Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Значение активных форм кислорода и механизмы их формирования 10
1.2. Механизмы гибели бактериальных клеток на поверхности плёнок диоксида титана. Основные факторы, влияющие на бактерицидные свойства ТЮ2- плёнок 22
Собственные исследования 36
Глава 2. Объект, материалы и методы исследований 36
2.1. Объекты исследований 36
2.2. Золь-гель технология для формирования Гі02-пленок 36
2.3. Рентгеноструктурный анализ плёнок диоксида титана 37
2.4. Подбор светофильтров для излучения заданной длины волны 38
2.5. Окисление органических соединений на поверхности диоксида титана 39
2.6. Получение бактериальной суспензии 40
2.7. Подбор питательных сред для получения КОЕ Pseudomonas aeruginosa 41
2.8. Подбор питательных сред для получения КОЕ Proteus vulgaris 42
2.9. Протокол исследования бактерицидной активности Г02плёнок 43
2.10. Динамика бактерицидной активности ТЮ2-плёнок 43
2.11. Бактерицидная активность повторно используемых плёнок 43
2.12. Бактерицидная активность отожженных плёнок 43
2.13. Гидрофильность и гидрофобность ТЮ2-ппёнок 43
2.14. Влияние бензола на гидрофильные свойства ТЮ2-плёнок 44
2.15. Атомно-силовая микроскопия бактериальных клеток 45
2.16. Бактерицидная активность плёнок диоксида титана в отношении сферопластов 45
2.17. Бактерицидный эффект ТЮ2-ппёнок в отношении лиофилизированных бактерий 46
2.18. Статистическая обработка результатов 47
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 49
3.1. Рентгеноструктурный анализ плёнок диоксида титана 49
3.2. Окисление органических веществ на поверхности плёнок диоксида титана 51
3.3. Определение бактерицидной активности ТЮ2-ппёнок 60
3.4. Исследование бактерицидной активности многократно используемых плёнок на основе диоксида титана 65
3.5. Определение антибактериальной активности повторно-оттоженных плёнок на основе диоксида титана 68
3.6. Динамика бактерицидной активности Гі02-пленок 74
3.7. Исследование бактерицидного эффекта Гі02-пленок в отношении лиофилизированных бактерий 89
3.8. АСМ-исследования бактериальных клеток 92
3.9. Исследование бактерицидного эффекта ТЮ2-плёнок в отношении сферопластов 95
Заключение 101
Выводы 106
Список сокращений и условных обозначений 108
Список использованной литературы 110
- Механизмы гибели бактериальных клеток на поверхности плёнок диоксида титана. Основные факторы, влияющие на бактерицидные свойства ТЮ2- плёнок
- Окисление органических веществ на поверхности плёнок диоксида титана
- Динамика бактерицидной активности Гі02-пленок
- Исследование бактерицидного эффекта ТЮ2-плёнок в отношении сферопластов
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из центральных задач микробиологии является исследование пределов толерантности бактерий к изменяющимся условиям внешней среды. Эта задача имеет очевидную практическую значимость, поскольку позволяет решать целый ряд проблем прикладной микробиологии, подбирая условия для создания бактерицидных материалов и поверхностей. Необходимость в принципиально новых подходах к решению практических задач обусловлена выраженной экологической пластичностью бактериальных сообществ. В частности, резистентность к лекарственным препаратам (в том числе к антибиотикам) и дезинфектантам объясняется феноменом «горизонтальной эволюции». Важным резервуаром для патогенных и условно-патогенных бактерий в ветеринарной и медицинской практике являются поверхности пола, мебели, выступов, подоконников, всех классов ветеринарного и медицинского оборудования и т.д. (Dancer, 2008). Поэтому необходимо создавать самоочищающиеся и бактерицидные поверхности и исследовать условия, при которых самостерилизация реализуется наиболее эффективно.
В настоящее время создаются и изучаются новые классы тонкослойных покрытий с заданными свойствами. Одним из таких материалов является диоксид титана. Тонкие плёнки диоксида титана обладают целым рядом ценных свойств. Они применяются в фотогальванике, для деградации органических соединений, в качестве самоочищающихся покрытий и в сенсорных устройствах (Pruden и соавт., 1983; Matthews, 1988; Matthews, 1992; Sabin и соавт., 1992). Несмотря на широкую область применения, наиболее перспективным представляется внедрение тонких плёнок диоксида титана для решения задач прикладной микробиологии и биотехнологии, в частности их используют в качестве антибактериальных покрытий, а также для очищения сточных вод и воздуха (Hu и соавт., 2007; Rengifo-Herrera и соавт., 2010).
