Введение к работе
Рост хозяйственной деятельности в прибрежных районах морских акваторий приводит к повышению уровня содержания в морской среде токсических веществ. Для установления биологических последствий антропогенного загрязнения водной среды целесообразно исследование их действия на гидробионтов. Фенол и кадмий в силу своей распространенности являются модельными токсикантами. Морские ежи традиционно служат объектами научньж исследований разных направлений, в том числе в токсикологических работах и программах биомониторинга (Kobayashi, 1995). Использование хронических экспозиций низкими дозами токсикантов способно имитировать экологическую обстановку некоторых загрязненных морских районов. Как показали исследования последних лет, стабильность показателей гонадного индекса и отсутствие патологий при гистологическом анализе не исключают аномалии в ходе сперматогенеза на ультраструктурном уровне (Au et al., 2001). Для выявления достоверных ультраструктур-ных изменений, спровоцированных действием токсикантов, необходимо иметь четкое представление о процессах протекающих в половых клетках в норме.
В последние годы в исследованиях гаметогенеза морских ежей, особое внимание уделяется не только изучению развития половых клеток, но и вспомогательных. По мнению некоторьж авторов, вырабатывающих рекомендации по марикультуре, именно вспомогательные клетки определяют качество «икры» морских ежей (Byrne, 1999; Walker et al., 1998, 2001). Кроме трофической и фагоцитарной функций, вспомогательные клетки морских ежей выполняют роль защитного барьера. Согласно некоторым данным большая часть тяжелых металлов аккумулируется именно в них (Липина, Гнездилова, 1985). Работ по исследованию вспомогательных клеток в условиях искусственной токсикации несоизмеримо меньше, чем исследований половых клеток. Безусловно, для понимания процессов протекающих во вспомогательных клетках морских ежей под действием токсикантов необходимо иметь четкие представления о строении и функционировании данных клеток в норме. До сих пор остается не описанным на ультраструктурном уровне процесс резорбции остаточных гамет, хотя в токсикологических исследованиях активизация резорбции - явяется признаком деструктивных изменений, происходящих в гонаде (Сяси-на, 1988;Сясинаидр. 1991; Дуркина, 1992).
В природных условиях гидробионты подвергаются комплексному воздействию за грязняющих веществ. Совместное действие нескольких токсикантов может привести к более пагубным последствиям. Однако необходимо знание механизмов повреждающего действия каждого из них в отдельности. Цель данной работы состояла в исследовании воздействия фенола и кадмия на сперматогенные и вспомогательные клетки гонад морских ежей Strongylocentrotus nudus и Anthocidaris crassispina. В связи с тем, что ультраструктура сперматогенных клеток морского ежа A. crassispina в норме и при воздействии кадмия была изучена нашими коллегами из Городского университета Гонконга ранее (Au et al., 1998, Аи et al., 2001b), данный вид будет исследован частично.
Для достижения цели предполагалось решить следующие задачи:
1. Исследовать ультраструктурную организацию половых и вспомогательных клеток морского ежа S. nudus в норме;
2. Исследовать ультраструктурную организацию вспомогательных клеток морского ежа A. crassispina в норме;
3. Определить степень накопления фенола и кадмия в гонадах самцов морского ежа S. nudus;
4. Провести сравнительный ультраструктурный анализ сперматогенных и вспомогательных клеток обоих видов морских ежей, подвергнутых действию 0.01 и 0.1 мг/л фенола и кадмия в ходе хронической (50 сут) токсикации.
Научная новизна. Впервые на ультраструктурном уровне изучен процесс сперматогенеза у морского ежа S. nudus.
Впервые изучен процесс посленерестовой резорбции у S. nudus и A. crassispina. Показано, что состав первичных лизосом участвующих в резорбции, у исследованных видов различен. Впервые для морских ежей описан специализированный механизм по-сленерестового уменьшения вспомогательных клеток у A. crassispina, посредством функционирования специализированных аутолизосом. На примере того же вида показано, что деструктивные процессы (резорбция, аутолиз электроноплотных глобул, активность специализированных аутолизосом) завершаются формированием электроносветлых полостей, сжатие которых приводит к уменьшению размеров вспомогательных клеток.
При исследовании влияния токсикантов на сперматогенные клетки обоих видов морских ежей впервые установлено, что фенол и кадмий способны вызывать как сходные, так и отличные ультраструктурные нарушения. Впервые описан механизм деструкции вещества зародышевой плазмы в сперматогониях морских ежей подвергающихся токсикации. На сперматогенных клетках S. nudus и A. crassispina показано, что особенностью действия фенола является его способность подавлять цитокинез, что приводит к формированию мультиядерных половых клеток. Описан механизм повреждающего дей-ртвия .фенолаЙШІМИЯ на вспомогательные клетки. Показано, что в отличие от спермато 5 генных клеток вспомогательные клетки на действие обоих токсикантов отвечают одинаковым набором ультраструктурных реакций, обнаруживая при этом признаки видоспе-цифичности. Видоспецифичность действия токсикантов объясняется особенностями метаболизма вспомогательных клеток, показанными на особях из контрольной группы.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные дают детальную картину процессов резорбции и посленерестовых перестроек во вспомогательных клетках морских ежей. Проведенные исследования показали, что при низком уровне содержания токсикантов (0.1 и 0.01 мг/л) гонадный индекс и гистологические картины гонад не отличаются от контрольных показателей, и, следовательно, не могут достоверно свидетельствовать об уровне загрязнения. Метод электронной микроскопии является более точным для оценки повреждающего действия низких концентраций токсикантов. Полученные ультраструктурные данные могут быть использованы для прогнозирования биологических последствий загрязнения морской среды фенолом и тяжелыми металлами при репродукции морских ежей. Высокая чувствительность половых детерминантов к действию токсикантов, позволяет использовать эту структуру как цитологический маркер загрязнения окружающей среды.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000); на Всероссийской конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002); на первом съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003); на Международном симпозиуме "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, 2004), на Международном научном семинаре «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2004), на ежегодных конференциях Института биологии моря ДВО РАН (1999, 2003); на научном межлабораторном семинаре по морфологии, физиологии и биохимии ИБМ ДВО РАН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов, списка литературы (186 источника из них 132 на иностранном языке) и приложения. Работа изложена на 137 страницах, из них 97 машинописного текста, 40 рисунков. Благодарности. Автор выражает признательность своему научному руководителю А.А. Реунову за всестороннюю помощь, поддержку и руководство при выполнении настоящей работы. Огромное спасибо за ценные консультации и критические замечания М.А. Ващенко. Я благодарна В.Я. Кавуну и МА. Веселовой, В.В. Юшину и С.Ш. Даутову, Д.В. Фомину А.В. Калачеву Ю.К. Зограф за техническую и методическую помощь.
