Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1.Ботаническая характеристика, химический состав арники облиственной (Arnica foliosa Nutt.Семейства Сложноцветные – Asteraceaе), применение в народной и научной традиционной медицине
1.2. Номенклатура лекарственных средств на основе арники .15
1.3.Современные аспекты технологии получения сухих экстрактов из лекарственного растительного сырья 18 1.4.Технологические особенности получения суппозиториев 22
1.5.Крем – как рациональная мягкая лекарственная форма 27
Выводы к главе 1 .36
Глава 2 Материалы и методы исследования 38
2.1.Материалы исследования 38
2.1.1.Арники облиственной экстракт сухой .38
2.1.2. Вспомогательные вещества .39
2.1.3. Определение фенольных соединений методом ВЭЖХ .42
2.1.4. Определение фенольных соединений методом спектрофотометрии .43
2.2.Методы исследований .45
2.2.1.Методы оценки подлинности субстанции, суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС
45 2.2.2. Количественное определение суммы фенольных соединений в субстанции и лекарственных формах–в пересчете на лютеолин-7-глюкозид 60
2.2.3.Технологические характеристики активного вещества 76
2.2.4.Методы определения физико-химических, технологических и
биофармацевтических свойств суппозиториев, содержащих АОЭС 79
2.2.5. Методы определения структурно-механических свойств 1,5% крема, содержащего АОЭС .82
2.3. Статистические методы .84
Заключение к главе 2 84
Глава 3. Технология получения лекарственных форм, созданных на основе АОЭС 86 3.1.Технология получения суппозиториев на основе АОЭС 86
3.2.Технология получения крема 1,5% на основе АОЭС 98
Выводы к главе 3 109
Глава 4. Доклиническое изучение безопасности лекарственных форм, созданных на основе АОЭС. 110
4.1.Микробиологическое изучение субстанции, суппозиториев ректальных и крема 1,5% созданных на основе АОЭС .110
4.1.1.Результаты бактериостатической и фунгистатической активности субстанции, суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС .112
4.2. Изучение стабильности суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС в процессе хранения 114
4.3.Токсикологическое изучение суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС .119
4.3.1.Результаты экспериментального токсикологического изучения суппозиториев ректальных на основе АОЭС 122
4.3.2.Результаты токсикологического изучения крема 1,5% на основе АОЭС 125
4.3.3. Результаты изучения аллергизирующего действия крема 1,5% на основе АОЭС 128
4.3.4.Результаты изучения противовоспалительных и репаративных свойств крема 1,5% на основе АОЭС 129 Выводы к главе 4 132
Общие выводы 133
Список сокращений 134
Список литературы 135
- Номенклатура лекарственных средств на основе арники
- Определение фенольных соединений методом ВЭЖХ
- Методы определения структурно-механических свойств 1,5% крема, содержащего АОЭС
- Изучение стабильности суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС в процессе хранения
Номенклатура лекарственных средств на основе арники
Род арника в мировой флоре насчитывает 32 вида. На территории России и стран СНГ произрастает восемь видов: арника горная (Arnica Montana L.), арника уналашкинская (Arnica unalaschcensis Less.), арника сахалинская (Arnica sachalinensis A.Gray), арника Лессинга (Arnica lessingei L.Green), арника Шамиссо (Arnica chamissonis Less.), арника облиственная (Arnica foliosa Nutt.) и др.[113].
В Западной Европе арника – как лекарственное растение, известна еще в раннем Средневековье. Расцвет применения вытяжек из арники в медицине приходится на XVIII в., когда ее назначали внутрь и наружно при самых различных заболеваниях.
В России в медицинской практике разрешены к использованию три вида арники – арника горная (Arnica Montana L.), арника Шамиссо (Arnica chamissonisLess.) и арника облиственная (Arnica foliosa Nutt.)[113].
