Содержание к диссертации
Введение
1 Дисперсия электрокинетической подвижности и импульсный гельэлектрофорез полиэлектролитов 18
1.1 Введение 18
1.2 Дисперсия электрокинетической подвижности полиэлектролитов 27
1.2.1 Диффузионная теория рептаций 27
1.2.2 Дисперсионная модель динамики полиэлектролита в импульсном поле 30
1.3 Расчеты импульсного гель-электрофореза ДНК 38
1.3.1 Одномерный инверсионный гель-электрофорез 38
1.3.2 Двумерный импульсный гель-электрофорез 40
1.4 Численное моделирование динамики полиэлектролитов на основе диффузионной теории рептаций 46
1.5 Одномерный газрептонов 52
1.6 Выводы 59
2 «Гидродинамическая» теория движения полимерной цепи в сильном внешнем поле 60
2.1 Введение 60
2.2 Статистическая механика отрезка полимерной цепи в геле 64
2.2.1 Свободно-сочлененная полимерная цепь 64
2.2.2 Уравнение состояния блоба - отрезка полимерной цепи в поре геля .68
2.2.3 Статистическая механика концов полимерной цепи во внешнем поле..75
2.3 Уравнения одномерной «гидродинамики» полимерной цепи 79
2.3.1 Одномерная «гидродинамика» полимерной цепи 79
2.3.2 Формула де Жена 81
2.4 Численное моделирование «гидродинамики» полимерной цепи в им
пульсном поле 83
2.4.1 Дискретная модель «одномерной гидродинамики» 83
2.4.2 Ветвления полимерной цепи в геле 86
2.5 Результаты расчетов динамики полимерной цепи в импульсных полях 91
2.6 Выводы 101
3 Модели процессов электрокинетического фокусирования полиэлектролитов 102
3.1 Введение 102
3.2 Точное решение нестационарной задачи электрокинетического фокусирования полиэлектролитов 107
3.3 Устойчивость стационарных распределений ионов В электрических полях 115
3.3.1 Уравнения Нернста-Планка и аналогия с гидродинамикой 115
3.3.2 Буферная система из двух сортов ионов - амбиполярная диффузия ,..117
3.3.3 Устойчивость буферной системы стремя сортами ионов 119
3.3.4 Неустойчивость стационарных распределений ионов в многокомпонентных буферных системах 122
3.4 Фокусирование макромолекул в неоднородных электрических полях 124
3.5 Моделирование неоднородных электрических полей методом граничных элементов 130
3.5.1 Метод угловых интегралов 130
3.5.2 Расчет неоднородных электрических полей методом граничных элементов 136
3.6 Выводы 142
4 Нелинейные процессы фракционирования и фокусирования 143
4.1 Введение 143
4.2 Нелинейный импульсный гель-электрофорез фрагментов ДНК 148
4.3 Нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях 159
4.4 Методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК 168
4.5 Нелинейный гель-электрофорез комплексов белков и ионных детергентов 177
4.5.1 Одномерный нелинейный гель-электрофорез комплексов белков и ионных детергентов 177
4.5.2 Двумерный гель-электрофорез комплексов белков 183
4.5.3 Нелинейный гель-электрофорез нативных белков 187
4.6 Выводы 190
5 Двойной заряженный слой и электродная кинетика 196
5.1 Введение 191
5.2 Асимптотическая модель двойного заряженного слоя 196
5.2.1 Двойной заряженный слой 196
5.2.2 Квазинейтральная область 201
5.2.3 Вольтамперная характеристика 201
5.3 Численное моделирование сложной электродной кинетики 206
5.3.1 Результаты расчетов вольтамперных характеристик 206
5.3.2 Учет ионов буферного электролита 208
5.3.3 Сложная электродная кинетика 209
5.4 Макрокинетическая модель тафелевской зависимости 213
5.5 Обратные задачи электродной кинетики 219
5.5.1 Постановки обратных задач 219
5.5.2 Методы решения обратных задач 220
5.5.3 Нелинейные обратные задачи 226
5.5.4 Параметрические обратные задачи 228
5.5.5 Обратные задачи электродной кинетики 230
5.6 Выводы 233
Заключение 234
Приложение: комплекс программ «Laplas» 237
Литература
- Диффузионная теория рептаций
- Свободно-сочлененная полимерная цепь
- Устойчивость стационарных распределений ионов В электрических полях
- Одномерный нелинейный гель-электрофорез комплексов белков и ионных детергентов
Введение к работе
Актуальность темы. Электрокинетические методы фракционирования (сепарации) макромолекул полиэлектролитов, в особенности — гель-электрофорез [1,2] и электрофокусирование [3,4] в последние десятилетия испытали стремительный прогресс и развитие и в настоящее время признаны одними из наиболее мощных инструментов поиска и сепарации макромолекул ДНК, белков и их комплексов и других биополимеров. Всевозрастающий интерес к этой области исследований обусловлен главным образом тем, что электрокинетические процессы фракционирования полиэлектролитов составляют технологическую основу современной экспериментальной молекулярной биологии. Применение гелей для фракционирования макромолекул стало базовой инновацией в электрокинетических технологиях сепарации и позволило преодолеть главную трудность ранних методик электрофореза — конвективную неустойчивость электролита, возникающую при прохождении электрического тока.
