Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Биологически аналогичные лекарственные препараты в Российской Федерации и перспективы их разработки 16
1.2. Общие принципы подтверждения биологической аналогичности 19
1.3. Биологические свойства интерферонов 23
1.4. Подтверждение биологической аналогичности лекарственных препаратов интерферона альфа-2Ь 29
1.5. Комбинированные лекарственные препараты интерферона альфа-2Ь для лечения кандидоза влагалища 37
1.6. Актуальность разработки комбинированных лекарственных препаратов на основе интерферона альфа-2Ь 38
Глава 2. Материалы и методы исследований 41
2.1. Методы подтверждения качества 45
2.1.1. Определение подлинности 45
2.1.2. Определение содержания родственных белковых примесей 46
2.1.3. Определение бактериальных эндотоксинов 47
2.1.4. Определение аномальной токсичности 47
2.1.5. Определение цитотоксического действия 48
2.1.6. Определение специфической противовирусной активности 48
2.2. Определение специфической активности in vitro 50
2.2.1. Определение противогерпетической активности 50
2.2.2. Определение противоаденовирусной активности 52
2.2.3. Определение противогриппозной активности 53
2.2.4. Определение связывания с рецептором, антипролиферативных эффектов на клеточных линиях опухолей человека
2.3. Определение противогрибковой активности комбинации интерферона альфа-2Ь и кетоконазола in vitro 56
2.4. Определение противовирусной активности in vivo 58
2.4.1. Модель экспериментального герпетического кератита кроликов
2.4.2. Модель экспериментального генитального герпеса морских свинок60
2.5. Токсикологические исследования 61
2.5.1. Изучение общетоксического действия 61
2.5.2. Изучение местной переносимости и раздражающего действия""..71
2.5.3. Изучение аллергизирующего действия 71
2.5.4. Изучение влияния интерферона альфа-2Ь на иммунологический статус 76
2.5.5. Изучение репродуктивной токсичности 79
2.5.6. Исследования поведенческих реакций 81
2.6. Изучение фармакокинетических свойств 83
2.6.1. Изучение фармакокинетических свойств пэгинтерферона альфа-2Ь 83
2.6.2. Изучение фармакокинетических свойств интерферона альфа-2Ь... 8 5
2.6.3. Изучение фармакокинетики комбинации интерферона альфа-2Ь и кетоконазола
2.7. Определение противовирусной активности комбинаций интерферона альфа-2Ь с другими лекарственными средствами 87
2.8. Методы статистической обработки 88
Глава 3. Результаты доклинических исследований препаратов интерферона альфа-2Ь 89
3.1. Результаты изучения качества интерферона альфа-2Ь 89
3.2. Результаты изучения цитотоксичности интерферона альфа-2Ь на культуре клеток 96
3.3. Результаты изучения противогерпетической активности интерферона альфа-2Ь 97 3.4. Результаты изучения противоаденовирусной активности интерферона альфа-2Ь 100
3.5. Результаты изучения противогриппозной активности интерферона альфа-2Ь
3.5.1. Результаты изучения противогриппозной активности интерферона альфа-2Ь, визуальный учет цитопатического действия вируса 103
3.5.2. Результаты изучения противогриппозной активности ИФН альфа-2Ь, учет цитопатического действия вируса с использованием автоматического спектрофотометра
3.6. Результаты изучения противовирусной активности лекарственного препарата in vivo на модели экспериментального герпетического кератита кроликов 107
3.7. Результаты изучения противовирусной активности in vivo на модели экспериментального генитального герпеса морских свинок 111
378. Результаты изучения поведенческих реакций крыс под влиянием интерферона альфа-2Ь, суппозитории ректальные 113
3.8.1. Анализ свободного поведения крыс 114
3.8.2. Анализ обучаемости крыс 116
3.8.3. Поведение в условиях водной депривации 117
3.9. Результаты токсикологических исследований интерферона альфа-2Ь 118
3.9.1. Результаты токсикологического изучения интерферона альфа-2Ь, суппозитории ректальные 118
3.9.2. Результаты токсикологического изучения интерферона альфа-2Ь, гель и мазь для местного и наружного применения 126
3.9.3. Результаты токсикологического изучения интерфеорна альфа-2Ь, раствор для местного применения, при интрауретральном введении... 138
3.9.4. Результаты токсикологического изучения интерферона альфа-2Ь, раствор для местного применения, при интравагинальном введении... 142
3.9.5. Результаты токсикологического изучения интерферона альфа-2Ь, капли назальные для детей 158
3.9.6. Результаты токсикологического изучения интерферона альфа-2Ь, суппозитории вагинальные 176
3.9.7. Результаты токсикологического изучения интерферона альфа-2Ь, мазь для наружного применения 188
Глава 4. Результаты доклинического изучения интерферона альфа-2Ь в комбинации с другими лекарственными средствами 194
4.1. Результаты доклинического изучения противовирусной активности комбинации in vitro 194 4.2. Результаты доклинического изучения интерферона альфа-2Ь в комбинации с кетоконазолом 198
4.2.1. Результаты изучения специфической активности комбинации in vitro 198
4.2.2. Результаты изучения общетоксического и местнораздражающего действия комбинации, суппозитории ректальные и вагинальные, при ректальном введении 199
4.2.3. Результаты изучения общетоксического и местнораздражающего действия комбинации, суппозитории ректальные и вагинальные, при ректальном введении 207
4.3. Результаты фармакокинетические исследований 218
4.3.1. Результаты фармакокинетических исследований комбинации интерферона альфа-2Ь и кетоконазола 218
4.3.2. Результаты фармакокинетических исследований пэгинтерферона альфа-2Ь 223
Обсуждение 229
Выводы 239
Практические рекомендации 242
Публикации по теме диссертации 243
Список использованных сокращений 251
Список литературы
- Биологические свойства интерферонов
- Определение бактериальных эндотоксинов
- Результаты изучения цитотоксичности интерферона альфа-2Ь на культуре клеток
- Результаты изучения общетоксического и местнораздражающего действия комбинации, суппозитории ректальные и вагинальные, при ректальном введении
Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема профилактики и лечения вирусных инфекций является одной из основных для современного здравоохранения (Веревщи- ков В.К. и др., 2008). Одним из путей решения указанной проблемы является разработка новых противовирусных лекарственных препаратов (ЛП), в т.ч. ЛП, содержащих в качестве действующего начала интерферон альфа (ИФН альфа) (Ершов Ф.И. и др., 2006).