Все три вида арники содержат комплекс биологически активных веществ, представляющих различные классы химических соединений – флавоноиды (кверцетин, кемпферол, лютеолин, апигенин, изорамнетин, изокверцетин, сколимозид, цинарозид, изокверцитрин, космосиин, астрагалин и др.), эфирное масло с сесквитерпеновыми лактонами (арнифолин, геленалин, 11-a,13-дигидрогеленалин, арниколиды А-Е и др.), тритерпеноиды–(арнидиол,фарадиол и их смесь – арницин), полисахариды, дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты (кофейная, хлорогеновая, феруловая и др.), непредельные фитостерины, оксикумарины (скополетин, умбеллиферон), каротиноиды. В основном был изучен химический состав цветков арники, поскольку в медицинской практике они применяются чаще, чем остальные части растения [33, 45, 64, 72–73, 132– 134,139–140].
По литературным данным установлено, что противовоспалительное, противомикробное действие–и эффект ингибирования агрегации тромбоцитов, обусловлены наличием эфирного масла в цветках арники, в состав которого входят сесквитерпеновые лактоны – геленалин и 11-a,13-дигидрогеленалин. Арнифолин обладает миотропным действием (усиливает сократительную деятельность матки). Подобным действием обладают и азотсодержащие основания – холин и бетаин[33,70]. Тритерпенодные соединения, содержащиеся в сырье, проявляют местнораздражающее действие, что в свою очередь способствуют рассасыванию кровоизлияний, а цинарин, флавоноиды и полиацетилены оказывают желчегонное действие [49, 64]. Фенольные соединения арники также обладают противовоспалительным и капилляроукрепляющим действием[101]. Противовоспалительной активностью обладают и каротиноиды. Полисахариды арники оказывают иммуностимулирующее действие. Аминокислоты обладают антиаритмической активностью[22, 85, 135]. В настоящее время препараты из арники широкоиспользуются в гомеопатии во многих странах мира, в том числе и в России. Так например, в Германии и Польше препараты на е основе применяются при лечении гипертонии, стенокардии, бронхиальной астмы, истерии, ревматизма, хронического ларингита, сухого плеврита и др.[34]. Арника горная, произрастающая в Европе входит в фармакопеи (ГГФ, ФФ, ГФИ, ГФСШ), где ее используют как целое растение, так и отдельно – соцветия, подземную и надземные части[89].
В сборнике фармакопейных статей по гомеопатии Российской Федерации имеется статья на настойку гомеопатическую матричную из арники горной, которую получают из высушенных корневищ с корнями растения и используют для приготовления гомеопатических лекарственных средств [97].
Высушенные цветки арники горной являются официнальным лекарственным растительным сырьем во многих странах Западной Европы, США, Мексике, ряде стран Южной Америки, Турции, Индии и Японии, а также в России. Листья арники горной являются официнальным видом сырья в Венесуэле. Корневища и корни арники –как лекарственное сырье, входили в I–III издание отечественной фармакопеи. Препараты, полученные из нее обладают возбуждающим действием на функцию сердечно-сосудистой системы, увеличивают коронарный кровоток, расширяют коронарные сосуды при различных патологических состояниях, атеросклерозе, миокардитах и сердечных ангиоспазмах, увеличивают амплитуду сердечных сокращений, например: «Пумпан», капли гомеопатические и таблетки подъязычные гомеопатические, производства Рихард Биттнер АГ, Австрия.
Настойка из цветков арники горной входит в фармакопеи Франции IX издания, Швейцарии VI издания, а также в Европейскую фармакопею. В России качество настойки арники регламентируется ФС-42-2061-83. Ее применяли внутрь в качестве кровоостанавливающего средства в акушерской и гинекологической практике при недостаточной инволюции матки в послеродовом периоде и воспалительных заболеваниях мочеполовой системы, при внутренних кровотечениях, а также в стоматологической практике–как противовоспалительное и кровоостанавливающее средство [33, 52, 70, 114]. Наружно настойку и настой цветков арники использовали в виде компрессов и примочек при ранах, болях в мышцах, при лечении гнойничковых заболеваний кожи, язвах, ожогах, для рассасывания гематом при ушибах[33, 70, 107].