Диссертационная работа посвящена моделям динамики полиэлектролитов в гелях в сеансах импульсного гель-электрофореза [5,6] и электрофокусирования [3,4], так как именно эти электрокинетические процессы имеют наибольшее практическое значение, как основа наиболее эффективных технологий фракционирования. Возникающий при этом широкий круг проблем и задач тесно связан с целым комплексом научных направлений физики конденсированного состояния.
Актуальность и важность исследования динамики полиэлектролитов в процессах электрокинетического фракционирования обусловлены тем, что теоретическое обоснование и интерпретация многих современных экспериментальных результатов и методик заметно отстают от потребностей практики. Среди наиболее известных проблем в этой области укажем задачу изучения импульсного гель-электрофореза полимерных цепей ДНК, которая до настоящего времени не имела адекватного ее значимости теоретического описания и интерпретации, а также инструментов надежного прогноза рабочих областей параметров и качества фракционирования. Импульсный гель-электрофорез, предложенный в работах [5,6], является основным и весьма эффективным методом сепарации длинных полимерных цепей ДНК. Он основан на необычной динамике полиэлектролитов в переменных (импульсных) полях, которая экспериментально изучалось в работах [7-10]. Несмотря
на обилие теоретических моделей и подходов (см. обзоры моделей в [2, 11]), теория импульсного гель-электрофореза до настоящего времени отсутствовала. В отличие от случая постоянного электрического поля, не позволяющего разделять длинные полимерные цепи, в импульсном поле у полиэлектролита наблюдается заметная, хотя и не монотонная, зависимость скорости дрейфа от размера полимерной цепи. Эта зависимость меняется с изменением периода электрического поля, что указывает на дисперсионный характер этого явления. Чтобы объяснить эту зависимость автор вводит понятие дисперсии электрокинетической подвижности и связывает его с таким фундаментальным свойством цепных полимеров, как их линейная память [12,13]. Дисперсия электрокинетической подвижности представляет большой интерес для современной физики полимеров и позволяет построить теорию как одномерного [6], так и двумерного [5] импульсного гель-электрофореза. Дисперсионный эффект тесно связан с нелинейным характером электрокинетической подвижности полиэлектролитов в импульсных электрических полях. Изучение дисперсионных и нелинейных свойств подвижности полиэлектролитов в процессах импульсного гель-электрофореза составляет ведущее направление исследований в диссертации.
В работе проводится анализ динамики движения полимерных цепей в импульсных полях и делается вывод о неадекватности диффузионных подходов основанных на теории рептаций [14] для описания динамики длинных полимерных цепей в умеренных и сильных полях. Предложен альтернативный — «гидродинамический» - подход, учитывающий упругие «энтропийные» силы полимерной цепи, который позволяет преодолеть трудности диффузионных моделей и открывает новое направление в теоретических исследованиях динамики полимерных цепей в геле в сильных импульсных полях. В основу «гидродинамического» подхода положено полученное методами статистической физики уравнение состояния для отрезка полимерной цепи в одной поре геля, называемого в теории скейлинга - «блобом» [12,15].
Большое внимание в работе уделено методам электрокинетического фокусирования макромолекул. Предельное разрешение методик фракционирования, достигнутое в методе изоэлектрического фокусирования [3, 4,16,17] до настоящего времени ограничено не очень большими по размерам белками и умеренным диапазоном рН среды. Метод изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в настоящее время является, пожалуй, наиболее мощным аналитическим методом сепарации белков. Применение метода электрофокусиро-
вания не только для сепарации белков, но и для других биополимеров остается актуальной нерешенной проблемой.
Возможность фокусирования амфотерных полиэлектролитов в диффузионных градиентах рН без применения амфолитов давно привлекает к себе внимание исследователей. Недавно в [18] были вновь получены решения стационарных уравнений для градиентов концентраций ионов в электрическом поле и предложено их использовать для изоэлектрического фокусирования белков. Вместе с тем, изучение стабильности, устойчивости таких стационарных градиентов концентраций ионов до настоящего времени вообще не проводилось, хотя еще 30 лет назад X. Рильбе [16,17] указал на неустойчивость градиентов распределений ионов. Исследование перечисленных и других важных аспектов метода электрокинетического фокусирования способствует расширению области применения метода и спектра исследуемых с его помощью макромолекул полиэлектролитов.
С самого начала работы предполагалось получение результатов прикладного, инновационного характера, в том числе — разработка новых подходов и способов фракционирования и фокусирования макромолекул. На основе разработанных моделей динамики полиэлектролитов в электрокинетических процессах сепарации в работе предложены и апробированы новые методы фракционирования — нелинейный импульсный гель-электрофорез и нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях, а также методика быстрой сепарации длинных фрагментов ДНК.