ИФН альфа относятся к цитокинам (медиаторам иммунитета) и представлены семейством белков, обладающих противовирусной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью, что позволяет отнести их к полифункциональным биорегуляторам широкого спектра действия и гомеостатическим агентам (Ершов Ф.И. и др., 2005, 2006, Sen GC, 2001). До начала 1980-х гг. производство осуществлялось путем получения нативного ИФН альфа. С открытием гена ИФН альфа, началась эра его биотехнологического синтеза (Nagata S. et al, 1980). Рекомбинантный ИФН альфа является белком, полученным с помощью генно-инженерных технологий. После разрешения медицинского применения первых оригинальных ИФН, в РФ с начала 2000-х гг. проводится активная разработка и государственная регистрация биологически аналогичных ИФН (Государственный реестр лекарственных средств, 2012 г.).
Биологически аналогичный ЛП (биоаналог) — ЛП биологического происхождения, сходный с ЛП сравнения (оригинальным ЛП), но не подпадающий под определение воспроизведенного ЛП, особенно в силу различий по исходному сырью или различий в технологическом процессе производства между биологическим ЛП и биологическим ЛП сравнения. В таких случаях необходимо представить соответствующие результаты доклинических и клинических исследований в отношении указанных различий.
На сегодняшний день вопросы обращения биологических ЛП подняты на государственный уровень (Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 г., Стратегия развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2020 г.). Однако в Федеральном законе № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» отсутствуют прямые нормы, регламентирующие обращение биологически аналогичных ЛП. В тоже время в ч. 1 ст. 14 декларируется необходимость соблюдения «объективности, всесторонности и полноты исследований, проводимых с использованием современных достижений науки и техники».
При разработке биоаналогичных препаратов концепция, используемая для воспроизведенных ЛП неприменима (CHMP/437/04), поскольку трехмерная структура, количество кислотно-основных вариантов или посттрансляционных модификаций (например, профиль гликозилирования) могут существенно различаться в зависимости от способа и условий производства белка с одной и той же аминокислотной последовательностью и впоследствии влиять на эффективность и безопасность. Для подтверждения биологической аналогичности ЛП, полученного биотехнологическим путем, необходимо доказать, что он по своему качеству, безопасности и эффективности не отличается от оригинального. Для этого проводятся исследования, объем которых значительно превышает требования, предъявляемые к воспроизведенным ЛП, действующим веществом которых являются небольшие, полученные путем химического синтеза молекулы (CHMP/437/04; EMEA/CHMP/BWP/49348/2005;
EMEA/CHMP/BMWP/42832/2005).
Для подтверждения биологической аналогичности новых ЛП ИФН альфа препарату сравнения необходимо придерживаться как ранее разработанных рекомендаций (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, 2012 г.), так и использовать новые. При этом целесообразно использовать как общие подходы, имеющие отношение ко всем ЛП, полученным биотехнологическим путем, так и частные, затрагивающие непосредственно ЛП ИФН альфа (EMEA/CHMP/BMWP/31329/2005).
Гармонизация с европейскими подходами к оценке медицинских технологий позволит решить частные вопросы проведения доклинических исследований биологически аналогичных ЛП ИФН альфа, что хорошо понимается государством (тематический план научно- исследовательских работ Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ «НЦЭСМП») на 2012— 2014 гг.
В связи с вышеизложенным, разработка национальной программы качественных доклинических исследований ЛП рекомбинантного
ИФН альфа-2Ь представляет собой актуальное направление научных исследований.
Цель и задачи исследования
Основной целью исследования являлась разработка национальной программы проведения комплексных, качественных доклинических исследований препаратов рекомбинантного ИФН альфа-2Ь на основе нормативных документов Российской Федерации и международных нормативных актов.