Несмотря на то, что факт бактерицидности УФ-индуцированных тонких плёнок был установлен 28 лет назад (Matsunaga и соавт., 1985) и к настоящему времени выявлена стерилизующая активность в отношении целого ряда бактерий и вирусов, многие аспекты реализации биоцидности остались не установленными. С практической точки зрения важно подобрать и обосновать условия, при которых бактерицидная активность тонких плёнок реализуется максимально.
Степень разработанности проблемы. Технология изготовления тонких пленок диоксида титана и их исследование в качестве антибактериальных покрытий рассматриваются, в основном в западной литературе (Diegel и соавт., 1998; Zwilling и соавт., 1999; Martinu и соавт., 2000; Ordine и соавт., 2000). В частности, одним из перспективных направлений является допирование диоксида титана ионами других металлов, поскольку такая модификация дает возможность активации поверхности не ультрафиолетовым, а видимым светом (Hu и соавт., 2007; Wan и соавт., 2007; Dang и соавт., 2010). В последнее десятилетие начали появляться отечественные работы, где исследуется бактерицидная активность TiO2-пленок (Лыньков и соавт., 2004; Петухов и соавт., 2007). В основном, как в отечественной, так и в зарубежной литературе рассматриваются механизмы формирования активных форм кислорода (АФК) под влиянием ультрафиолета на поверхности полупроводников, но не делается акцент на микробиологической составляющей и не приводится доказательств морфологических видоизменений бактериальных клеток. В статье L. Armelao и соавт. (2007) даются доказательства гибели бактерий на поверхности фотоиндуцированных плёнок диоксида титана. Однако в представленной работе проводились исследования только одного штамма бактерий. В тоже время для оценки резерва бактерицидной активности TiO2-пленок и возможности их практического использования необходимо проведение исследований бактерицидности как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных микроорганизмов. Тот же недостаток отмечается и для большинства работ, в которых исследуется бактерицидность TiO2-пленок (Saito и соавт., 1992; Manness и соавт., 1999; Sunada и соавт., 2003; Cheng и соавт., 2007). Еще одной важной проблемой является отсутствие данных о воспроизводимости бактерицидного эффекта при многократном использовании пленок. Поэтому расширение спектра тестируемых микроорганизмов и получение данных о воспроизводимости бактерицидного эффекта являются важной задачей.
Цель работы - изучение бактерицидных свойств УФ-индуцированных плёнок диоксида титана в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и модуляция условий для эффективности и воспроизводимости бактерицидного эффекта.
Задачи исследования:
-
Показать возможность образования активных форм кислорода на поверхности тонких плёнок диоксида титана в процессе окисления адреналина и метиленового синего;
-
Исследовать эффективность и воспроизводимость УФ-индуцированной бактерицидности тонких плёнок диоксида титана в отношении музейных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий;
-
Подобрать физико-химические условия обработки TiO2-плёнок для достижения максимального бактерицидного эффекта;
-
Оценить динамику бактерицидной активности УФ-индуцированных тонких плёнок диоксида титана в промежутках времени от 15 до 60 минут;
-
Проанализировать изменения бактерицидной активности в условиях модуляции микробиологической составляющей в комплексной системе «TiO2-плёнки – УФ – бактерии».
Научная новизна. Впервые проанализирована бактерицидная активность УФ-индуцированных плёнок диоксида титана в отношении широкого спектра музейных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Впервые выявлены, что после однократной инкубации бактериальной суспензии под УФ-светом происходят изменения свойств поверхности с гидрофобных на гидрофильные. Кроме того, предложено два способа (термический отжиг и химическая обработка бензолом) для восстановления бактерицидного эффекта тонких плёнок. Впервые показано, что структурная модуляция бактериальных клеток (лиофилизированные клетки и сферопласты) приводит к повышению бактерицидной активности TiO2-плёнок. Впервые установлена решающая роль воды, как центрального кондиционирующего фактора в системе «TiO2-плёнки - бактерии».
Практическая значимость работы. Полученные методом золь-гель технологии плёнки диоксида титана в перспективе можно использовать в качестве эффективных антибактериальных и самоочищающихся поверхностей в различных областях народного хозяйства. В прикладной микробиологии, ветеринарии и медицине – для покрытия хирургического (в том числе эндоскопического) инструментария и поверхностей для предотвращения контаминации антибиотикорезистентными штаммами бактерий. В области экологического природопользования – для дезинфекции и доочистки воды и создания специализированных устройств безопасного разложения органических отходов, а также для производства самоочищающихся стекол. Предложенные методы обработки поверхностей (термический и химический) возвращают покрытиям исходные бактерицидные свойства.