Двойной слой и его поляризация во внешнем поле играют определяющую роль во всех электрокинетических процессах и явлениях, а также и в процессах электродной кинетики, протекающих на электродах[19]. Моделирование двойного слоя и электродной кинетики, включая расчет вольтампер-ных характеристик и моделирование тафелевской зависимости скоростей электродных реакций от потенциала электрода, имеют самостоятельное значение для разработки систем контроля буфера в современных микрофлюидных системах сепарации и в капиллярном электрофорезе.
Целью работы является развитие физических основ современных электрокинетических процессов фракционирования и фокусировки полиэлектролитов для повышения эффективности и расширения возможностей существующих и разработки новых практических электрокинетических методик сепарации. .
В ходе исследования рассматривались следующие основные задачи: изучение нелинейных и дисперсионных свойств электрокинетической подвижности макромолекул на примере импульсного гель-электрофореза полимерных цепей ДНК;
разработка теоретических моделей динамики полиэлектролитов, позволяющих объяснять ключевые эксперименты по импульсному гель-электрофорезу макромолекул;
исследование процессов электрофокусирования полиэлектролитов, включая изоэлектрическое фокусирование и фокусирование в неоднородных электрических полях;
разработка новых — нелинейных методов электрофореза и фокусирования макромолекул и исследование нелинейной электрокинетической подвижности полиэлектролитов;
методические вопросы моделирования электрокинетических явлений и . процессов.
Работа выполнена в Новосибирском государственном университете в соответствии с планами научных исследований НИЧ НГУ по темам С-98 и С-01,-02 «Разработка методов и устройств для фракционирования биологических макромолекул».
На защиту выносятся:
-
теоретические модели электрокинетической подвижности полиэлектролитов в импульсных полях и их приложения для описания одномерного и двумерного импульсного гель-электрофореза, включая дисперсионную модель, модель неидеального одномерного газа рептонов и теорию одномерной «гидродинамики», призванную заменить теорию рептаций для случая длинных полимерных цепей и умеренных и сильных полей;
-
результаты численного моделирования диффузионной теории рептаций и теории «одномерной гидродинамики» на кластере из 11 компьютеров;
-
модели процессов электрокинетического фокусирования макромолекул в градиенте рН и в неоднородных электрических полях, а также критерий устойчивости градиентов рН в задачах изоэлектрического фокусирования. Комплекс программ для расчета неоднородных электрических полей и моделирования движения макромолекул полиэлектролитов в сеансах импульсного гель-электрофореза и в процессах электро фокусирования;
-
практические приложения разработанных теоретических моделей:
новый метод нелинейного импульсного гель-электрофореза для сепарации биологических макромолекул, включая фрагменты ДНК и комплексы белков;
новый метод электрокинетического фокусирования макромолекул - нелинейная фокусировка полиэлектролитов в неоднородных электрических полях;
оригинальная методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК для скоростной биомедицинской диагностики бактериальных заражений;
-
результаты экспериментов по наблюдению нелинейной подвижности полимерных цепей ДНК и комплексов белков с ионными детергентами;
-
методические результаты: асимптотическая теория двойного слоя для сферического электрода с учетом сложной кинетики электродных реакций в электролитах и основанный на этой модели алгоритм расчета вольтам-перных характеристик, а также его приложения к решению обратных задач электродной кинетики;
Научная новизна. Выполненное исследование позволило автору получить ряд новых научных, методических и прикладных результатов:
развита дисперсионная теория электрокинетической подвижности по-лиэлектролитов, позволившая объяснить ключевые эксперименты по импульсному гель-электрофорезу ДНК и научиться предсказывать области эффективной сепарации;
для описания движения длинных полимерных цепей в импульсных ПОЛЯХ предложена новая теория одномерной «гидродинамики», включающая впервые полученное термодинамическое уравнение состояния отрезка цепи в поре геля, а также нелинейное уравнение динамики длины полимерной цепи в геле;
получено аналитическое описание нестационарного процесса электрокинетического фокусирования полиэлектролитов, Исследована устойчивость градиентов рН в электрических полях в многокомпонентных буферных системах и получен критерий устойчивости градиентов рН в задачах изоэлектрического фокусирования;
на основе теоретических моделей и численных расчетов предложены и апробированы новые методы фракционирования - метод нелинейного импульсного гель-электрофореза и метод нелинейной фокусировки макромолекул в неоднородных электрических полях;
в сеансах импульсного гель-электрофореза впервые обнаружена аномальная зависимость нелинейной подвижности от размеров макромолекулы для фрагментов ДНК и комплексов белков и ионных детергентов;
впервые получена нелинейная фокусировка молекул ДНК в неоднородных электрических полях;
предложена и апробирована новая методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК, позволяющая исключить инверсию фракций, увеличить скорость сепарации в 4-5 раз, по сравнению с лучшими мировыми образцами;
На основе асимптотической модели двойного слоя, с учетом сложной электродной кинетики, развит метод оценки параметров в задачах электродной кинетики;
Практическая значимость работы. Практическому приложению рассматриваемых в работе теоретических моделей и расчетов в работе уделено особое внимание. Разработанные модели подвижности длинных цепей ДНК и комплексы программ являются необходимыми для практики инструментами прогноза эффективных областей сепарации макромолекул. На основе развитых моделей динамики полиэлектролитов в работе предложены новые практические методы электрофореза — нелинейный импульсный электрофорез ДНК и комплексов протеинов, нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях, а также прикладная методика быстрой сепарации длинных фрагментов ДНК, которая представляет большой интерес для скоростной биомедицинской диагностики.