Для достижения поставленной цели решались следующие конкретные задачи:
-
Провести анализ данных литературы и методических документов, регламентирующих доклинические исследования биоаналогов и обосновать методологические подходы к доклиническим исследованиям биологически аналогичных ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь.
-
Определить параметры стандартизации и подтверждения биологической аналогичности, необходимые при планировании и проведении доклинического изучения качества, эффективности и безопасности новых субстанций и ЛП рекомбинантного ИФН альфа- 2Ь.
-
Предложить методики, обосновать их необходимость и достаточность, апробировать предложенные методические приемы в эксперименте при доклиническом изучении качества, эффективности и безопасности биоаналогов рекомбинантного ИФН альфа-2Ь.
-
Оценить качество рекомбинантного ИФН альфа-2Ь с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), электрофореза, реакции вирусной нейтрализации и специфической активности in vitro.
-
Оценить специфическую противовирусную активность различных лекарственных форм (ЛФ) ЛП ИФН альфа-2Ь in vivo для использования в качестве моделей доклинического изучения фарма- кодинамики.
-
Изучить общетоксические свойства различных ЛФ препаратов рекомбинантного ИФН альфа-2Ь с использованием лабораторных животных в условиях острых и хронических экспериментов, в т.ч. местнораздражающего действия при различных путях введения, для использования в качестве моделей доклинического изучения безопасности in vivo.
-
Исследовать специфические виды токсичности — влияние на репродуктивную функцию и эмбриотоксичность, а также иммуно- токсическое и аллергизирующее действие.
-
Провести доклинические фармакокинетические исследования препаратов рекомбинантного ИФН альфа-2Ь in vivo.
-
Оценить фармакодинамические свойства комбинаций рекомбинантного ИФН альфа-2Ь и химиотерапевтических препаратов in vitro в отношении различных возбудителей вирусных инфекций для создания новых комбинированных ЛИ.
-
Оценить фармакологические свойства новой фиксированной комбинации ИФН альфа-2Ь с кетоконазолом и нового биоаналога ИФН альфа-2Ь, ковалентно связанного с одной линейной молекулой монометоксиполиэтиленгликоля (ПЭГ ИФН альфа-2Ь). Провести доклиническое изучение фармакодинамики, безопасности и фармако- кинетики указанных препаратов.
-
По результатам доклинического изучения разработать программы клинических исследований I фазы комбинации ИФН альфа- 2Ь с кетоконазолом и ПЭГ ИФН альфа-2Ь.
Научная новизна работы
Впервые разработана комплексная программа проведения качественных доклинических исследований ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь на основе нормативных документов Российской Федерации и международных нормативных актов.
Впервые, как необходимый элемент комплексного доклинического изучения в соответствии с нормативными документами Российской Федерации и требованиями Европейских руководств по биотехнологическим препаратам, обоснованы и апробированы методики подтверждения параметров качества, эффективности и безопасности биоаналогов ИФН альфа-2Ь.
Впервые проведены комплексные доклинические исследования отечественных биоаналогов ИФН альфа-2Ь: изучена новая оригинальная комбинация ИФН альфа-2Ь и кетоконазола, предназначенная для лечения грибковых инфекций, и новый пэгилированный ИФН — препарат ПЭГ ИФН альфа-2Ь, предназначенный для лечения хронического вирусного гепатита С.
Практическая значимость
На основании разработанного комплекса доклинических исследований проведена оценка качества, безопасности, фармакокинетики и фармакодинамики новой комбинации — ИФН альфа-2Ь и кетокона- зол, а также нового биоаналога ИФН альфа-2Ь — ПЭГ ИФН альфа- 2b.
Разработаны протоколы клинических исследований I фазы, нормативно-техническая документация. Досье поданы в установленном порядке в Минздрав России для проведения процедуры государственной регистрации.
Результаты настоящего исследования использованы:
на Федеральном уровне:
-
в Методических указаниях по изучению специфической противовирусной активности фармакологических веществ, вошедших в «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Хабриева Р.У. (утверждены и изданы в 2005 г.);
-
в Методическом пособии по исследованию антиоксидантных свойств лекарственных препаратов под редакцией профессора Юрге- ля Н.В., д.б.н. Новикова К.Н. (утверждены Росздравнадзором и изданы в 2009 г.);
-
в Методических рекомендациях по подготовке текста инструкции по медицинскому применению лекарственных препаратов (утверждены Росздравнадзором и изданы в 2009 г.);
-
в Руководстве по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях (рекомендовано Учебно- методическим объединением в качестве учебного пособия, 2010 г.);
-
в Методических рекомендациях по составлению, изложению и оформлению инструкции по применению лекарственного препарата (утверждены Минздравсоцразвития РФ в 2012 г.);
-
в Методических рекомендациях по общим принципам проведения клинических исследований, МР № 10-02/02/10-2012, Москва 2012;
-
в Методических рекомендациях по составлению протокола контролируемого клинического исследования ЛП (выбор контрольной группы), МР № 11-02/02/10-2012, Москва 2012;
-
в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (утверждены Минздравсоцразвития РФ в 2012 г.);
-
практические рекомендации диссертационной работы используются при планировании и проведении доклинических исследований НЦ биомедицинских технологий РАМН и ГК «Биопроцесс».