Таким образом, в практической медицине препараты арники применяли как кровоостанавливающее, противовоспалительное, общеукрепляющее, желчегонное, гипотензивное и гипохолестеринемическое средство[27,107]. В народной медицине препараты арники применяли внутрь как жаропонижающее средство, а также наружно при кожных высыпаниях, ревматизме, подагре, переломах и мышечных болях [92].
В Российской Федерации официнальным видом сырья являются только цветки растения рода арника, а лекарственными препаратами – настойка из цветков арники, а также настойка матричная гомеопатическая арники горной, что существенно ограничивает возможности применения растений рода арника [29, 74,85].Кроме того, арника горная является дикорастущим, редким, исчезающим видом, занесенным в Красную Книгу [32,46,65]. В настоящее время наиболее распространенным видом являются арника облиственная и арника Шамиссо, которые введены в культуру. Возделывание указанных видов арники оказалось вполне возможным, причем наиболее предпочтительным выбран вид арники облиственной, в связи с более крупными цветочными корзинками, что делает ее сбор менее трудоемким [51, 74]. В связи с этим, для дальнейших исследований с целью создания лекарственных препаратов была выбрана трава арники облиственной[76].
Определение фенольных соединений методом ВЭЖХ
Специфичность методики подтверждается тем, что: – время удерживания пика лютеолин-7-глюкозида на хроматограммах испытуемого раствора совпадает со временем удерживания соответствующего пика на хроматограммах раствора стандартного образца лютеолин-7-глюкозида с точностью до 0,1 %; – выбранные условия хроматографирования позволяют разделить пики лютеолин-7-глюкозида (коэффициент разделения 1,5) и сопутствующих веществ, отделив их от системного пика; – компоненты плацебо и возможно образующиеся примеси на хроматограммах испытуемых растворов не мешают определению количественного содержания. Проверка пригодности хроматографической системы.
Для проверки пригодности хроматографической системы перед хроматографированием испытуемого раствора и раствора ГСО лютеолин-7-глюкозида 20 мкл раствора ГСО лютеолин-7-глюкозида хроматографируют, получая не менее 5 хроматограмм, в условиях, описанных выше. Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия: - эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику лютеолин-7-глюкозида, должна быть не менее 1000 теоретических тарелок. Эффективность хроматографической колонки рассчитывают по формуле: N = 5,545 ММ где: 1R- время удерживания основного пика, в миллиметрах; W0j5- ширина пика на половине высоты, в миллиметрах; - относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площадей пика лютеолин-7-глюкозида по результатам пяти измерений составляет не более 2 %; - коэффициент асимметрии пика (Т) лютеолин-7-глюкозида должен составлять не более 2. Формула расчета коэффициента асимметрии: где: W0jo5 - ширина пика на высоте 5% от базовой линии, мин; f-расстояние от фронта пика на высоте 5% от базовой линии до перпендикуляра, проведенного из его вершины до базовой линии, мин; - допускается наличие не более одного пика, площадь которого превышает половину площади пика, полученного на хроматограммах раствора сравнения (1,0 %); – сумма площадей всех пиков, за исключением основного пика экдистерона, на хроматограммах испытуемого раствора не должна превышать площади пика, полученного на хроматограмме раствора сравнения, более чем в 1,25 раза (2,5 %).
Методика характеризуется сходимостью (повторяемостью) и отвечает требованиям промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности.
Метрологические характеристики приведены в табл. 7. Ошибка единичного определения c 95% вероятностью не превышает 3,2% . Метрологические характеристики результатов определения лютеолин-7-глюкозида в АОЭС методом ВЭЖХ количественного Установлено, что содержание лютеолин-7-глюкозида в суппозиториях с АОЭС колеблется в пределах от 0,120до 0,131%. Методика валидирована. Подтверждены ее специфичность, пригодность хроматографической системы: – время удерживания пика лютеолин-7-глюкозида на хроматограммах испытуемого раствора совпадает со временем удерживания соответствующего пика на хроматограммах раствора стандартного образца лютеолин-7-глюкозида с точностью до 0,1 %; – выбранные условия хроматографирования позволяют разделить пики лютеолин-7-глюкозида (коэффициент разделения 1,5) и сопутствующих веществ, отделив их от системного пика; компоненты плацебо и возможно образующиеся примеси на хроматограммах испытуемых растворов не мешают определению количественного содержания.