Достоверность результатов работы основана на тщательном анализе развиваемых моделей, сопоставлении расчетных данных с аналитическими моделями и данными эксперимента, тестировании численных алгоритмов на известных аналитических решениях, а также на использовании аналитических вычислений на ЭВМ.
Апробация работы. Полученные результаты докладывались на научных семинарах Кафедры общей физики Физического факультета Новосибирского государственного университета, Кафедры физики полимеров и кристаллов Физического факультета МГУ, а также на научных семинарах институтов РАН, в частности, на семинарах Института цитологии и генетики СО РАН, Института химической кинетики и горения СО РАН, Института вычислительных технологий СО РАН, Института теплофизики СО РАН.
Основные результаты докладывались на отечественных и международных конференциях и симпозиумах: на III Генеральной ассамблее Ассоциации азиатских Академий наук -"The Impact of Biotechnological Advance in Asia", 2002 (Израиль), на III международном конгрессе электрофоретических обществ ICES-2001 Верона, (Италия), на VI Симпозиуме "Interface of Regulatory and Analytical Sciences for Biotech Health Products" 2002 (Япония), на международных конференциях "Хроматография высокого давления" HPLC99 (Испания) 1999, XIII международной конференции по диэлектрическим жидкостям, Нара, 1999, (Япония), на VII Португальском и III Иберийском симпозиуме по электрохимии, Фаро (Португалия), 1995, на V международной конференции «Кинетика в аналитической химии», Москва, 1995, Всесоюзной школе-семинаре: «Теория и методы решения некорректно поставленных задач», Новосибирск, 1983, III Всесоюзной школе-конференции по современным методам магнитного удержания, нагрева и диагностики плазмы, Харьков, 1982.
Публикации. Содержание диссертации отражено в 25 работах в журналах и сборниках, из них 8 статей в журналах из списка ВАК, 1 Web-публикация ([13*]) и 3 публикации в трудах конференций.
Личный вклад автора. Все теоретические результаты и результаты моделирования, вошедшие в диссертацию, получены при определяющем личном участии автора в постановке и решении задач. Программный код. дисперсионной модели выполнен автором, код одномерной гидродинамической модели подготовил В.В. Часовских, код комплекса "Laplas" — Ю.А. Целовальников. Автор участвовал в постановке, организации и анализе результатов приведенных в работе электрофоретических экспериментов, а сами эксперименты были выполнены СЕ. Пельтеком.
Структура и объем диссертационной работы. Общий объем работы включает 266 страниц, в том числе 44 рисунка и 3 таблицы. Работа состоит из введения, пяти глав с выводами, заключения, приложения и списка цитируемой литературы (236 наименований).
Диффузионная теория рептаций
В этой главе будет рассматриваться в основном свободно-сочлененная полимерная цепь[8,9,28-31], состоящая из набора жестких сегментов с характерным размером Ъ. В такой цепи сегменты могут свободно поворачиваться в сочленениях на любой угол, не меняя внутренней энергии цепи. Применительно к молекуле ДНК, размер сегмента выбирается равным куновской длине, которая определяет максимальный размер эффективного «жесткого» сегмента гибкой полимерной цепи [8]. Эффективный сегмент полимерной цепи зависит не только от ее упругих свойств, но и от состава буфера и неявно учитывает электростатическое взаимодействие соседних сегментов цепи между собой.
Рассмотрим полимерную цепь, помещенную в гель, который представляет собой набор пор (ячеек), образованных сеткой геля. На Рис. 9 представлен отрезок свободно-сочлененной цепи, занимающий одну пору геля и состоящий из четырех сегментов, которые отличаются своими углами наклона в к направлению поры. Поры геля будем характеризовать их среднеквадратичным размером h и отношением m=h/b (2.1)
Предполагается, что эффективный размер L полимерной цепи значительно превосходит размер поры геля h, который, в свою очередь, больше чем размер сегмента Ь: L»h b.
