Введение к работе
Актуальность проблемы. Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) -
синтетический хелатирующий агент группы аминополикарбоксильных кислот,
широко применяется благодаря способности образовывать стабильные
і- водорастворимые комплексы с ионами
Ж он //^ч двух-и трехвалентных металлов (Egli,
^V^A^^o /jyH&\ 1988; Wolf' Gilbert' l992' Potthoff-Karl
V " ЙЩ ct aI- l99&> Sillanpaa, 1997;
Г o-c \k ///»* Weilenmann et al., 2004). В 2000 г
О "С \\,
ЭДТА J" МсЭДТА2- ^14—,
суммарное мировое производство
Рис. 1. Структура ЭДТА (а) и его ЭДТА достигло 2-Ю5 тонн, при этом
комплекса с металлами (б) (Egli, 2001). 7Q&Q% потребленного ЭДТА
поступает в окружающую среду (Nowack, Van Briesen, 2005; Дедюхина с еоавт., 2007, 2008). В результате комплексообразования с ЭДТА металлы переходят в раствор из трубопроводов, ила и донных осадков рек и водоемов, что приводит к загрязнению питьевой воды и потенциально угрожает здоровью людей. Поэтому закономерен интерес исследователей к деградации ЭДТА.
Известны два способа разрушения ЭДТА: физико-химический (фотолиз, озонирование) и микробиологический, причем второй способ разложения считается наиболее эффективным. Тем не менее, к началу нашей работы было выделено лишь несколько смешанных и чистых культур бактерий - деструкторов ЭДТА, которые, однако, не были идентифицированы (Noertemann, 1992; Miyzaki, Suzuki, 1997; Kluener et al., 1998; Young et al., 2001; Witschel, 1999; Bucheli-Witschel et al., 2001; Сатрутдинов с соавт., 2003; Chistyakova et al., 2003, 2005; Chen et al., 2005; Imada et al., 2005). Хотя был охарактеризован первый фермент деградации ЭДТА - ФМН-зависимая ЭДТА монооксигеназа у штаммов DSM9103 и BNC1, (Witschel et al., 1997; Noertemann, 1999; 2005; Bohuslavek et al., 2001), а у штамма BNC1 секвенирован геном, общая картина метаболических превращений ЭДТА до сих пор остается фрагментарной. Все вышеизложенное определило актуальность таксономического и физиолого-биохимического исследования новых деструкторов ЭДТА.
Цель н задачи исследования. Цель работы - таксономическая и физиолого-биохимическая характеристика новых штаммов аэробных деструкторов ЭДТА. Для достижения поставленной цели решались следующие осповные задачи: 1. Определить таксономическое положение четырех новых деструкторов ЭДТА и известного штамма DSM 9103.
Изучить физиолого-биохимические свойства облигатного деструктора ЭДТА, штамма LPM-4.
Провести сравнительный этимологический анализ путей первичного и центрального метаболизма ЭДТА у новых штаммов-деструкторов.
Разработать систему олигонуклеотидных праймеров для амплификации гена ЭДТА монооксигеназы.
Научная новизна работы. Расширено представление о биоразнообразии аэробных деструкторов ЭДТА. Методами полифазной таксономии установлена принадлежность четырех штаммов к новому роду и двум видам Chelativorans gen. nov.: штаммы LPM-410, LPM-6 и DSM 9103 отнесены к виду C.multitrophicus gen.nov., sp.nov., а облигатный деструктор ЭДТА штамм LPM-4 классифицирован как C.oligotrophicus gen.nov., sp.nov. Штамм LPM-5 идентифицирован как новый вид Stenotrophomonas chelatiphaga sp.nov.
Сравнительный энзимологический анализ показал, что первичное окисление осуществляется монооксигеназами, отщепляющими ацетильные группы от ЭДТА с поглощением кислорода и образованием глиоксилата и аммония. Обнаружены различия в зависимости монооксигеназ разных штаммов от хофакторов (ФАД или ФМН). Показано, что продукт оксигенирования ЭДТА - глиоксилат, вовлекается в метаболизм через глиоксилатный и глицератный пути. Обнаружено, что, в отличие от других деструкторов ЭДТА, ограниченно-факультативный штамм LPM-6 и облигатный штамм LPM-4 имеют разомкнутый цикл Кребса, т.к. у них отсутствует активность а-кетоглутаратдегидрогеназы и активности ферментов гликолиза (6-фосфофруктокиназы и альдолази фруктозо-1,6-бисфосфата). У облигатного деструктора обнаружено ингибирование некоторых ферментов углеводного метаболизма ЭДТА, накопление полифосфатов в клетках, растущих на ЭДТА, и последующее расходование при потреблении глюкозы, что, отчасти, объясняет двухфазное использование смеси ЭДТА+глюкоза.
Научно-практическое значение. Детально охарактеризованы пять штаммов- деструкторов ЭДТА, которые могут быть использованы на очистных сооружениях, биофильтрах и биосенсорах. Показано, что способность штамма C.oligotrophicus LPM-4 к деградации ЭДТА не снижается в присутствии Сахаров и органических кислот.
Разработана система олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации бактериального гена монооксигеназы ЭДТА - етоА, позволяющая оценивать степень распространения деструкторов этого поллютанта в различных биотопах, минуя длительную и сложную процедуру выделения чистых культур.
Апробация работы. Основные положення диссертации доложены на 2-ой и 3-ей межрегиональных конференциях молодых ученых (Саратов, 2004, 2006), Всероссийских молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005, 2007), International Symposium on Environmental Biotechnology (Leipzig, 2006), Российской школе-конференции «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино-Тула, 2006), 10-й Путинской школе конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), 2-м Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007), 1-ом Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008» с международным участием (Казань, 2008), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2003-2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 9 тезисов. Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лабораториях радиоактивных изотопов и физиологии микроорганизмов в рамках плана научно-исследовательских работ УРАН ИБФМ РАН по теме «Взаимодействие микроорганизмов и растений в процессах деградации углеводородов нефти и микробной трансформации соединений металлов» (№ Госрегистрации 01.2.007 08216).
Благодарности. Автор искренне признателен сотрудникам УРАН ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н., проф. Ерошину В.К., д.б.н., проф. Вайнштейну М.Б., д.ф-м.н. Минкевичу И.Г. к.б.н. Чистяковой Т.И., к.б.н. Дедюхиной Э.Г., к.б.н. Сатрутдинову А.Д., ст.лаб. Зиновкиной Л.Д., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Трилисенко Т.В., д.б.н. Меденцеву А.Г., н.с. Кошелеву А.В., к.б.н. Окуневу О.Н., к.б.н. Ивановой Е.Г., к.б.н. Бесчастному А.П., д.б.н. Хмелениной В.Н., к.б.н. Торгонской М.А. и к.б.н. Медведковой К.А., асп. Федорову Д.Н., н.с. Лысанской В.Я., а также к.б.н. Лысенко A.M. (ИНМИ РАН), д.б.н. Осипову Г.А. (Академическая группа ак. Исакова Ю.Ф., РАМН, г. Москва).
Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям - д.б.н. Дорониной Н.В. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 06-04-49580-а и Госконтракта 02.740.11.0296.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части,