на Муниципальном уровне:
-
в методических рекомендациях (№ 23) «Современные аспекты герпесвирусной инфекции. Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика» (утверждены Департаментом здравоохранения Правительства Москвы и изданы в 2012 г.).
на уровне Учреждения:
-
в практике экспертной работы центра экспертизы и контроля готовых лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России;
-
в лекционных курсах 2009-2012 гг. центра образовательных программ и повышения квалификации ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.
Связь задач исследований с проблемным планом
Диссертационная работа осуществлялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России по теме «Научное обоснование методических подходов к доклиническому и клинико-фармакологическому изучению и экспертной оценке эффективности и безопасности лекарственных средств» (№ Гос. регистрации 01201172531).
Апробация диссертации
Материалы диссертации доложены и обсуждены на Научно- практической конференции «Рациональное использование лекарственных средств: достижения и перспективы» (Москва, 2006), XIY Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), Международной конференции «50-я годовщина открытия интерферона» (Оксфорд, Англия, 2007), YI Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2007), Научно-практической конференции «Интерферону — 50» (Москва, 2007), Всероссийской конференции по вопросам государственного регулирования в сфере обращения лекарственных средств и медицинских изделий (Москва, 2007), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), XYI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), II Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, 2010), XV Международном конгрессе «Фитофарм 2011» (Нюрнберг, Германия, 2011), Конференции с международным участием «Актуальные вопросы доклинических и клинических исследований лекарственных средств» (Санкт- Петербург, 2011), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), учебном цикле ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (Москва 2005-2012).
Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании расширенной конференции отделов интерферонов и эпидемиологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и на заседании Ученого совета ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.
Личный вклад автора
Автором осуществлен выбор научного направления, сформулированы цель и задачи исследования, обоснован выбор адекватных путей их решения. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах научно-практического исследования. Автором предложена схема проведения исследований. Автором предложена новая фиксированная комбинация ИФН альфа- 2Ь с кетоконазолом. При личном участии автора проведены доклинические исследования ЛП в клеточных культурах и на экспериментальных животных, подтвердившие его безопасность и потенциальную эффективность. Автором предложена схема проведения дальнейшего клинического исследования, разработан дизайн и протокол клинического исследования I фазы. В публикациях, написанных в соавторстве, авторский вклад составляет не менее 80 %.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 53 печатных работы, из них 2 за рубежом, 20 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобр- науки России.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
-
Параметрами стандартизации качества субстанции реком- бинантного ИФН альфа-2Ь, влияющими на эффективность и безопасность готовых лекарственных форм (ЛФ), являются: специфическая активность, токсичность, подлинность, специфические и неспецифические примеси.
-
Исследованные ЛФ ИФН альфа-2Ь характеризуются высокой противовирусной активностью in vitro и in vivo. Они обладают благоприятным фармакологическим профилем эффективности и безопасности вне зависимости от способа введения, как в остром, так и в хроническом эксперименте.
-
Изученные ИФН альфа-2Ь-содержащие ЛП не обладают эмбриотоксическим действием, не влияют на физическое развитие, скорость развития сенсорно-двигательных рефлексов, эмоционально- двигательное поведение и тонкую координацию движений в постна- тальном периоде in vivo.
-
Изученные ЛФ ИФН альфа-2Ь не оказывают иммунотокси- ческого, аллергизирующего и нейротоксического действия.
-
Фиксированная комбинация ИФН альфа-2Ь и кетоконазола обладает оптимальным соотношением потенциальной пользы к возможному риску медицинского применения, низкой токсичностью, как при остром, так и при хроническом введении. При ректальном введении кетоконазол всасывается в кровь, а ИФН альфа-2Ь не изменяет фармакокинетику кетоконазола.
-
Разработанная программа доклинических исследований биологически аналогичных ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь является научно-обоснованной и достаточной для подтверждения их качества, безопасности и эффективности.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 270 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение), выводов, списка литературы, а также включает в себя 5 приложений. Работа иллюстрирована 131 таблицей и 22 рисунками. Библиографический указатель включает 150 источников, из них 70 на иностранных языках.
Биологические свойства интерферонов
Токсикологические исследования рекомендуется проводить в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice, GLP) [213], однако некоторые исследования, основанные на специализированных тест-системах, которые часто используют для изучения свойств биологических ЛП, могут не полностью соответствовать указанным правилам, при этом в некоторых случаях неполное соответствие правилам GLP не ведет к непригодности полученных результатов для обоснования возможности проведения клинических исследований и последующей государственной регистрации [147]. - Ввиду различных структурных и биологических свойств биологических ЛП, включающих видоспецифичность, иммуногенность и непредсказуемую плейотропную активность, традиционные подходы к исследованию токсичности ЛП могут не удовлетворять поставленным целям. В связи с тем, что наиболее часто встречающаяся нежелательная реакция интерферонотерапии — депрессия и другие психоэмоциональные расстройства, дополнительно, помимо стандартных токсикологических исследований, целесообразно проводить исследования поведенческих реакций.