Результаты диссертационной работы использованы в учебном процессе, лекциях и практических занятиях по курсу «Основы микробиологии», а также были использованы при написании дипломных работ и магистерских диссертаций в Нижегородском государственном техническом университете им. Р.Е. Алексеева.
Методология и методы исследования. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы. При проведении исследований и изложении материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описание, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.
Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Бактерицидная активность тонких плёнок в отношении разных штаммов бактерий выражена не одинаково. В наибольшей степени к сочетанному воздействию ультрафиолета и активных форм кислорода, генерируемых на TiO2-поверхностях чувствительны грамположительные бактерии.
-
Свойства поверхности TiO2-плёнок изменяются после инкубации на ней суспензии бактериальных клеток. Однако гидрофобность можно восстановить путем термической (отжиг) или химической (бензол) обработки.
-
Вода является принципиальным фактором модулирующим взаимодействие в системе «TiO2-плёнки – бактерии».
-
Атака активными формами кислорода, генерируемыми на TiO2-поверхности ультрафиолетом (max=365 нм) приводит к полному уничтожению бактериальной клетки и морфологическим доказательством разрушения бактерий являются результаты, полученные с помощью метода атомно-силовой микроскопии.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на: II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2008), XII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2008), VIII и X Международной молодёжной научно-технической конференции «Будущее технической науки» (г. Нижний Новгород, 2009, 2011), Всероссийской школе-семинаре по тематическому направлению деятельности национальной нанотехнологической сети «Конструкционные наноматериалы» (г. Москва, 2010); III Межвузовской научной конференции «Наука молодых» (г. Арзамас, 2010); III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (г. Нижний Новгород, 2010); 1-ой и 2-ой интернациональной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (г. Москва, 2009, 2011); XVI «Нижегородской сессии молодых учёных – естественные науки» (г. Нижний Новгород, 2011); III Международной конференции «Высокоинтенсивные физические факторы в медицине, биологии, сельском хозяйстве и экологии» (г. Саров, 2011).
Личный вклад автора. Лично автором диссертации проведен обзор современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, экспериментальные исследования по изучению бактерицидных свойств УФ-индуцированных плёнок диоксида титана в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и модуляции условий для эффективности и воспроизводимости бактерицидного эффекта, а также была самостоятельно проведена систематизация и анализ полученных результатов.
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева»
Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах и состоит из введения; обзора литературы; объектов, материалов и методов исследования; результатов исследований и их обсуждения; заключения; выводов и списка использованной литературы. Работа содержит 45 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 198 источников.
Механизмы гибели бактериальных клеток на поверхности плёнок диоксида титана. Основные факторы, влияющие на бактерицидные свойства ТЮ2- плёнок
Загрязнение окружающей среды разного рода органическими поллютантами ставит задачу создания специальных очистительных систем. Особенную остроту проблема загрязнения приобретает в ветеринарных и медицинских учреждениях, где контаминация среды антибиотико-резистентными штаммами выдвигает на первый план проблему нозокомиальных инфекций (Семина и соавт., 1995; Покровский и соавт., 2000). Одним из вариантов решения проблемы является создание тонкоплёночных и наноразмерных покрытий с антибактериальными свойствами. Тонкие плёнки, созданные на основе полупроводников, на поверхности хирургического инструментария, оборудования и конструкций (стены, пол операционных блоков и реанимационных палат) позволят существенным образом снизить контаминацию условно-патогенными микроорганизмами (Khanna, 2005). С этой точки зрения наиболее перспективным материалом являются тонкие плёнки на основе диоксида титана. В ветеринарии и медицине полупроводниковые ТЮ2-ш1ёпка рассматриваются как перспективный материал для создания самоочищающихся поверхностей и сенсорных устройств (Агеев и соавт., 2004).
В 1972 году A. Fujishima и Honda впервые синтезировали наночастицы ТЮ2, для которых в качестве основной сферы применения был обозначен фотокатализ. Под фотокатализом понимают изменение скорости химических реакций под действием света в присутствии фотокатализаторов, которые поглощают кванты света и участвуют в химических превращениях участников реакции, многократно вступая с ними в промежуточные взаимодействия и регенерируя собственный химический состав после каждого цикла таких взаимодействий (Пармон, 1991). Энергию активации при работе фотокатализаторов сообщают фотоны. Однако в большинстве случаев они должны обладать высокой энергией для того, чтобы электрон акцептора смог преодолеть ширину запрещенной зоны. Поэтому для эффективного разложения органических загрязнений на поверхности полупроводниковых фотокатализаторов как правило, требуется ультрафиолетовое излучение (УФ) - 320-400 нм. Только в этом случае электроны ТЮ2 способны переходить в свободное состояние, и вместе с образовавшимися электронными вакансиями инициировать окислительно-восстановительные реакции.