Ошибка единичного определения c 95% вероятностью не превышает 6,3%. Таблица 9.Метрологические характеристики результатов количественного определения лютеолин-7-глюкозида в суппозиториях с АОЭС методом ВЭЖХ
Количественное определение содержания лютеолин-7-глюкозида в креме 1,5%, содержащем АОЭС, напрямую невозможно из-за мешающего определению пика, расположенного непосредственно около такового, принадлежащего анализируемому веществу (рис. 4).
Таким образом, установлено, что АОЭС, суппозитории ректальные и крем 1,5% содержат фенольные соединения, основным компонентом суммы которых является лютеолин-7-глюкозид, что делает перспективной для оценки качества сквозную стандартизацию АОЭС, суппозиториев и крема 1,5% по этому веществу. К сожалению, метод ВЭЖХ не пригоден для количественной оценки содержания этого вещества в креме 1,5 % из-за присутствия пика сопутствующих веществ, мешающего определению.
Также следует отметить, что ВЭЖХ методика оценки качества АОЭС по содержанию лютеолин-7 глюкозида не предполагает полную количественную характеристику БАВ, и не учитывает содержание других веществ фенольного характера.
Поэтому для рутинного анализа и для включения в НД нами использован спектрофотометрический метод анализа определения суммы фенольных соединений в пересчете на лютеолин-7-глюкозид.
Методы определения структурно-механических свойств 1,5% крема, содержащего АОЭС
Одним из методов предварительной оценки биологической доступности лекарственных средств является метод равновесного диализа, с помощью которого можно получить информацию о скорости и полноте высвобождения лекарственных веществ, взаимосвязи их с носителями и другими компонентами суппозиторных основ. Скорость и полнота высвобождения действующего вещества из суппозиторной основы, как указывается в ряде биофармацевтических исследований, в значительной степени зависят от характера используемых основ, растворимости, физико-химических свойств лекарственного вещества и других фармацевтических факторов [31,50,104,120]. Выбор основы для суппозиторий на основе АОЭС, был осуществлен на основании исследований кинетики высвобождения лекарственного вещества из основ различной природы. Методом равновесного диализа (по Крувчинскому) была изучена скорость и полнота высвобождения АОЭС из основ различной природы: ПЭГ–400, витепсол, твердый жир, суппорин М, воск эмульсионный, желатино-глицериновая основа, эмульгаторТ–2.
Кинетика высвобождения действующего вещества (%) из суппозиторных основ в опытах in vitro представлена на рисунке 16. ;
Из экспериментального образца на основе суппорина М высвобождение АОЭС через 120 мин.составляет 72,2%. Из суппозиторной основы, на основе воска эмульсионного + твердый жир, полнота высвобождения через 120 мин. составляет 70,8%. Полнота высвобождения АОЭС из суппозиторной основы на основе эмульгатора Т-2 + твердый жир составляет 69,2%;на основе витепсола максимальная степень высвобождения через 120 мин.составляет 64%, а из основы ПЭГ – 400 полнота высвобождения составляет только 44,8%.
Анализ полученных данных показал, что основа значительное влияет на высвобождение БАВиз лекарственной формы, что в свою очередь оказывает влияниена терапевтическую эффективность лекарственного средства. Поскольку в условиях данного эксперимента высвобождение активного вещества происходит в воду, то полнота высвобождения зависит от растворимости его в воде, от влияния гидрофильных растворителей (1,2–пропиленгликоль, ПЭО), являющихся ингредиентами основы и влияющие на диффузию лекарственного вещества [17]. Выбор вспомогательных веществ осуществлен с учетом требований, предъявляемым к мягким лекарственным формам.