С точки зрения безопасности влияние ИФН на ЦНС связывают с истощением серотонина [118]. Показано, что частота возникновений осложнений со стороны ЦНС при терапии ИФН не связана с возрастом или полом. Однако при анемии вероятность развития депрессии на фоне терапии ИФН существенно выше, чем при нормальном уровне гемоглобина крови. Прямой связи между используемыми ИФН и центральными эффектами не обнаружено, что дает основания полагать, что эффект истощения серотониновой системы под влиянием ИФН связан со стимуляцией метаболизма триптофана как в ЦНС, так и в периферических тканях.
Применение пегилированных ИФН также не привело к существенному изменению частоты встречаемости осложнений со стороны ЦНС на фоне интерферонотерапии [56].
Наряду с интерлейкинами, ИФН приписывается пирогенная функция, хотя и менее выраженная. Данный эффект может быть связан с прямым воздействием на центр терморегуляции и стимуляцией теплопродукции, в то время как влияния ИФН на теплоотдачу не обнаружено, несмотря на то, что они могут регулировать тонус некоторых сосудов [118,216]. По всей видимости, ИФН ответственны за развитие лихорадочной реакции, например, в начальной стадии гриппа, когда еще не началась выработка интерлейкинов, т.к. не было разрушения клеток организма [118]. В тоже время-повышение концентраций-ИФН при гриппе может, быть причиной развития таких реакций ЦНС, как вялость, апатия, снижение настроения, центральное подавление функции желудочно-кишечного тракта, тошнота и рвота центрального генеза и др. ИФН-индуцированная гипертермия не поддается коррекции нестероидными противовоспалительными ЛП, и только глюкокортикостероиды оказываются относительно эффективными для ее купирования. Обычно интерфероновая гипертермия характеризуется умеренным субфибрилитетом, однако у чувствительных лиц может происходить критическое повышение температуры, угрожающее их жизни [120].
В эксперименте на животных описано изменение поведения при периферическом введении ИФН. ИФН угнетают исследовательскую активность, вызывают развитие апатии, увеличивают число стереотипических движений, нарушают ориентировочную реакцию [4]. В тоже время различные типы поведения животных также могут быть ассоциированы с разным уровнем продукции ИФН. Крысы, генетически имеющие различную экспрессию ИФН, характеризуются разными типами оборонительных и ориентировочных рефлексов. Более того, у этих крыс различается болевая чувствительность [101,261]. Заражение экспериментальных животных вирусами гриппа, гепатита и др. приводило к изменению их поведения еще до появления клинических симптомов заболевания и выраженной вирусемии. Не исключено, что данный эффект связан с воздействием ИФН на ЦНС [216], но данный вопрос нуждается в дальнейшем изучении и уточнении.
Важно отметить, что на клетках ЦНС, как глиальных, так и нейронах, обнаружены рецепторы ИФН двух типов [216,101,259]. Особенно много рецепторов ИФН обнаруживается в области голубого ядра [118]. Функция данного образования ЦНС во многом остается нераскрытой, однако предполагается, что оно ответственно за процессы нейроиммуномодуляции [216,82]. Рецепторы ИФН на клетках ЦНС являются индуцибельными, их - концентрация возрастает-в=у=словиях вирусной инфекции [120]. Выявлена,--что в норме нейроны не продуцируют ИФН, однако в условиях вирусной инфекции такая продукция может наблюдаться, при этом она наиболее активно происходит в области аксонов и практически не встречается в дендритной области [120,261,215].
Считается, что ИФН играют важную роль в развитии и дифференцировании клеток ЦНС [118,82]. Они могут регулировать процессы апоптоза, прорастания нервных окончаний, а также формирования синапсов. Накопление и обратный захват ряда нейромедиаторов также регулируется ИФН [182]. In vitro ИФН стимулировали дифференцировку стволовых клеток головного мозга [190]. У эмбрионов мышей, которым блокировали синтез ИФН во время беременности, наблюдались негрубые пороки развития ЦНС, которые, однако, выражались в изменении их поведения [163]. Некоторые авторы сообщают о прямом нейротоксическом действии чрезмерно высоких и низких концентраций ИФН [198], в то же время нормальная концентрация этого цитокина может ассоциироваться с нейропротективными эффектами [173]. Показано, что при резкой отмене ИФН-замещающей терапии резко возрастает вероятность развития инсульта [111].
Определение бактериальных эндотоксинов
Токсикологические исследования (изучение общетоксического действия и специфических видов токсичности) ЛП проводили в соответствии с действующими методическими указаниями и рекомендациями по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ [74,18,47]. Использовали животных различных видов: мышей, крыс, кроликов, морских свинок как половозрелых, так и неполовозрелых. Путь введения ЛП соответствовал изучаемой ЛФ. Высшая изученная доза в экспериментах многократно превышала терапевтическую дозу или определялась технической возможностью введения соответствующей ЛФ.
Изучение общетоксического действия различных ЛФ ИФН альфа-2Ь включало исследование острой и субхронической токсичности. Исследования проводили в соответствии со следующими документами [74,18,47,36,63,64,75].