Сообщения исследовательских групп, изучающих различные аспекты влияния состава тонких плёнок, спектра излучения, воздействующего на полупроводники (в том числе, солнечного излучения) (Rincon и Pulgarin, 2004; Sichel и соавт., 2007; Malato и соавт., 2009), коррекцию реакций наличием различных веществ на поверхности тонких плёнок (в том числе, воды) (Rincon и Pulgarin, 2004; Rincon и Pulgarin, 2007; Cushnie и соавт., 2009) и кинетическое описание реакций (Marugan и соавт., 2008), указывают на существование определенных различий между фотокаталитическим окислением органических соединений и бактериолизом. На сегодняшний день многими группами постулирован бактерицидный эффект тонких плёнок диоксида титана, но основной механизм, лежащий в основе подавления жизнеспособности различных групп микроорганизмов изучен не до конца (Manness и соавт., 1999).
Первые работы по исследованию микробицидной активности диоксида титана датируются 1985 годом, когда Т. Matsunaga и его коллеги обнаружили полное ингибирование Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces cerevisiae и E. coli при их инкубации с частицами ТЮ2 и платины под металлогалогенновыми лампами в течение 60 и 120 минут. Авторы объясняют причину гибели клеток окислением бактериального кофермента А (КоА) (с эффективностью более 97%) в присутствии фотокатализатора. При отсутствии диоксида титана и/или платины происходит окисление лишь 42% КоА. Авторы определяют, что потеря внутриклеточного КоА является причиной снижения дыхательной активности клеток, которое в конечном итоге, приводит к их гибели. Эта работа открыла принципиально новые возможности для дезинфекции воды и удаления биоаэрозолей из помещений.
Однако для создания систем контактной стерилизации гораздо больше подходят сплошные поверхности - тонкие плёнки, которыми можно покрывать не только инженерные конструкции (стены и полы), но также и разного рода изделия ветеринарного и медицинского назначения. Дело в том, что частично адгезия бактерий на поверхности ТЮ2 -плёнок опосредуется гидрофобными взаимодействиями. Вследствие этого, образуемые на фотоиндуцированной поверхности плёнок диоксида титана активные формы кислорода очень быстро достигают поверхности мембраны микроорганизмов и повреждают ее, что в дальнейшем приводит к бактериолизу (Denyer и Stewart, 1998; Kochkodan и соавт., 2008).
Y. W. Cheng и соавт. (2007) продемонстрировали реакции фотоокисления нескольких штаммов Legionella pneumophila на поверхности диоксида титана. Бактериолиз был доказан методами просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии. По мнению авторов вначале наблюдается перекисное окисление липидов (ПОЛ) наружной, липополисахарид содержащей, а позднее и цитоплазматической мембраны, что приводило к формированию крупных пор и перфораций, через которые внутрь бактериальной клетки проникали ОН . Это приводило к окислению внутренних компонентов, особенно ненасыщенных жирных кислот.
При инкубации Е. coli на поверхности ТЮ2-тшёнок в потоке ультрафиолета с интенсивностью излучения 1,0 мВт/см наблюдалось значительное снижение жизнеспособности бактерий (Sunada и соавт., 2003). Полное уничтожение Е. coli происходило после 90 минут облучения. Авторы работы выдвинули предположение, что гибель клеток происходит в две стадии. Первая - занимает около 30 минут и за это время происходит незначительное снижение жизнеспособности Е. coli. За этот промежуток времени происходит частичный распад внешней мембраны, содержащей липополисахарид, вследствие чего увеличивается проницаемость для активных форм кислорода. На второй стадии бактерии полностью уничтожаются, что обусловлено атакой активными формами кислорода уже цитоплазматической мембраны клеток и перекисным окислением мембранных липидов. В частности, W. A. Jacoby и соавт. (1998) наблюдали образование малонового диальдегида (МДА) в сходных экспериментах, что подтверждает активацию реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Структурные и функциональные нарушения цитоплазматической мембраны, обусловленные ПОЛ приводят к гибели клеток.
