идентичными тем, которые используются при автотрофных условиях. Можно выделить три фермента, которые играют ключевую роль в фиксации СОг при автотрофных условиях: 1) гидрогеназа - для начальной активации восстановителя, 2) формиат дегидрогеназа — для начального восстановления СОг до уровня формила и 3) ацетил-КоА-синтаза (также называется СО-дегидрогеназа) - для начального восстановления СО2 до уровня карбонила. Ацетогены с помощью гидрогеназы генерируют электроны /Нг = 2Н+ + 2е/ для восстановления СОг до метилтетрагидрофолата и образуют ацетил-КоА, как первый продукт фиксации, служащий строительным материалом в реакциях анаболизма и являющийся соединением, с которого начинается синтез материала клетки. Гидрогеназы обнаружены во многих микроорганизмах, таких как метаногенные, ацетогенные, азотфиксирующие, фото синтезирующие и сульфатредуцирующие бактерии, которые могут потреблять водород в качестве источника энергии или использовать его как электронный сток [Fontecilla-Camps et al., 1997]. Гидрогеназы явились объектом обширных физиологических, биохимических, физико-химических и генетических исследований, вследствие их способности продуцировать молекулярный водород в качестве альтернативного источника чистой энергии [Adams et al., 1981]. Гидрогеназы — это белки, которые содержат либо никель и железо ([Ni-FeJ-гидрогеназы) либо только железо ([Fe]-гидрогеназы) в своем активном центре. Некоторые [Ni-Fe]-гидрогеназы содержат также селен в форме селеноцистеина. Гидрогеназы, выделенные в аэробных условиях, инактивируются. В 1982 году Дрэйк показал присутствие гидрогеназы у Moorella thermoacetica [Drake, 1982]. За этим открытием вскоре последовала демонстрация того, что данный микроорганизм может расти на смеси Нг и СОг или на СО [Kerby and Zeikus, 1983]. Эти эксперименты были выполнены на сложной среде и не установили способность М. thermoacetica расти автотрофно. Эта способность была установлена лишь два года спустя [Lundie and Drake, 1984]. Образование метильной группы из СОг происходит через формиат, формилтетрагидрофолат (формил-ТГФ), метенил-ТГФ, метилен-ТГФ и метил-ТГФ, как промежуточные соединения.
Первый шаг в образовании метильной группы ацетата - восстановление СО2 до формиата: СОг + 2[Н] — НСОО" + Н+. Эта реакция катализируется ферментом -формиатдегидрогеназой (1) с использованием 1 моля АТФ. Электронным донором фермента у М. thermoacetica является NADPH; у других ацетогенов он неизвестен. Фермент содержит 2 атома W, 2 атома Se, 36 атомов Fe и 50 атомов S на 1 моль [Andreesen and Ljungdahl, 1973]. Полагают, что ферредоксин (Е01 = -420 мВ) может быть физиологическим донором электронов в некоторых ацетогенах. Энергия Гиббса (AG) для реакции с ферредоксином, как донором электронов, + 3,4 кДж/моль, а с NADPH - + 21,5 кДж/моль. СО2 + NADPH + Н+ = HCOOH + NADP+.
Перед восстановлением формиата до формальдегида, формиат должен быть активирован, так как образование альдегида из соответствующей кислоты - эндергоническая реакция [Thauer et al., 1977]. Это достигается при связывании формиата с ТГФ за счет АТФ.
НСООН + ТГФ + АТФ -» АДФ + Ф„ + формил-ТГФ; (AG01 = -8,4 кДж/моль). Реакция катализируется 10-формилтетрагидрофолатсинтетазой (2). Этот фермент был выделен и очищен из ряда источников, включая Moorella thermoacetica [Lovell et al., 1988].