Большой размер поры геля, по сравнению с длинной эффективного сегмента цепи, вполне соответствует практическим вариантам импульсного гель-электрофореза длинных фрагментов ДНК в агарозном геле. Сравнительно большие поры геля приводят к тому, что цепь может ветвиться - просачи 65 ваться в соседние поры. Такая динамика полимерной цепи заметно отличается от движения в тонкой «трубке», которое использует теория рептаций. Полимерная цепь ДНК является равномерно заряженной с плотностью заряда на единицу длины х- Заряд одного сегмента определяется выражением Для 1% агарозного геля, параметры h и b можно принять равными, примерно, -0.3 мкм и 0.1 мкм соответственно. Это дает значение параметра т = 3. В качестве оценки величины % примем значение 250-1-330 элементарных зарядов на 1 мкм, принятое в диффузионной теории BRM.
Оценим отношение є электрической энергии qEb одного сегмента к тепловой энергии Т. В полях напряженностью 1-г10 В/см это отношение соста у 1 вит є = qEb/T= \0" -г 10" . Эти оценки показывают, что во всем диапазоне полей, обычно используемых для электрофореза, е 1, что позволяет развивать методы возмущений по этому параметру.
Для описания состояния цепи вводится в рассмотрение плотность w длины полимерной цепи в отдельной поре геля, определяемая соотношением w = L/h, (2.2) где / - длина отрезка цепи, находящегося в данной поре геля, h - среднеквадратичный размер цепи. Длина / как раз и есть та субстанция, которая «течет» из одной поры в другую и приводит к движению всей цепи, Плотность W длины полимерной цепи является вполне измеримой величиной, в отличие от плотности рептонов в теории рептаций, и играет ту же роль, что и плотность массы в задачах физики сплошной среды.
Удобно ввести число п эффективных сегментов цепи, находящихся в одной средней поре геля: п = 1/Ь (2.3)
Используя соотношения (2.0) - (2.3), плотность длины w представим в виде отношения w = n/m (2.4) Рис. 9. Отрезок свободно-сочлененной полимерной цепи в одной поре геля. Пронумерованы четыре сегмента цепи. Пунктиром обозначена выделенная пора геля. Предельное значение плотности длины w = 1 соответствует полностью растянутой цепи (п = т). В отсутствии электрического поля цепь ДНК имеет равновесную конформацию стохастического клубка с характерным размером R = (bL)ia. Для дальнейшего представляет интерес определить равновесную плотность длины w0 в поре геля в отсутствии поля. Для длины / отрезка свободно-сочлененной цепи, среднеквадратичный размер которого равен размеру поры, можно записать h2 = Ы (2.5) Это выражение, которое можно представить в виде т - «, (2.6) является точным для свободно-сочлененной цепи [8]. Его сравнение с аналогичным выражением для более реалистичной (для случая ДНК) модели пер-систентной цепи [8], показывает, что область применимости модели свободно-сочлененной цепи на размере одной поры геля дается неравенством: п 1 (2.7) Это неравенство ограничивает концентрации агарозного геля величиной, примерно равной или меньшей 1%.
Подставляя выражение (2.6) в уравнение (2.4), для равновесной плотности длины полимерной цепи в отсутствии поля, когда цепь имеет конформацию стохастического клубка, получим
Свободно-сочлененная полимерная цепь
Расчеты, проведенные на основе описанной выше дискретной гидродинамической модели, позволили количественно интерпретировать некоторые наиболее интересные эксперименты по импульсному гель-электрофорезу длинных цепей ДНК в агарозном геле. Расчетная модель явилась своего рода микроскопом, позволившим разглядеть особенности поведения длинной полимерной заряженной цепи в переменных полях.
Основной полученный результат состоит в том, что расчеты подтвердили возможность возникновения глубоких минимумов подвижности в умеренных (2-8 В/см) электрических полях. Расчеты проводились для "классического" варианта одномерного импульсного гель-электрофореза (FIGE), когда длительность прямого (положительного) импульса поля Т+ в 3 раза превышает длительность 71 обратного (отрицательного) импульса (J?T = TJT. = 3), а амплитуды положительного Е+ и отрицательного Е. импульсов поля были одинаковы (Rr, = Е+/Е. = 1).
В процессе расчетов велось наблюдение за движением одной цепи ДНК в течение большого числа периодов поля. Среднее по времени движение цепи, в предположении эргодичности процесса, должно совпадать со средним по большому ансамблю цепей, которое наблюдается в реальном эксперименте.
Качественное описание движения цепи в ходе численных экспериментов, на первый взгляд, мало отличается от давно предложенного качественного описания [65], отводящего особую роль U-образным конформациям цепи. Существенное отличие состоит в исключительно важной роли ветвлений цепи процессе ее движения [46].