Суппозитории ректальные — острая и субхроническая токсичность Цель исследования — оценка параметров острой, субхронической токсичности и местнораздражающего действия ИФН альфа-2Ь в суппозиториях с активностью 1 млн. ME при однократном и многократном ректальном введении половозрелым и неполовозрелым крысам и мышам.
Исследование выполнено согласно Правилам лабораторной практики в РФ [63] и руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [74].
Препарат вводили животным ректально в виде подогретой до 35 С суппозиторной массы. Наблюдения за животными начинали непосредственно после введения ЛП и продолжали в течение 15 дней. Оценку общего = еостояния животных проводили 2 раза в день. Массу тела определяли в 1, 7 и -15 дни эксперимента. Местнораздражающее действие оценивали при патологоанатомическом исследовании через 1 ч после введения, а также после окончания периода наблюдения за животными.
Исследования субхронической токсичности проведены на кроликах-самцах. Препарат вводили 2 раза в день ректально по 1 суппозиторию с 12-часовым интервалом. Каждый суппозиторий содержал 4х106 ME ИФН альфа-2Ь, что в 120 раз превышало условную терапевтическую дозу. Препарат вводили в течение 30 дней. Контрольная группа животных получала плацебо (суппозиторную массу, не содержащую ИФН).
У животных до начала эксперимента определяли количество лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобина крови, оценивали ряд биохимических показателей, активность ферментов и иммунологических показателей.
В течение эксперимента отмечали общее состояние животных (поведение, двигательная активность, аппетит). Через 4 недели после введения ЛП исследовали морфологический состав периферической крови, свертываемость крови (методом Моравица), биохимические показатели и активность ферментов сыворотки крови, а также иммунологический статус животных. По окончании введения ЛП проводили макроскопическое и патогистологическое изучение органов подопытных животных. При микроскопическом исследовании были изучены печень, семенники, надпочечники, кишечник, в т.ч. прямая кишка, и лимфатические узлы. Органы животных фиксировали 10 % нейтральным формалином, заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилин-эозином.
Гель и мазь для наружного и местного применения — субхроническая токсичность Исследования на половозрелых животных Изучено общетоксическое действие ИФН альфа-2Ь (в ЛФ гель для =.- - наружного и местного применения) при аппликацшьна кожу крысам обоего пола. За 2 дня до эксперимента у животных на правом боку выбривали участки кожи 4x4 см. ИФН альфа-2Ь (гель) наносили в двух суточных дозах — 50 и 500 мг/кг массы тела. В качестве ЛП сравнения использовали ИФН альфа-2Ь (мазь). ЛП наносили 3 раза в день в течение одного месяца. На протяжении всего эксперимента оценивали общее состояние животных, потребление воды и пищи, динамику массы тела. По окончании эксперимента у животных были собраны образцы крови для гематологического и биохимического анализа, а также материал для патоморфологического исследования.
Исследования на неполовозрелых животных
Для определения возможности применения у детей ИФН альфа-2Ь в ЛФ гель для наружного и местного применения были проведены исследования на неполовозрелых крысах с исходной массой тела около 70 г. Учитывая результаты экспериментов на половозрелых животных, мы сочли возможным ограничиться изучением одной суточной дозы ЛП — 250 мг/кг массы тела. В эксперименте также использовали препарат сравнения (ИФН альфа-2Ь в ЛФ мазь) и контрольную группу. В каждой группе было по 10 особей.
По окончании курса нанесения ЛП у животных были собраны образцы крови для гематологического и биохимического анализа, а также материал для патоморфологического исследования.
Раствор для местного применения (вагинальное введение) — субхроническая токсичность Эксперименты проводили на самках белых беспородных крыс. Животные прошли карантин и адаптацию в условиях вивария в течение 14 дней. Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве определяющего показателя. При проведении экспериментов осуществляли ежедневное наблюдение за общим состоянием животных, потреблением корма и воды; -один раз в неделю определяли массу тела..
Исходя из максимальной продолжительности курса введения ИФН альфа-2Ь человеку (5 дней), продолжительность хронического эксперимента на крысах составила 14 дней. Вагинально ИФН альфа-2Ь вводили в двух дозах: 140 мкл/кг массы тела (эквитерапевтическая) и 1400 мкл/кг (10-кратная эквитерапевтическая). Техника вагинального введения крысам имела свои особенности: поскольку жидкий препарат не удерживался во влагалище, а выталкивался наружу за счет напряжения мышечной стенки, ИФН альфа-2Ь вносили при помощи ватных тампонов. Сначала во влагалище крысы при помощи глазного пинцета вводили рыхлый тампон небольшого размера, а затем уже на него наносили необходимый объем ЛП. Поскольку максимальная доза имела большой объем, ее вводили за 2 раза с интервалом 4 ч со сменой тампона.