Следующие два шага катализируются 1) 5,10-метенил-ТГФ-циклогидролазой (3), которая превращает 10-формил-ТГФ в 5,10-метенил-ТГФ и 2) 5,10-метилен-ТГФ-дегидрогеназой (4), которая катализирует NAD(P)H-зависимое восстановление 5,10-метенил-ТГФ до 5,10-метилен-ТГФ. В М. thermoacetica и большинстве других прокариот, эти ферменты являются частью бифункционального белка, тогда как ферменты из ацетогенов Clostridium formicoaceticum и Acetobacterium woodii являются монофункциональными [Ragsdale, 1997]. формил-ТГФ - ОН" + метенил-ТГФ+ ; (AG01 = -4,0 кДж/моль). метенил-ТГФ+ +NAD(P)H - NAD(P)+ + метилен-ТГФ ; (AG01 = -4,9 кДж/моль). Последующее восстановление 5,10-метилен-ТГФ до 5-метил-ТГФ - одна из наиболее интересных реакций пути Вуда-Льюнгдала, так как эта экзергоническая реакция может быть сопряжена с электрогенным транспортом ионов Na+ через мембрану. Реакция катализируется 5,10-метилен-ТГФ-редуктазой (5): метилен-ТГФ + 2[Н] -» метил-ТГФ
Этот фермент был выделен и очищен из С. formicoaceticum и М. thermoacetica. Он чувствителен к кислороду и содержит железо-серный кластер, цинк и FAD [Clark and Ljungdahl, 1984]. Электронный донор для большинства ацетогенов неизвестен, но у С. formicoaceticum это - ферредоксин (AG01 = -42,5 кДж/моль), а у Ruminococcus (Peptostreptococcus) productus - NADH (AG01 = -22,0 кДж/моль). Так как восстановление метилен-ТГФ — единственная достаточно экзергоническая реакция для сопряжения с электронно-транспортным фосфорилированием, предполагают, что чистая энергия, генерируемая при образовании ацетата из СО2, обеспечивается посредством этой реакции.
Следующей ступенью синтеза ацетата является перенос СНз-группы 5-метил-ТГФ на СО-дегидрогеназу/ацетил-КоА-синтазу (СО-ДГ/АКС) с помощью корриноидного белка [Menon and Ragsdale, 1999]. Физиологическим переносчиком электронов у различных ацетогенов является ферредоксин. В добавление к корриноидному белку, который служит метальным акцептором, для этой реакции требуется фермент, называемый метилтрансферазой (6). Как корриноидный белок, так и метилтрансфераза, были выделены и охарактеризованы [Ни et al., 1984; Pezacka and Wood, 1984; Shanmugasundaram et al., 1988]. Корриноидный белок был получен из М. thermoacetica. Он содержит [4Fe-4S]2+/1+ кластер и кобальтовый центр - 5 -метоксибензимидазолилкобамид. Кобальт в таком белке находится в виде Со+, Со2+ и Со3+.
Содовые озера как возможные центры возникновения биоразнообразия в прошлом.
Хотя содовые озера обнаружены в специфических географических регионах, они охватывают более чем 80 % объема всех внутренних вод, и их существование явилось геологическим рекордом. Одно из самых больших ископаемых содовых озер - Зеленая река (США), которое образовано из 2-х озер и занимает площадь 100000 км2, имеет возраст между 36 и 55 млн. лет. Современные содовые озера имеют небольшой возраст. Озеро Магади образовалось, вероятно, 10000 лет назад, хотя оно происходит от более старого (800000 лет) менее щелочного и соленого озера, которое имело характеристики похожие на более разбавленные озера северной части Восточно-Африканского Рифта. Северные озера, таким образом, находятся в ранней фазе эволюции, и озеро Магади представляет позднюю стадию в развитии озера, которая занимает значительный период времени [Jones et al., 1998]. В ископаемом содовом озере Вентерсдорп в Южной Африке, которое существовало в поздний период архея до ранней протерозойской эры, обнаружены доказательства процессов, подобных тем, которые происходят в озере Магади. Наиболее важные из них — это присутствие строматолитов в пластах, образованных в докембрии. Строматолиты представляют собой биогенные горные породы, преимущественно карбонатные, располагающиеся в литоральной зоне и на шельфе. Строматолиты являются ископаемыми цианобактериальными матами. Современные аналоги строматолитов докембрия были обнаружены в озерах Восточно-Африканского Рифта и многих других содовых озерах. Цианобактериальные сообщества относятся к наиболее древним биоценозам на Земле. Цианобактерии - весьма консервативная группа и мало изменялась в течение всей истории. Ископаемые цианобактерии можно с большой уверенностью относить к крупным современным таксонам. Spirulina, основной представитель цианобактерий озер Восточно-Африканского Рифта, является явным аналогом ископаемой цианобактерий Heliconema. Отсюда возникает возможность рассматривать некоторые современные биоценозы с доминированием цианобактерий как реликтовые [Grant and Jones, 2000].