Аналогичные выводы были сделаны A. Fujishima и соавт. (1999); P.-Ch. Manees и соавт. (1999); Z. Huang и соавт. (2000); К.Р. Kuhn и соавт. (2003); М. Cho и соавт. (2004), которые исследовали механизм гибели Е. coli на поверхности диоксида титана. Было показано, что при облучении поверхности полупроводника с находящимися на нем бактериальными клетками уже в первые 10-20 минут происходит разрушение не только ЛПС наружной мембраны грамотрицательных бактерий, но и пептидогликана. Для оценки степени повреждения цитоплазматической мембраны E.coli в качестве количественного показателя вводился уровень МДА. Было отмечено, что экспоненциальный рост образования МДА в течение первых 30 минут облучения коррелирует со скоростью гибели клеток. Увеличение времени инкубации приводило к снижению скорости образования МДА. Авторы пришли к выводу, что активные формы кислорода, генерируемые на облученной поверхности ТЮ2, атакуют полиненасыщенные фосфолипиды цитоплазматической мембраны Е. соїі в течение первых 30 минут, что впоследствии вызывает разрушение клеточной мембраны и, следовательно, является основным механизмом гибели клеток.
Т. Saito и соавт. (1992) также выявили полное разрушение Streptococcus sobrinus на поверхности диоксида титана. Было установлено, что при инкубации клеток в течение 60 - 120 минут происходит медленная утечка ионов калия, что напрямую приводило к снижению жизнеспособности клеток. При последующем увеличении времени инкубации наблюдается утечка белков и РНК из бактериальных клеток. Кроме того, зафиксировано снижение рН клетки до 4,5. Аналогично в работе P. Chuaybamroong и соавт. (2011) при использовании в качестве тест-культуры S. epidermidis показано, что быстрая потеря ионов калия происходит в первые 60 минут облучения. Увеличение времени инкубации под УФ светом (интенсивность лампы 0,8-1,5 мВ/см2) от 60 до 360 минут приводит к снижению жизнеспособности клеток на 15% и 92% соответственно. Было продемонстрировано, что УФ-свет с такой интенсивностью не способен существенно повреждать клетки, и, следовательно, приводить к их гибели. Это заключение согласуется с выводами сделанными J.-P. Mosnier и соавт. (2009), которые облучали S. epidermidis УФ-светом интенсивностью 1,4 мВ/см2 в течение 2 часов. После инкубации количество жизнеспособных клеток составило 83 ± 4%, что практически соответствовало количеству выживших клеток в контрольном образце 87 ± 6%.
Окисление органических веществ на поверхности плёнок диоксида титана
Бактерицидная активность ТЮ2 -плёнок, согласно данным литературы (Srinivasan и соавт., 2003; Miron и соавт., 2004; Kim и соавт., 2008), обусловлена образованием активных форм кислорода в результате воздействия на поверхность энергии УФ, превышающей ширину запрещенной зоны диоксида титана. Доказательством формирования АФК на поверхности плёнок является окисление органических веществ. Провести количественную оценку степени окисления можно, используя методы аналитической химии, в частности, измеряя изменение коэффициента экстинкции определенных хромогенных агентов. В качестве тестовых хромогенов были выбраны растворы адреналина {СдН ЫОъ) и метиленового синего {C\(,H\%CINT,SHIO), поскольку существует большое количество работ, демонстрирующих изменение коэффициента экстинкции этих веществ при окислении (Сирота, 1999; Shimizu и соавт., 2007; Yao и Wang, 2010).
В результате инкубации раствора адреналина на поверхности ТЮ2-плёнок под УФ-излучением наблюдали образование двух пиков в диапазоне 250 - 280 нм и 330 - 370 нм. При анализе первого пика зарегистрировали снижение максимумов светопропускания на 20,08% - для опытного образца (Ті02-пленка + УФ) и на 12,33% - для контрольного образца (только УФ) (рисунок 7). Именно раствор адреналина имеет максимум светопропускания в области 280 нм. Таким образом, изменение максимумов пропускания указывает на уменьшение концентрации исходного вещества и на образование новых соединений. В работе Т. В. Сирота (1999) установлено, что при окислении адреналина образуется продукт, предшествующий адренохрому. Он регистрируется в области 347 нм. Как следует из представленных результатов, второй пик указывает на образование нового продукта -предшественника адренохрома. При детальном изучении графика очевидно, что адренохром, пик которого соответствует 480 нм, формируется лишь в опытном образце.
Окисление адреналина включает в себя несколько этапов (рисунок 8). Адреналин может быть преобразован в неустойчивую форму о-семихинона, который после депротонирования и потери второго электрона, переходит в о-хинон.
D. Е. Green и D. Richter (1937) показали, что при окислении адреналина основным образующимся продуктом является орто-хинон. Однако это крайне неустойчивое соединение и при рН 7 он подвергается необратимым изменениям за 1/30 сек, образуя продукт неопределенного строения.