Результаты изучения цитотоксичности интерферона альфа-2Ь на культуре клеток
В результате проведенного анализа подлинности субстанции ИФН альфа-2Ь и ИФН альфа-2Ь по двум методикам, указанным в табл. 10, были получены данные, подтверждающие подлинность субстанции ИФН альфа-2Ь и ЛП, полученных на ее основе. Методом электрофореза в ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях для двух образцов субстанции разных производителей (рис. 1) показано, что на электрофореграмме для обоих испытуемых образцов основная полоса располагается аналогично основной полосе международного стандартного образца Interferon alpha-2b CRS EDQM, каталожный номер 1032030, при этом отсутствуют полосы с более высоким молекулярным весом, чем основная полоса. В образцах присутствуют две полосы с более низким молекулярным весом, чем основная полоса, при этом интенсивность этих полос меньше, чем интенсивность основной полосы, полученной для раствора стандарта с разведением до концентрации 1 %. При анализе подлинности субстанции методом пептидного картирования профиль хроматограммы растворов исследуемых образцов субстанции (ВЭЖХ после ферментативного гидролиза трипсином) принципиально соответствовал профилю хроматограммы раствора стандарта Interferon alpha-2b CRS EDQM (рис. 2). Концентрация бактериальных эндоксинов (пирогенность), определенная при помощи LAL-теста в образцах субстанции составила не более 100 ЕЭ на 1 мг белка для субстанции производства ООО «Фармапарк» и не более 3500 ЕЭ на 1 мг белка для субстанции производства ЗАО «Вектор-медика». При оценке специфических и неспецифических примесей в образцах субстанции методом ВЭЖХ (рис. 3) в хроматограмме испытуемого образца №1 площадь основного пика составила 98,69 %, при этом площадь остальных пиков составила 1,31%- В хроматограмме образца №2 площадь основного пика составила около 98,46 %, при этом площадь дополнительных пиков составила 1т53 %. Площадь дополнительных пиков не была больше 2 %. =-: Таким образом, установленный комплекс методов для оценки качества субстанции ИФН альфа-2Ь является информативным, позволяет видеть разницу качества субстанций разных производителей и воспроизводим.
В соответствии с требованиями ЕМА [240] при оценке биологической аналогичности биоаналогов кроме методов оценки качества субстанции следует изучить следующие параметры исследуемых ЛП в сравнении с образцом сравнения: фармакодинамические свойства, включая исследования фармакологической активности фармацевтической субстанции и готового ЛП на модели различных вирусных инфекций на in vitro и in vivo; токсичность при многократном введении животным, местнораздражающее действие; фармакокинетические свойства веществ; фармакодинамические параметры ЛП in vivo. Поскольку нормативными документами России не предусмотрено сокращение испытаний для биоаналогов, то данный перечень был дополнен так же исследованием специфических видов токсичности (репротоксичность, эмбриотоксичность, аллергизирующее действие). Кроме того, в связи с тем, что наиболее часто встречающийся побочный эффект интерферонотерапии — депрессия и другие психоэмоциональные расстройства дополнительно были исследованы поведенческие реакции крыс под воздействием ЛП. Возможное проявление грйппоподобного синдрома оценивали по влиянию на температуру тела животных, появлению озноба.
Оценка фармакологической активности in vitro является одним из наиболее доступных методов предварительной оценки эффективности ЛП. Перед проведением оценки противовирусной активности проводили исследование цитотоксических свойств ЛП по стандартной методике.
Определение ТЦД5о ИФН альфа-2Ь проводили на культурах клеток MRC-5 и Vero по стандартной методике, клетки выращивали в 24-луночных пластиковых планшетах, для определения ТЦД5о использовали 2-х суточный клеточный монослой. За ТЦД5о принимали то разведение ЛП, при внесении которого на двухсуточный монослой клеточной культуры наблюдали выживаемость и неизменность морфологии у 50 % клеток. За максимальную переносимую концентрацию принимали то разведение ЛП, воздействие которого не вызывало видимых цитодеструктивных изменений клеточного монослоя по сравнению с контролем.
Для проведения исследования готовили разведения ЛП (от Г.4 до 1:64) на поддерживающей среде без сыворотки. Перед проведением опыта планшеты с клетками просматривали под микроскопом и оценивали качество монослоя в каждой лунке. Затем среду роста удаляли и вносили по 0,4 мл приготовленных разведений ЛП. В 1 горизонтальный ряд планшета вносили поддерживающую среду без сыворотки и использовали в качестве контроля. Через 48 ч и окончательно через 72 ч оценивали жизнеспособность и морфологию клеток под воздействием разных концентраций ЛП, полученные данные представлены в табл. 11.
Результаты изучения общетоксического и местнораздражающего действия комбинации, суппозитории ректальные и вагинальные, при ректальном введении
Исследования проведены на половозрелых мышах и крысах, а также на неполовозрелых крысах. Препарат вводили животным ректально в виде подогретой до 35 С суппозиторной массы. Наблюдения за животными начинали непосредственно после введения ЛП и продолжали в течение 15 дней.
При наблюдении за животными непосредственно после введения ИФН альфа-2Ь и в течение последующего периода не было установлено каких-либо изменений клинического состояния ни в одной группе. Гибели животных не было. При патологоанатомическом исследовании мышей и крыс было отмечено незначительное маслянистое загрязнение перианальной области, что связано с выделением незначительной части ЛП в результате перистальтических сокращений кишечника. Для исследования извлекали участок толстой кишки с ампулой прямой кишки. Ни у одного животного не отмечено признаков гиперемии, отека или повреждения слизистой оболочки кишки.