В 1993 г. Заварзиным Г.А. была выдвинута гипотеза о том, что алкалофильное прокариотное микробное сообщество может рассматриваться как аналог сообществ, развивавшихся до неопротерозойской революции 1 млрд. лет назад и служить примером реликтовых сообществ, подобно циано-бактериальным матам гиперсоленых морских лагун, признаваемых предшественниками строматолитов [Заварзин, 1993]. Предполагают, что содовые озера, которые существовали еще 2,3 млрд. лет назад, представляют собой рефугиумы для реликтовых микробных сообществ. Эти сообщества рассматриваются как возможные центры происхождения микробного разнообразия.
Имеется по меньшей мере три реликтовых биоценоза с цианобактериальными сообществами, которые можно считать крайними (экстремальными) выражениями более обширных экосистем, существовавших в биосферах прошлого в протерозое и архее [Заварзин, 1993]:
- Сообщества гидротерм углекислотного состава, трансформировавших вулканические газы, которые ближе всего соответствуют по составу ранней атмосфере Земли, образовывавшейся при ее дегазации.
- Бентосные сообщества прибрежных гиперсоленых лагун, образовавшиеся при концентрации хлоридно-натровых вод океана, в которых развиваются цианобактериальные маты - предшественники строматолитов.
- Сообщества эпиконтинентальных водоемов содового типа.
Содовые озера заслуживают более внимательного рассмотрения в общебиологическом плане как возможные очаги первоначального формирования микробных сообществ протерозоя. Алкалофильное сообщество принципиально отличается от галофильных тем, что условия содового засоления связаны с формированием аталассофильных вод во внутриконтинентальных областях, а не связаны с океаном талассофильных [Заварзин и др., 1999]. Поэтому экстремально алкалофильное сообщество прокариот может рассматриваться как реликтовый аналог наземной биоты раннего протерозоя. Рассматривая содовые озера как реликтовые водоемы, необходимо ответить как минимум на три вопроса: 1) является ли сообщество организмов в содовом водоеме автономным в том смысле, что трофические цепи в нем замкнуты? 2) является ли биологическое разнообразие в этих водоемах достаточным для существования основных групп живых существ? 3) в какой мере современные внутриконтинентальные водоемы можно рассматривать как аналоги древних [Заварзин, 1993]? Все эти вопросы имеют существенные ограничения при интерпретации результатов. Содовый водоем не является автономным ландшафтом, как например, кальдера. Напротив, это типичный пример подчиненного ландшафта, служащего конечным водоемом стока. Биологическое разнообразие жизни в содовых озерах очень велико, высшие формы способны развиваться в них и сильно влиять на трофические связи. В этом отношении содовые водоемы отличаются и от гидротерм и от гиперсоленых лагун, где эукариоты практически исключены. Поэтому в качестве модели разумно выбрать лишь водоемы, расположенные в пустынной зоне с ограниченным развитием жизни на окружающей территории.
В качестве природной модели в лаборатории микробных сообществ ИНМИ РАН были выбраны экстремально щелочные с рН 9-10 высокоминерализованные водоемы Восточно-Африканского Рифта, прежде всего экваториальное озеро Магади, находящееся в области недавней вулканической деятельности, и низкоминерализованные озера Центральной Азии и Прибайкалья, расположенные в восточносибирских степях вдоль рек Енисея, Селенги, Онона.
К началу исследований микробных сообществ содовых озер среди алкалофилов были известны лишь несколько видов преимущественно органотрофных аэробов и аноксигенных фототрофов, причем их рассматривали вне связи с сообществами, в которых они развивались. Чтобы существовать в течение длительного времени (а в случае реликтовых сообществ, аналогов биоты прошлого, речь идет о миллиардах лет), сообщество должно представлять трофическую целостность. Поэтому для понимания трофической взаимосвязи групп организмов в сообществе и их роли в биогеохимических циклах в содовых водоемах необходимо изучать микробное сообщество как единую систему.