Таким образом, на основании проведенных исследований для дальнейшего изучения выбран образец суппозиториев №3 (таблице 21). Таблица 21.Состав суппозиториев на основе АОЭС (образец №3)
Ингредиенты Нормативный документ Количество, г(на 1 суппозиторий)
Арникиоблиственнойэкстракт сухой ФС42-0171-2953-02 0,05 1,2 -Пропиленгликоль(ПГ) ФС42-0175-5410-9611 0,25 Моноглицеридыдистиллированные(МД) МГД 94 ТУ10-1197-95 0,14 Твин-80 ФС42-2540-88 0,04 Твердый жир (Тип А) ФС42-1117-86 Достаточное количество дополучениясуппозиториямассой от 1,9 и2,1 В результате проведенных экспериментальных исследований кинетики высвобождения АОЭС из различных основ, нами выбрана липофильная основа – твердый жир (тип А). В качестве растворителя АОЭС использован 1,2 – пропиленгликоль с последующим введением его в основу. С целью получения тонкодисперсной и стабильной эмульсии нами использованы моноглицериды, обладающие большой водоудерживающей способностью и предотвращающие выделение влаги на поверхности лекарственной формы.
Твин-80 – поверхностно-активное вещество, усиливает интенсивность диффузии и всасывания действующих веществ в прямой кишке, за счет увеличения их растворимости и воздействия на слизистую, путем снижения поверхностного натяжения [44, 80].
В технологическом процессе при изготовлении суппозиториев нами проведена подготовка концентрата АОЭС в 1,2 –пропиленгликоле. Следующей стадией являлась подготовка суппозиторной основы: моноглицериды, твердый жир расплавляли в реакторе (обогрев реактора водой температура 40–450С) по мере их тугоплавкости и добавляли твин–80.После полного расплавления основы ее передавали на стадию подготовки. Расплавленную массу перемешивали якорной мешалкой в течение 20 мин., после чего доводили температуру основы до 38–40С. Затем включали мешалку «Ультра –Туррекс» и вносили концентрат АОЭС небольшими порциями. После окончания загрузки концентрата суппозиторную массу перемешивали в течение 30 мин.Полученную массу сдавали на анализ, а затем передавали на стадию формовки. Упаковывали в контурно-ячейковые упаковки по 5 свечей в каждой.
Полученные суппозитории оценивали по следующим показателям: внешний вид, средняя масса, отклонения от средней массы, температура плавления и затвердевания, время полной деформации, твердость, рН водной вытяжки, йодное и кислотное число, подлинность, количественное определение, высвобождение и микробиологическая чистота, по методикам, описанным в ГФ XI и XIIизд. и дополнительным методикам, представленным в главе 2(Материалы и методы исследования). Основные показатели качества суппозиториев, содержащих АОЭС представлены в таблице 22 [80].
Изучение стабильности суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС в процессе хранения
90-дневные аппликации крема 1,5% на основе АОЭС в дозе 45 мг/кг по действующему веществу не изменяли основные интегральные показатели крыс. Они сохраняли нормальную двигательную активность, опрятный внешний вид и аппетит. В течение всего хронического эксперимента введение препарата не влияло на динамику массы тела экспериментальных животных по сравнению с контролем (табл. 33).
При визуальном наблюдении за депилированной кожей экспериментальных животных, подвергавшихся ежедневным аппликациям крема 1,5% на основе АОЭС, не установлено признаков ее раздражения (шелушения, гиперемия, зуд).
В условиях хронического опыта не выявлено влияния препарата на гематологические показатели периферической крови, систему плазменного гемостаза, биохимические показатели и активность изученных ферментов сыворотки крови крыс.
Длительное нанесение крема на депилированную кожу крыс не нарушало динамику мочеотделения и суммарный диурез экспериментальных животных по сравнению с контролем, что свидетельствует об отсутствии влияния препарата на выделительную функцию почек крыс в условиях водной нагрузки. Исследование функционального состояния центральной нервной системы установило снижение двигательной активности, исследовательского и эмоционального поведения экспериментальных животных в тесте «открытое поле» по сравнению с контролем (табл.34).