При движении цепи в ее передовых сегментах возникает повышенная плотность длины, что с неизбежностью приводит к образованию ветвлений. Цепь практически всегда движется по пути, проложенному одним из ветвле ний. В процессе движения цепи ветвления постоянно возникают и исчезают. Между ними происходит своего рода конкуренция за поток длины. Те из них, которые расположены вдоль направления поля, растут быстро, а случайно возникшие ветки, ориентированные под углом к полю, постепенно "рассасываются". Такая конкуренция приводит в результате к сильной ориентации цепи вдоль направления поля. Эта ориентация заметно больше, чем, если бы она была обусловлена только ориентацией крайнего сегмента цепи внешним полем. Численные эксперименты показали, что даже если занятие новой поры происходит изотропно, независимо от направления поля, цепь, тем не менее, после "естественного отбора" ветвлений, становится заметно ориентированной по полю.
В постоянных полях движение длинной цепи является довольно равномерным, но сопровождается заметными флуктуациями, причем нередко образуются и U-образные конформации. При этом головной и хвостовой участки цепи часто меняются местами, что неоднократно отмечалось и в эксперименте. В переменных полях при переключении знака поля U-образные конформации возникают практически всегда. Именно они ответственны за глубокий минимум подвижности - "антирезонанс". Но этот глубокий минимум молено получить только с учетом внутреннего трения цепи в ее ветвлениях. Без учета этого трения ветвления быстро исчезают, и U-образная конформа-ция сменяется J-образной, затем быстрой 1-образной конформацией, приводящей к большой скорости движения цепи и к неглубокому минимуму подвижности в «антирезонансе». Учет внутреннего трения в ветвлениях приводит к тому, что цепь эффективно может быть разбита на почти независимые отрезки между соседними ответвлениями. И если даже если одна из ветвей U- или J-образной конформации превосходит по длине другую, в ней, в силу большого потока длины, с необходимостью образуются ответвления, которые не только замедляют ее рост, но и приводят к росту потока длины в короткую ветвь J-образной цепи. Этот механизм обусловливает большую ста бильность U-образных конформаций, которые дают основной вклад в падение подвижности в «антирезонансе».
Последовательные стадии движения цепи, рассчитанные по вышеописанной дискретной модели, представлены на Рис. 12.
В «антирезонансе» большую часть периодов цепь колеблется на одном месте. В конце каждого положительного импульса поля она приобретает явно выраженную U-образную конформацию. После переключения поля в вершине U-образной цепи возникает большое число (пучок) ответвлений. Пока между новыми ветвями происходит конкуренция за поток длины, они движутся медленно. При этом два конца U-образной конформаций сравнительно быстро сокращаются, так как они были сильно вытянуты в направлении действия поля. Их сокращение обеспечивает потоком длины рост новых ветвлений.
В результате конкуренции ветвлений цепь приобретает компактную форму "куста", состоящего из многочисленных ветвлений. Когда поле вновь становится положительным, из этого "куста" начинают расти новые ветви в направлении действующего поля. Две из них, ближайшие к концам цепи, имеют наибольшие шансы вырваться вперед, так как у них нет конкурентов со стороны краев цепи. Поэтому, как правило, из "куста" вырастают две "руки" и вновь формируется U-образная конформация.
Устойчивость стационарных распределений ионов В электрических полях
Для начала обратимся к случаю буферного электролита, в котором имеется всего два сорта ионов - один анион и один катион. Разумеется, такая система редко встречается на практике. Вода уже сама по себе содержит два сорта ионов - ион водорода Нг и ион гидроксила ОН". Добавка кислоты или основания приводит к появлению еще, по крайней мере, одного сорта ионов. Однако в случае очень кислого буфера, концентрация ионов гидроксила становится пренебрежимо мала по сравнению с концентрацией двух других ионов, и такую систему можно приближенно считать состоящей только из двух сортов ионов. Аналогично, в предельно основной области можно не учитывать концентрацию ионов водорода.
Случай двух сортов одновалентных ионов, известный в физике плотной плазмы как "амбиполярная диффузия" [123], удается свести к уравнению диффузии, исключив из уравнений электрическое поле:
Здесь С - концентрация аниона, равная концентрации катиона, Dam = DCD.J(DC+Da) - коэффициент амбиполярной диффузии, a Dc и Da - коэффициенты диффузии катиона и аниона, соответственно.
Известно, что стационарное решение уравнения диффузии абсолютно устойчиво. Поэтому градиенты концентрации для буферной системы с двумя сортами ионов, таюке являются устойчивыми. Тем не менее, покажем еще раз, что стационарное решение уравнения (3.29) устойчиво, чтобы описать и проверить метод исследования устойчивости, который далее применяется для более реалистичной буферной системы с большим числом сортов ионов.
Для простоты будем рассматривать плоский двумерный слой электролита (геля). Введем декартову систему координат, направив ось X вдоль, а координату Y - поперек слоя. Стационарное решение уравнения (3.29) удовлетворяет уравнению Лапласа и, как будет далее показано, в одномерном случае приводит к линейной зависимости концентрации С от координаты х.