Изучение функционального разнообразия в содовых озерах [Zhilina and Zavarzin, 1994; Заварзин и др., 1999; Zavarzin and Zhilina, 2000], показало, что метаболическое разнообразие микробных представителей является достаточным, чтобы поддерживать микробное сообщество автономным.
Автономное прокариотное сообщество обладает более или менее полным циклом биогенных элементов и в нем происходит разложение органического вещества. Содовые озера не служат местами накопления С 0рг. и, следовательно, в них имеется полный цикл деструкции. Вследствие высокой продуктивности этих озер и недостаточного резервуара растворенного Ог в них большую роль играют анаэробные процессы.
Если рассмотреть число представителей основных филогенетических ветвей прокариот, уже найденных в содовых озерах, то возможность того, что озера континентов действительно служили центрами возникновения биоразнообразия прокариот, становится более вероятной.
Хотя содовые озера находятся в определенных географических регионах, составляя там около 80% от объема внутренних водоемов, они недостаточно изучены в микробиологическом плане. В последние годы наиболее детально исследуются аталассофильные озера Африканского Рифта, Центральной Азии, Юго-Восточной Сибири и Северной Америки. Комплексное изучение этих экосистем позволило выделить различные физиологические группы (гало)алкалофильных микроорганизмов [Zhilina and Zavarzin, 1994; Заварзин и др., 1996; Сорокин и др., 1996]. Микробиота содовых озер рассматривается в качестве реликтового аналога одного из центров микробного разнообразия [Заварзин, 1993].
Описанию микрофлоры содовых водоемов как целостных экосистем посвящено несколько обзоров [Jones et al., 1998; Заварзин и др., 1999; Grant and Jones, 2000; Zavarzin and Zhilina, 2000; Заварзин и Жилина, 2000]. Высокая степень минерализации и щелочные значения рН определяют развитие преимущественно прокариотного сообщества, в состав которого входят представители основных трофических групп микроорганизмов. По аналогии с цианобактериальными матами гиперсоленых водоемов в содовых озерах можно предположить наличие следующих функциональных группировок: первичный продуцент — цианобактерии; гидролизирующие организмы (гидролитики) - преимущественно протеолитические, но возможно и сахаролитические, например целлюлолитические для аллохтонной органики; первичные протеолитические и сахаролитические анаэробы-бродилыцики, образующие Нг и летучие жирные кислоты; ацетогены-синтрофы и гомоацетогены; метилотрофные метанобразующие; организмы серного цикла, включая сульфат- и серовосстанавливающие бактерии; аноксигенные фототрофные серобактерии [Заварзин, 1993].
Фотометрические измерения светорассеивания клеток
Фотометрические измерения светорассеивания клеток N. acetigena и Natr. histidinovorans проводили по изменению оптической плотности культур в присутствии протонофоров в аэробных условиях в 3-мл кюветах на спектрофотометре Specol-Ю (ФРГ). 2 мл покоящейся культуры вносили в кювету. Через 5 мин добавляли 2 мкл раствора протонофоров и прослеживали изменения светорассеивания при 600 нм в течение 30—60 мин. Контролем служили клетки, к которым было добавлено соответствующее количество этанола.
Метаболические ингибиторы - N,N - дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД) (8егуа,ФРГ), ванадат (Реахим, Россия), моненсин, трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон (ФКЦФ) (Serva, ФРГ), 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиденил малонитрил (SF-6847), карбонил-цианид-т-хлорфенилгидразон (КЦХФ), амилорид (8егуа,ФРГ) и родамин 6G (Реахим, Россия) добавляли в ростовую среду перед инокуляцией клеток. Все ингибиторы, за исключением ванадата, вносили в среду в виде этанольных растворов. Ванадат вносили в виде водного раствора.
Штамм Z-7937 представляет собой крупные подвижные палочки, 1-1,2 мкм в диаметре с закругленными концами. Длина клеток варьирует от круглых мини-клеток до нитей 12-15 мкм (фото 1А). Подвижность клеток обусловлена наличием перитрихально расположенных жгутиков (фото 1В,С). Клетки бывают одиночными, парными или образуют короткие цепочки. Клеточная стенка на ультратонких срезах имеет типичную грамотрицательную структуру (фото 2А). Подобная гибкость клеточной стенки характерна для многих членов Halanaerobiales, и в стационарной фазе роста такие клетки загибаются в виде крюка (фото 1С) или образуют сферопласты (фото 2В). Штамм является олигоспоровым, поскольку изредка наблюдается образование спор в чистой культуре.