Частичное депротонирование аминогруппы боковой цепи адреналина приводит к необратимой 1,4-внутримолекулярной циклизации. Эта реакция происходит через нуклеофильную атаку атома азота в положении 6 хинонового кольца. Вследствие этого образуется /еисоадренохром, который далее окисляется до адренохрома. Первым заметным признаком начала окисления адреналина является появление розового оттенка. Формирование адренохрома ведёт к появлению выраженного окрашивания раствора. Интенсивность цвета зависит от количества образованных молекул адренохрома. Но при значениях рН выше 11 образования любых оттенков красного цвета не наблюдается (Shaw, 1941).
В экспериментах с Гі02_пленками мы наблюдали, что опытный образец после трех часов инкубации на фотоиндуцированной поверхности диоксида титана изменил окраску с бледно-жёлтой на оранжево-розовую.
Кроме изменения цвета исследуемого образца, нами было зафиксировано изменение рН раствора адреналина после трёх часов инкубации на поверхности фотоиндуцированных плёнок диоксида титана. Вначале эксперимента рН раствора составлял 3,2. Через три часа значение рН было 5,2.
Изменение рН раствора адреналина в процессе окисления отмечается также в работе Е. М. Trautner и Т. R. Bradley (1951). Для исследований они использовали растворы адреналина в буферах с разными значениями рН. В результате было установлено, что рН при котором может начаться процесс деградации молекул адреналина, находится в пределах 7-8. Через несколько часов после начала процесса происходит снижение рН до 4-5 с образованием продуктов окисления.
Таким образом, после инкубации в течение трёх часов раствора адреналина на поверхности фотоиндуцированных плёнок диоксида титана происходит окисление исследуемого образца. На это указывает, во-первых, снижение пика, соответствующего адреналину в диапазоне 250 - 280 нм, во-вторых, появление нового пика на 330 - 370 нм соответствующего продуктам окисления. Подтверждением процесса окисления адреналина за счёт генерации АФК на поверхности 7702-плёнок служит также изменение рН.
Аналогичное исследование проводили с раствором метиленового синего (рисунок 9).
Данные демонстрируют, что при инкубации раствора метиленового синего на поверхности плёнок диоксида титана под УФ-светом в течение 3-х часов появляется 4 ярко выраженных пика. Первый пик регистрируется в диапазоне длин волн 375-381 нм и плавно переходит во второй, имеющий максимум светопропускания при 417 нм. В результате анализа первого пика установлено снижение максимума светопропускания на 5,03% для опытного образца (раствор метиленового синего на поверхности плёнок диоксида титана под УФ-светом), и увеличение максимума пропускания на 10% для контрольного образца (раствор метиленового синего на поверхности стекла под УФ-светом). Для второго пика были получены следующие данные: снижение максимума светопропускания на 6% для опытного образца и увеличение максимума пропускания на 10% для контрольного. Третий пик, в диапазоне длин волн 750-880 нм, также как и первый плавно переходит в четвёртый, имеющий максимум при 895 нм. При детальном изучении третьего пика видно снижение максимума светопропускания и для опытного (на 2,43%), и для контрольного (на 1%) образцов.
Обесцвечивание раствора метиленового синего зарегистрировали С. Yogi и соавт. (2009) в системе Аи-ТЮ2 под УФ (Х=365 нм; W= 130 мВ/см2) с помощью спектрофотометрии. Они сделали вывод, что после 120 минут инкубации происходит обесцвечивание раствора, т.е. образуется leuco- форма метиленового синего.
A. Houas и соавт. (2001) изучая деградацию метиленового синего на поверхности ТЮ2-тшёнок под УФ-светом показали, что исследуемый раствор обесцвечивается и происходит его разрушение за счёт атаки гидроксильного радикала по двойной связи функциональной группы, но перед этим происходит адсорбция и перестройка метиленового синего на поверхности диоксида титана (рисунок 10). Дальнейшая атака ОН по сульфоксидной группе вызывает разрыв двух бензольных колец, которые также могут атаковаться гидроксильными радикалами с образованием сульфоновых кислот.
В таком состоянии сера достигает окончательной и максимальной степени окисления (+6) и сразу же происходит следующая атака гидроксильным радикалом. После этого реакция может пойти по двум путям. В первом случае, аминогруппы в метиленовом синем могут быть заменены гидроксильным радикалом, с образованием фенола и NH2, который, в свою очередь, генерирует формирование аммиака и аммония. Второй путь - это окисление двух симметричных ди-метил-фенил-амино-групп метиленового синего за счёт атаки гидроксильным радикалом. В результате такой реакции образуются спирты, затем альдегиды. При дальнейшем протекании реакции может образоваться кислота и происходить декарбоксилирование до СОг-Продукты, образуемые при деградации метиленового синего, показаны на рисунке 11.
Эффективность окисления раствора метиленового синего на поверхности плёнок диоксида титана под УФ-светом зависит от интенсивности света, длины волны и значения рН при котором протекает процесс (Bubacz и соавт., 2010).