Решение уравнения (3.29) для малых возмущений концентрации с будем искать с помощью метода Фурье в виде бегущей волны с = с0 exp(-icot+ikxx+ ікуу), (3.30) где с0 амплитуда волны возмущения, і - мнимая единица, со частота, а кх, ку Т п т компоненты двумерного волнового вектора к волны, причем к = кх + ку . Волновой вектор к характеризует масштаб возмущения / \!к. Подставляя выражение (3.30) в уравнение (3.29), получим дисперсионное уравнение, определяющее зависимость частоты со от волнового вектора к: со = -Юк2 (3.31) Из последнего уравнения видно, что мнимая часть частоты всегда отрицательна: Гпц» - - Dk2 0 (3.32)
Критерием неустойчивости является положительность мнимой части частоты. Следовательно, стационарное решение уравнения (3.29) устойчиво отно сительно малых возмущений. Заметим, что в отсутствии диффузии (D = 0) дисперсионное уравнение имеет вид: а = 0. При этом амплитуда возмущения не меняется, а остается постоянной. В отсутствии диффузии, возмущения в системе из двух ионов существовали бы неограниченно долго, не затухая и не возрастая. Именно диффузия приводит к затуханию возмущений и к устойчивости градиентов концентраций ионов.
Рассмотренный выше случай буферной системы с двумя сортами ионов далек от реальности и мало пригоден для проведения изоэлектрического фокусирования. На практике использование только одной кислоты или только одного основания не позволяет создавать градиенты рН, в диапазоне более единицы рН, ввиду сильной неоднородности электрической проводимости. В этом случае также ограничены возможности вариации проводимости среды и подбора оптимальной выделяемой тепловой мощности.
В случае большего числа типов ионов, как будет далее показано, градиенты их концентраций в электрическом поле действительно могут оказаться неустойчивыми. Неустойчивость стационарного решения означает, что на практике оно не реализуется, а возникает, например, разрывное или нестационарное автомодельное решение (диффузия).
Исследование устойчивости градиентов для системы из трех сортов ионов (два катиона и один анион, или два аниона и один катион) начнем с рассмотрения стационарных распределений градиентов концентрации в присутствии поля. Стационарное решение можно значительно упростить в случае сильных полей, характерных для ИЭФ. Оценим диффузионный и миграционный потоки ионов для слоя геля размером L = 10 см, на который подано напряжение 7=250 В. Миграционный поток имеет порядок CU/L, а диффузионный можно оценить как (C/L)T/e. Здесь Т- температура в энергетических единицах. Отношение первого ко второму при обычной температуре состав ляет elJIT 10 . Таким образом, всюду, кроме границ электролита (вблизи электродов), в выражениях (4) диффузионным потоком можно пренебречь по сравнению с миграционным.
Одномерный нелинейный гель-электрофорез комплексов белков и ионных детергентов
Среди численных методов решения краевых задач МГЭ получил в последние годы значительное распространение. Он используется для проведения расчетов электростатических полей, в теории волн на воде, в задачах упругости и пластичности и в других практических приложениях [129-134, 91].
Одной из проблем, присущих данному методу, является необходимость аппроксимации как функции на границе, так и самой границы области. На практике часто используются самые простые схемы невысокого порядка ап 131 проксимации. Вместе с тем, при низком порядке аппроксимации границы не оправдано и повышение порядка аппроксимации самой функции на границе, поскольку это не приводит к гарантированному росту точности расчетов.
В данном разделе, в рамках метода потенциала для краевой задачи Дирихле [135, 136] для уравнения Лапласа, путем замены интеграла по границе области интегралом по углу, в уравнении для потенциала двойного слоя, предлагается подход, не требующий какой-либо аппроксимации границы, что открывает новые возможности для численного решения задачи и повышает точность расчетов.
Обратимся, сначала к постановке задачи и варианту ее решения в рамках метода граничных элементов. Рассмотрение проводится на примере внутренней задачи Дирихле для двумерных областей.
Для решения такой задачи в работе [90] автором была предложена модификация МГЭ в рамках теории потенциала, основанная на замене интеграла по границе области интегралом по углу в уравнении для потенциала двойного слоя. Угловая переменная дает естественную параметризацию границы, что позволяет полностью исключить проблему ее аппроксимации и заметно повысить точность расчетов. Дается описание и апробация алгоритма для двумерных областей, кратко обсуждаются его особенности применительно к невыпуклым и трехмерным областям.