Морфология Natroniella acetigena: (А)- световая микроскопия (масштаб 10 мкм); (В)- негативный контраст (масштаб 2 мкм) (отмечен тип жгутикования) ; (С)- негативный контраст (масштаб 2 мкм) (отмечен характерный загиб клетки в стационарной фазе).
Штамм Z-7937 растет в щелочной среде в области значений рН от 8,1 до 10,7 с оптимумом рН от 9,7 до 10,0. Штамм Z-7937 облигатно нуждается в NajCOj и NaCl и растет в области солености от 10 до 26 % NaCl с оптимумом при 12 — 15 %. Культура является мезофильной с оптимумом 37С и максимумом 42"С. Штамм Z-7937 растет только в строго анаэробных условиях. Штамм Z-7937 использует в качестве единственного источника энергии ограниченный набор соединений, такие как лактат, пируват, глутамат, этанол, пропанол (невоспроизводимый рост). Продуктом обмена является ацетат. При росте на пропаноле также образуется пропионат. В конце роста культура лизируется. Не было роста на следующих субстратах при их концентрации 0,5%: формиат, пропионат, бутират, малат, сукцинат, фумарат, моно-, ди- или триметиламины, ацетил глюкозам и н, Hi + СО2, СО + СО2 + N2, смесь аминокислот, глицин, диметилглицин, саркозин, серии, метионин, гистидин, аспартат, аспарагин, казаминовые кислоты, бетаин,
Фото 2. Ультраструктура Natroniclhi acetigena (масштаб 1 мкм): (А) -продольные и поперечные секции демонстрируют грамотрицательный тип структуры клеточной стенки; (В)-образование сферопластов внутри внешней мембраны. холин, глицерин, сорбитол, маннитол, инозит, метанол, изо-пропанол, бутанол, дрожжевой экстракт, пептон, триптиказа, арабиноза, мальтоза, сорбоза, фруктоза, лактоза, глюкоза, сахароза, рибоза, галактоза, мелибиоза, трегапоза, рамноза, целлобиоза, гликоген.
В конце роста культура стремительно лизируется с образованием сферопластов, что сильно затрудняет ее поддержание. Для поддержания культуры ее рекомендуется культивировать на этаноле до начала экспоненциальной фазы роста и затем, хранить в холодильнике в течение 3-4 месяцев или, как альтернативный метод, пересевать штамм Z-7937 каждую неделю.
Для получения балансовых уравнений разложения субстратов было проведено культивирование штамма Z-7937 в ферментере с постоянным поддержанием рН 9,9. Динамика роста на лактате и этаноле показана на рис. 8, 9.
Лактат Этанол 0,15 0,08 Н.д. 0,46 1,44 1,53 На основании результатов культивирования были рассчитаны основные характеристики роста — циУ.а также отношение ацетат/субстрат, которые представлены в табл.7.
Изучение действия катионов и анионов на рост экстремально галофильной ацетогенной бактерии Acetohalobium arabaticum
Общим свойством всех галофильных бактерий является их способность расти в присутствии высоких концентраций солей и необходимость NaCl для роста. Требование NaCl и толерантность к высоким концентрациям солей варьирует среди различных видов. Исследование специфической потребности в ионах Na+ и СГ , а также толерантности по отношению к другим солям является очень важным, поскольку, в большинстве случаев, для роста необходима минимальная концентрация Na+. Na+ требуется для генерации Na+-градиента через цитоплазматическую мембрану, а также для первичной дыхательной внешней натриевой помпы [Ventosa et al., 1998]. Экстремальные галофилы не способны расти в среде, содержащей другие соли вместо NaCl, хотя, иногда КС1 и некоторые другие соли могут частично замещать NaCl [Kamekura and Onishi, 1982]. A. arabaticum, принадлежащий к порядку Halanaerobiales [Жилина и Заварзин, 1990], является экстремально галофильным организмом, так как растет в области солености от 10 до 25% NaCl с оптимумом при 15 — 18%. A. arabaticum способен к трем типам питания: хемолитотрофному, метилотрофному и органотрофному. Сочетание экстремальной галофилии и ацетогенеза как способа получения энергии с возможностью переключения при этом на разные типы питания делают A. arabaticum уникальным объектом для разного рода биохимических исследований.