На протяжении всего эксперимента динамика массы тела животных была положительной, темпы прироста массы тела в группах, получавших ИФН альфа-2Ь во всех дозах, а также в контрольных группах, существенно не отличались (табл. 26-28).
После окончания периода наблюдения животные, получавшие ИФН альфа-2Ь в максимальной дозе, были эвтаназированы и подвергнуты макроскопическому патологоанатомическому исследованию. При внешнем осмотре половозрелых и неполовозрелых крыс и мышей отклонений не отмечалось: шерстный покров гладкий, блестящий, кожа эластичная, подвижная, подкожная клетчатка умеренно выражена, видимые слизистые оболочки бледные, чистые без изъязвлений и посторонних наложений, патологические выделения из естественных отверстий отсутствуют. При вскрытии грудной и брюшной полостей у всех животных отмечали анатомически правильное расположение внутренних органов. Внешний вид и структура органов соответствовали норме. В месте введения ЛП — прямой кишке — изменений не обнаружено.
Таким образом, препарат ИФН альфа-2Ь с активностью 1 000 000 ME в ЛФ суппозитории ректальные при однократном ректальном введении половозрелым мышам и крысам и неполовозрелым крысам в дозах до 2500 мг/кг (максимально возможная доза для ректального введения), не оказывает токсического действия на организм подопытных животных, а также не обладает местнораздражающим действием. Не выявлено отличий между половозрелыми и неполовозрелыми животными.
Изучение субхронической токсичности
Исследования проведены на кроликах-самцах. Препарат вводили 2 раза в день ректально по 1 суппозиторию с 12-часовым интервалом. Каждый суппозиторий содержал 4x106 ME ИФН альфа-2Ь, что в 120 раз выше условной терапевтической дозы. Препарат вводили в течение 30 дней. Контрольная группа животных получала плацебо (суппозиторную массу, не содержащую ИФН).
В результате проведенных исследований установлено, что при ректальном введении в течение 1 месяца в дозе 4х106 МЕ/кг препарат не влиял на общее состояние и поведение животных. Животные как опытной, так и контрольной групп имели гладкий шерстный покров, сохраняли обычную двигательную активность, охотно поедали корм. Гибели животных не было.
При анализе морфологического состава периферической крови было отмечено снижение количества эритроцитов и тромбоцитов. Препарат не влиял на количество лейкоцитов и содержание гемоглобина у животных, время свертывания крови (табл. 29).
Для оценки влияния ИФН альфа-2Ь на функцию печени изучали содержание в сыворотке крови кроликов общего белка, холестерина, проводили тимоловую пробу. Для оценки выделительной функции почек изучали содержание креатинина и мочевины в сыворотке крови (табл. 30).
Из табл. 30 следует, что через 4 недели эксперимента ИФН альфа-2Ь в дозе 4х106 МЕ/кг не вызывал изменений в содержании креатинина по сравнению с контролем: показатели оставались в пределах физиологической нормы для данного вида животных. Препарат также не влиял на содержание мочевины в сыворотке крови. Не отмечено изменений показателей тимоловой пробы.
При макроскопическом исследовании внутренних органов не было выявлено каких-либо патологических изменений, характеризующих токсическое воздействие ИФН альфа-2Ь в ЛФ суппозитории ректальные.
При микроскопическом исследовании были изучены печень, семенники, надпочечники, кишечник, прямая кишка и лимфатические узлы. Признаков патологии не выявлено.
Печень: паренхима умеренно полнокровна, центральные вены долек и вены портальных трактов не расширены, содержат эритроциты и небольшое количество лейкоцитов.
Почки: центральные вены долек и вены портальных трактов не расширены, содержат эритроциты и небольшое количество лейкоцитов.
Селезенка: белая и красная пульпа хорошо развиты, синусы полнокровны.
Легкие: бронхиальное дерево и альвеолы имели нормальное строение, межальвеолярные перегородки не утолщены,, вокруг крупных и средних .-бронхов отмечается скопление лимфоидных клеток.
Лимфатические узлы: капсула обычного строения, фолликулы коркового вещества состоят из малых и средних лимфоцитов, мозговое вещество более светлое и содержит лимфоидные клетки.
Место введения (прямая кишка): клетки эпителия полиморфны, с гиперхромными ядрами, в подслизистом слое встречаются отдельные лимфоидноклеточные фолликулы.
Таким образом, при изучении общетоксического действия ИФН альфа-2Ь, суппозитории ректальные, было показано, что препарат хорошо переносится животными и не обладает местнораздражающим действием.
Изучение иммунологического статуса
Иммунологический статус животных оценивали с помощью реакции бластгрансформации культивируемых in vitro лимфоцитов периферической крови на Т- и В-клеточные митогены (фитогемагглютинин (ФГА), конканавалин А, декстрана сульфат), по влиянию ЛП на систему комплемента. Полученные результаты представлены в табл. 31.
Похожие диссертации на Разработка национальной программы качественных доклинических исследований биологически аналогичных лекарственных препаратов рекомбинантного интерферона альфа-2b
-