По данным W. Y. Wang и Y. Ки (2007), одним из наиболее важных параметров, влияющих на окисление красителей является рН раствора. При разложении фенола в системе Аи — ТЮ2/УФ рН раствора влияет на такие свойства, как поверхностный заряд полупроводника и диссоциация раствора (Chiou и соавт., 2008). С. Н. Ling и соавт. (2004) показали, что значение рН также оказывает влияние на адсорбционные свойства органических соединений и их диссоциацию на поверхности полупроводника.
Динамика бактерицидной активности Гі02-пленок
Для определения динамики биоцидности плёнок диоксида титана бактериальную суспензию наносили на поверхность стекла (контроль) и поверхность плёнок диоксида титана (опыт). Образцы инкубировали в потоке УФ-света в течение 60 минут. Посевы суспензии производились каждые 15 минут в течение часа. Анализу подвергали плёнки диоксида титана сразу после синтеза; повторно-используемые ТЮ2-плёнки и плёнки подвергшиеся отжигу, после использования (450 С; 3 часа). Представленные результаты демонстрируют существенное снижение числа КОЕ при увеличении времени инкубации. Очевидно, что штаммы наиболее чувствительные к УФ оказываются и максимально чувствительными к комплексному воздействию УФ и АФК, генерируемым на поверхности ТЮ2-плёнок (рисунки 25-38).
Как показывают полученные результаты, при воздействии УФ-света ( тах=365 нм) происходит незначительное снижение числа КОЕ бактериальных штаммов.
Однако одного этого фактора недостаточно для полной гибели всех клеток. Ярко выраженный бактерицидный эффект проявляется при сочетанном воздействии УФ и ТЮ2 -плёнок. Антибактериальная активность возрастает при увеличении времени инкубации бактериальной суспензии на поверхности фотоиндуцированных плёнок диоксида титана.
Для S. epidermidis 1061 и S. aureus 956 отмечается постоянное снижение жизнеспособности при увеличении времени инкубации (рисунки 25-28). Максимальное снижение жизнеспособности отмечено уже после 15 минут инкубации на фотоиндуцированных плёнках диоксида титана. В последующие 45 минут происходит плавное снижение числа КОЕ. Такой характер кривых одинаков для всех видов тестируемых плёнок: первичных, повторно используемых и оттожженных (рисунок 28).
Однако при тестировании S. aureus 956 на поверхности вторично используемых плёнкок диоксида титана бактерицидный эффект оказывается значительно ниже, чем у первично используемых ТЮ2-плёяок (рисунок 27, 28).
Полная гибель клеток S. epidermidis 1061 наблюдается после 60 минут инкубации на поверхности повторно используемых ТЮ2 -плёнок (рисунок 25,26).
Можно предположить, что в начале фотокаталитического процесса АФК воздействуют на внешние структуры клетки, но при этом клетки сохраняют жизнеспособность. При увеличении времени облучения УФ светом происходит фотоокисление внутриклеточных компонентов и, как следствие, ускорение гибели клеток.
Отжиг в жестких условиях (450С), напротив, приводит к увеличению бактерицидной эффективности поверхности (рисунок 28, в). По всей вероятности под воздействием высокой температуры происходит не только восстановление гидрофобности поверхностей, но и изменение ее микроструктуры. Хотя рентгеноструктурныи анализ показывает, что кристаллическая структура анатаза сохраняется и после отжига.
Для Е. coli 321-5 кривые имеют совершенно иной характер (рисунок 29, 30). Так же как и для S. epidermidis 1061 и S. aureus 956 на поверхности первичных и повторно-используемых плёнок диоксида титана в первые 15 минут погибает большая часть клеток. Дальнейшее увеличение времени экспозиции мало влияет на количество КОЕ. Гибель клеток после часовой инкубации составляет 50,3 %.
Аналогичный характер кривой получили К. Sunada и соавт. (1998). Авторы отметили, что с уменьшением количества живых бактерий увеличивается концентрация эндотоксинов. К Sunada и соавт. (1998) сделали вывод, что в ходе инкубации бактериальной суспензии на поверхности фотоиндуцированных плёнок диоксида титана клеточные стенки бактерий повреждались, а с течением времени полностью разрушались, что подтверждалось накоплением эндотоксинов. Полную гибель клеток Е. coli наблюдали после двух часов инкубации, а исчезновение эндотоксинов после четырёх часов облучения УФ высокой интенсивности (0,4 В/см2) на поверхности диоксида титана.
При облучении бактериальной суспензии Е. coli 321-5 на поверхности повторно-используемых ТЮ2-плёнок снижение числа КОЕ составило 49,5% (рисунок 29, в; 30).