Таблица 34.Показатели функционального состояния ЦНС крыс, получавших аппликации крема 1,5% на основе АОЭС в хроническом эксперименте - достоверность различий с контролем ( Р 0,05 ) Аппликации крема не вызывали кардиотоксического действия, о чем Группы животных М±т Исследуемые показатели, за 3 минуты Кол-возаглядыванийв «норку» Кол-вовставанийна задниелапы Числопересекаемыхквадратов Грумминг Дефекация свидетельствовали результаты записи электрокардиограмм во II стандартном отведении. Макроскопические исследования внутренних органов крыс, получавших крем в течение всего хронического эксперимента, не выявили изменений коэффициентов массы сердца, легких, печени, почек, надпочечников, тимуса, семенников, селезенки, по сравнению с контролем.
Патогистологическое исследование внутренних органов животных, получавших длительные аппликации арники крема не зарегистрировало морфологических нарушений, обусловленных токсическим действием препарата и не раздражали депилированную кожу крыс.
Таким образом, проведенные экспериментальные токсикологические исследования свидетельствуют, что крем 1,5% для наружного применения, созданный на основе арники облиственной экстракта сухого, хорошо переносятся экспериментальными животными, не вызывают нежелательных побочных эффектов и не обладают местнораздражающим действием.
При изучении сенсибилизирующих свойств крема 1,5% на основе АОЭС на морских свинках-альбиносах показало, что при визуальном наблюдении не отмечено различий в кожной реакции между опытными и контрольными животными. На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что крем 1,5% не индуцирует аллергические реакции, протекающие по типу контактного дерматита.
При изучении ранозаживляющего действия крема 1,5% на модели термического ожога у всех мышей контрольной и опытной групп в результате термического воздействия развился тяжелый ожог кожи IIIБ–IVА степени. В первые 2–3 дня после ожоговой травмы животные были вялые, адинамичные, отказывались от корма и теряли в массе тела до 12% от первоначальной. При визуальном обследовании можно отметить, что во всех группах у большинства животных отмечали неравномерность толщины струпа, при травмировании которого, наблюдали легкое сползание и выделение из трещин сукровичной жидкости, что характерно для экссудативной фазы раневого процесса, кроме того наблюдали присоединение вторичной инфекции. Конечной целью процесса ранозаживления явилось восстановление внешнего дефекта кожи. У мышей контрольной группы начало образования грануляционной ткани начиналось на 15– 17 сут., а к 20–24 сут. регенерация эпителия была выражена умеренно, полную эпителизацию ожоговой раны наблюдали к 32 сут. Лечение кремом на основе АОЭС в течение 12 сут. наблюдения не оказывало существенного влияния, как на характер течения раневого процесса, так и на сроки эпителизации – деструктивную и репаративную фазу раневого процесса. Картину заживления ожога в группе мышей, получавших крем 1,5% на основе АОЭС, наблюдали с 16-18 сут. К 20 сут. происходило статистически значимо выраженное уменьшение ожоговой раны, по сравнению с контролем (Р0,05), а к 22–23 сут. наступала практически полная эпителизация ожоговой раны (рис.23).
Следует отметить, что у животных, получавших с лечебной целью крем на основе АОЭС заживление ожога происходило без инфицирования раны с образованием нежного рубца. У контрольных мышей заживление ожоговой раны осложнялось инфицированием и существенным, по сравнению с лечеными животными, удлинением срока эпителизации раны. В течение всего периода наблюдения ни в одной из экспериментальных групп не зарегистрировано гибели животных.
Таким образом, опыты, проведенные на модели термического повреждения кожи у мышей (ожог III– IV степени), выявили наличие противовоспалительных и репаративных свойств крема 1,5% на основе АОЭС, проявляющиеся в ослаблении выраженности и ускорении процесса регенерации ожоговой раны, по сравнению с контрольной группой, получавшей в качестве лечения плацебо крема. Крем 1,5% на основе АОЭС стимулирует репаративные процессы поврежденной кожи.