С целью изучения специфичности NaCl для роста A. arabaticum исследовали возможность роста в присутствии 2.05 — 2.56 М NaCl, 2.04 — 2.7 М КС1, 2.3-4.7 М LiCl, 1.95 М L12SO4 и при их сочетаниях с различным содержанием NaCl в среде. Культура не растет при 1.54 М (9%) NaCl. Результаты по влиянию солей на рост A. arabaticum представлены в табл. 11.
Организм специфически зависит от ионов натрия. Ионы калия и лития, уравненные по молярному содержанию, не заменяют натрий. Рост полностью отсутствовал, когда среда содержала только соли лития или калия. Однако Li2S04 может частично заменять NaCl, если в среде присутствует не менее 1.54 М NaCl и 0.4 М Li2S04- Специфичность к катиону Na+ может быть связана с различной проницаемостью и осмотическим эффектом солей на целые клетки или различным распределением мест связывания катионов на клеточной поверхности [Lanyi, 1974]. Хлоридный ион имеет преимущество перед сульфатом для роста организма. Данные табл. 11 показывают, что только в присутствии не менее чем 1.54 М NaCl добавление Na2S( 4 может поддерживать рост.
Таким образом, показано, что минимальное количество NaCl, необходимое для роста A. arabaticum не является постоянным, а может изменяться в зависимости от состава среды. Оно снижается с 1.71 М (10 %) в обычной комплексной среде [Жилина и Заварзин, 1990] до 1.54 М (9%) в присутствии 0.4 М L12SO4. Изменение минимального количества NaCl в зависимости от различных условий характерно для многих галофильных бактерий [Adams et al., 1987; Vreeland and Martin, 1980].
Внутри микробного мира существуют две фундаментально различные стратегии адаптации к осмотическому стрессу, возникающему в присутствии высоких концентраций солей [Огеп, 1999]: 1) клетки могут поддерживать высокие внутриклеточные концентрации солей, осмотически эквивалентные внешним концентрациям (стратегия - "соль внутри"). При этом все внутриклеточные системы должны быть адаптированы к присутствию высоких концентраций солей; 2) клетки могут активно исключать соли и поддерживать их низкие концентрации внутри своей цитоплазмы. Осмотическое давление среды сбалансировано за счет небольших органических молекул — осморегуляторов (стратегия - "совместимые осморегуляторы"), которые либо синтезируются внутри клетки, либо проникают в клетку из внешней среды. При этом внутриклеточные системы не нуждаются в специальной адаптации. Стратегию "соль внутри" обычно используют две группы микроорганизмов: аэробные экстремально галофильные археи порядка Halobacteriales и анаэробные галофильные бактерии порядка Halanaerobiales. Большинство других галофильных и галотолерантных микроорганизмов используют стратегию "совместимых осморегуляторов". Однако, некоторые галофилы, которые накапливают органические осморегуляторы, одновременно могут содержать достаточно высокие внутриклеточные концентрации ионов Na+, К+ и СГ, и, следовательно, используют сочетание обеих стратегий [Ventosa et al., 1998]. Цель данной работы - оценить, какие физиологические механизмы используют ацетогены, выделенные из высокоминерализованных мест обитания, для адаптации к высокой концентрации соли.
Были определены внутриклеточные концентрации ионов Na+, К и СГ у двух микроорганизмов, выделенных их озера Магади (Кения) - галоалкалофильной N. acetigena и галотолерантной умеренно алкалофильной Т. magadiensis. Оба организма выращивали на средах, содержащих различные концентрации NaCl, и, затем внеклеточные концентрации солей (в среде) сравнивали с внутриклеточными. Также были определены концентрации ионов Na+, К+ и СГ в супернатантах после осаждения клеток (таблица 12). Показано, что внутриклеточные концентрации ионов Na+ и СГ у N. acetigena и Т. magadiensis возрастали при увеличении содержания NaCl в среде, а внутриклеточная концентрация иона К+ практически не изменялась. Тем не менее, Т. magadiensis, в отличие от N. acetigena, накапливала ионы К+ внутри клеток до концентраций значительно превышающих их содержание в среде.