В теории потенциала [135-139] нахождение решения p(p),peQ, крае-вой задачи Дирихле в области Q cR , (R - множество всех точек на плоскости XY), удовлетворяющего в ней уравнению Лапласа и граничному условию р =/на границе Г области, сводится к задаче расчета на этой границе потенциала двойного слоя \х. Для последнего справедливо интегральное уравнение: + JM(q) u4=f(P) А?єГі (3.60) где / pq- радиус-вектор из точки границы р в точку области q, п — внешняя нормаль к границе в точке q, d/q — элемент длины границы Г. Направление обхода границы выбирается так, чтобы область П всегда находилась слева. 132 Решение задачи Дирихле и(р) в области Q. определяется интегралом 1 (пг ) ?00 = — irtqy- di, ,РєО, г (3.61) В простейшем случае МГЭ исходит из аппроксимации границы области ломаной, образованной т отрезками прямых - граничными элементами. На этих граничных элементах, с центрами в точкахp, j=\,..,m, определены кусочно-постоянные сеточные функции u.j=p,(pj) и/j fip\)- В итоге, для неизвестного вектора щ задача сводится к решению системы т линейных алгебраических уравнений следующего вида: и 1=т f + IV r/ f=l,.,m (3.62) І71 ./=1 Матрица а\\ определяется выражением; щ = {nf hjilnr1 /#/ , (3.63) где ц - вектор из точкир\ в точку j, ц = \t\j\, hj - размеру-го граничного элемента, « - заданный вектор внешней нормали к соответствующему граничному элементу. Для расчета сингулярных диагональных элементов матрицы яц применяется теорема Гаусса: 2 ;=l,(Sj
Система линейных алгебраических уравнений (3.62) решается затем для определения потенциала двойного слоя ц. ГТереходя к рассмотрению нового алгоритма, заметим, что интегрирование по границе области в (3.60) можно заменить интегралом по углу 0 [136]: d0 = (Vpq)d /q// 2pq (3.65)
Пусть {pj ETJ =1,..,W}- набор точек границы. Для фиксированной точки р, определим 8j как угол, отсчитываемый от оси абсцисс в декартовой системе координат с вершиной в точке р\. Для удобства рассмотрения повернем систему координат так, как показано на Рис. 20, чтобы ось ординат совпадала 133 с касательной к границе в точкер; (не учитывая пока возможных угловых точек границы). Каждой точкер #р\ можно поставить в соответствие угол Щ, равный у -у. 0jj = arctan
Этот угол фактически задает естественную параметризацию границы, что позволяет обойти проблему ее аппроксимации граничными элементами. Заметим, что пределы интегрирования, после сделанного поворота системы координат, для выпуклой гладкой границы, не имеющей угловых точек, будут равны -71:/2,+ я/2.
Таким образом, задача определения элементов матрицы щ сводится к нахождению коэффициентов квадратурной формулы при вычислении угловых интегралов по значениям подынтегральной функции в точках, вообще говоря, неравномерной сетки 0jj, заданной точками y j,y-l,..,m, при фиксированной точке рь на интервале [-тс/2, +я/2]. Эта задача может быть легко решена на основе любой подходящей квадратурной формулы. В частности, были проверены варианты с формулой прямоугольников и формулой трапеций. Для формулы прямоугольников элементы матрицы а-ц находятся, исходя из соотношений йги - (8ij+1 - 8 )/271 9ij+1 = arctan( ). (3.66) xj+i xi Причем, еслиу+1 = і, то 6;J+I = +7i/2, и 0JJ+I = -тг/2, если у = і. Аналогично для формулы трапеций нетрудно получить: Яц = (Bij+l - 9ij_l)/47C Щ = (9ij+i - 9jj_i + %)/4к для i=j (3.67) где Є,і+1 - arctan(- 4, 0,и = arctan( - -), (3.68) Xj+\ Xi xJ_] xi Причем, ЄСЛИу+1 = І, TO Gjj+i = +7СІ2, И, ЄСЛИ у-1 = І, ТО 9у_1 = -%/2. 134 Тестовая проверка алгоритма проводилась для известного решения в круге. В полярной системе координат с углом а, совмещенной с центром круга, в качестве точного распределения потенциала двойного слоя \х было выбрано в виде: fi(a) = a sin(cc) (3.69) При этом правая часть уравнения (3.62) будет равна: J[a) = (asm(a)-l)/2 (3.70) Сравнение относительной ошибки расчетов є вышеописанного МГЭ и предложенного алгоритма с угловыми интегралами при разных значениях т для этой задачи приведено в Таблице 1.
Расчеты показали, что предложенный подход, даже в случае формулы прямоугольников, заметно, - почти в 5 раз, повышает точность численного решения задачи Дирихле в круге, при том же числе точек на границе, по сравнению с формулами (3.63)-(3.64). Как следует из Таблицы 2, относительная ошибка для формулы прямоугольников оказалась почти в 5 раз меньше, чем ошибка вычислений по формулам (3.63)-(3.64), и совпала с ошибкой для формулы трапеций для решения (3.69) в круге.
Наконец, сделаем несколько замечаний, касающихся невыпуклых областей. Для выпуклой области можно поднять порядок аппроксимации функции на границе, используя, например, полином порядка т. Что касается невыпуклых областей, то здесь возникает задача вычисления интеграла от многозначной функции. При этом интеграл следует разбить на отдельные интегралы по областям однозначности функции. Заметим, что интегрирование здесь нужно будет проводить в более широком интервале, чем интервал [-к/2, +71/2].