После проведения экспериментов с P. aeruginosa 969і нами были получены результаты, свидетельствующие о значительном снижении жизнеспособности на поверхности плёнок диоксида титана под УФ-светом. Кривая для опытного образца снижается также плавно, как и для S. epidermidis 1061 (рисунок 31, а).
В работе N. Daneshvar и соавт. (2007) была изучена бактерицидность плёнок диоксида титана в отношении P. aeruginosa и было показано снижение количества КОЕ на 90% после часовой экспозиции под УФ-светом, что согласуется с результатами, полученных в нашей работе.
Одинаковая динамика снижения жизнеспособности на поверхности фотоиндуцированных Гі02-пленок была получена для К. oxytoca 525 и Е. faecalis 971 (рисунки 32-34). Гибель клеток после часовой инкубации на поверхности 7702-плёнок в потоке УФ-света составляет 66,3% для Е. faecalis 971 и 61,4% для К. oxytoca 525.
При сравнении результатов бактерицидносте в отношении К. oxytoca 525 и Е. faecalis 971 отмечается практически полная идентичность результатов. Очевидно, существует прямая зависимость бактерицидной активности от времени экспозиции под УФ-светом.
При тестировании К. oxytoca 525 на поверхности оттоженных ТЮ2-плёнок регистрируется значительное снижение жизнеспособности - 41,8% (рисунок 32, б).
При анализе динамики бактерицидной активности в отношении S. aureus 455 на первичных ТЮ2-плёнках отчётливо выделены 3 фазы инактивации бактерий (рисунок 35, 36). Первая фаза - быстрая - до 15 минут. На этом промежутке происходит гибель 35,7% клеток бактерий. Вторая фаза -плато, которое характеризуется практически полным отсутствием снижения числа КОЕ (15 минут). Третья фаза - длительная. В течение последних 30 минут происходит наибольшее снижение жизнеспособности (59,8%) за период всего эксперимента
Исследование бактерицидного эффекта ТЮ2-плёнок в отношении сферопластов
Дополнительным доказательством того факта, что основной мишенью АФК является клеточная стенка бактерий стали исследования со сферопластами.
S. aureus 956 и Е. coli 321-5 лишались клеточной стенки (рисунок 41), после чего исследовалась чувствительность сферопластов к моновоздействию (УФ) и сочетанному воздействию (УФ+АФК, генерируемым плёнками диоксида титана) согласно основному протоколу исследования. Результаты исследования представлены на рисунках 42-45.
Результаты показывают, что сферопласты S. aureus 956 более чувствительны к воздействию АФК и УФ-света. В первые 30 минут погибает большая часть сферопластов (68,9%). Именно в этот период времени АФК атакуют бактериальную мембрану. По завершении процесса перекисного окисления липидов и основных протеинов мембран клетка, исчерпавшая возможности антиоксидантнои защиты, погибает. В последующие 15 минут не происходит снижения числа КОЕ, т.е. формируется стадия плато. В течение последних 15 минут инкубации происходит практически полное уничтожение S. aureus 956.
Совершенно другая динамика прослеживается при исследовании сферопластов Е. coli 321-5. Для данного штамма наблюдается постоянное снижение количества сферопластов в течение всего времени инкубации. Стоит отметить, что гибель сферопластов происходит не только под действием УФ, но и без воздействия, о чем свидетельствует регрессионный характер кривой жизнеспособности бактерий.
Часовой инкубации достаточно для практически полного уничтожения сферопластов, в то время как в экспериментах с интактными клетками этого времени было недостаточно. Процент погибших сферопластов Е. coli 321-5 -87,6%.
Следовательно, сферопласты намного более чувствительны к сочетанному воздействию УФ+ПОг-плёнки, чем интактные клетки. Этот факт косвенно подтверждает решающую роль клеточной стенки в выживании бактерий на поверхности диоксида титана, в условиях атаки АФК. Вероятнее всего основное «гашение» АФК реализуется именно пептидогликаном или липополисахаридом, а в отсутствие клеточных стенок мембрана клеток активно атакуется АФК.
Полученные результаты демонстрируют бактерицидность плёнок диоксида титана, которая обусловлена суммарной эффективностью двух факторов: УФ-света, АФК генерируемых на поверхности 7702-плёнок. Увеличение времени инкубации приводит к значительному снижению жизнеспособности бактерий на поверхности плёнок диоксида титана под воздействием УФ-света.
Как показали исследования, важным фактором при оценке антибактериальной активности является жидкость, в которой суспендированы бактерии, а основной мишенью АФК является клеточная стенка бактерий.
