Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .12
1.1 Метаболизм и фармакокинетика производных адамантана 12
1.1.1. Фармакологические свойства производных амино-адамантана 12
1.1.2. Фармакологические свойства гимантана
1.2. Биофармацевтическая классификационная система лекарств 19
1.3. Биотрансформация производных аминоадамантана 22
1.4. Фармакокинетика производных аминоадамантана 24
1.5 Аналитические методы исследования производных амино-адамантана (высокоэффективная жидкостная хроматография - масс-спектрометрия) 31
1.4.1 Техники ионизации 32
1.4.2 Масс-анализаторы 33
Экспериментальная часть 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Объекты исследования 36
2.2. Реактивы 37
2.3. Экспериментальные животные 37
2.4. Методы
2.4.1. Способ отбора биообразцов 38
2.4.2. Обработка биологических проб, отделение гимантана от сопутствующих веществ из биологических образцов 39
2.4.3. Масс-спектрометрический анализ гимантана и его метаболитов в плазме крови крыс и кроликов 40
2.4.4. Построение калибровочных кривых 41
2.4.5. Метрологическая характеристика методики определения гимантана 42
2.4.6. Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных
2.4.7. Статистическая обработка полученных результатов 44
Глава 3. Биотрансформация гимантана 45
Глава 4. Фармакокинетика гимантана 52
4.1. Фармакокинетика гимантана у крыс 52
4.2. Фармакокинетика гимантана у кроликов
4.2.1. Абсолютная биодоступность гимантана у кроликов 62
4.2.2. Относительная биодостуиность таблеток гимантана, приготовленных по различным технологиям у кроликов 69
4.2.3. Определение относительной биодоступности таблеток гимантана по отношению к субстанции 75
4.3. Межвидовые различия в биотрансформации и фармакокинетике гимантана 76
Глава 5. Экскреция гимантана и его метаболитов с мочой и калом крыс 79
Заключение 84
Выводы 87
Список Литературы
- Биофармацевтическая классификационная система лекарств
- Обработка биологических проб, отделение гимантана от сопутствующих веществ из биологических образцов
- Абсолютная биодоступность гимантана у кроликов
- Определение относительной биодоступности таблеток гимантана по отношению к субстанции
Введение к работе
Актуальность проблемы
Болезнь Паркинсона - хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание. По распространенности болезнь Паркинсона стоит на втором месте после болезни Альцгеймера, встречается примерно в 1% популяции старше 55 лет. Несмотря на наличие целого ряда противопаркинсонических препаратов, способных снижать симптоматику заболевания, поиск новых более эффективных средств патогенетической терапии остается актуальным.
В НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН в ряду производных 2-аминоадамантана было выявлено активное соединение N-2-адамантил- гексаметиленимина (гимантан) [Морозов И..С. и др. 2000]. В экспериментальных исследованиях показана его высокая активность на моделях паркинсонизма, превосходящая таковую препарата сравнения амантадина [Неробкова Л.Н. и др., 2000; Вальдман Е.А. 2000, 2001; Вальдман Е.А., Воронина Т.А., 1999; Капица И.Г. и др. 2005]. Было показано, что гимантан имеет сходные с амантадином свойства неконкурентного низкоаффинного блокатора ионного канала NMDA рецепторов [Елшанская М.В. и др. 2001]. Наряду с этим, был установлен ряд других компонентов механизма действия и спектра фармакологической активности гимантана, что, возможно, обеспечивает ему более высокую специфическую активность, установленную в эксперименте [Вальдман Е.А., 2001; Вальдман Е. А. и др. 2004; Абаимов Д.А. и др.; Зимин И.А. и др., 2010, Ковалев Г. И., 2007].
Фармакокинетические исследования гимантана у экспериментальных животных методом радиоизотопной метки [3Н] показали, что препарат хорошо всасывается из ЖКТ и очень медленно выводится из организма (период полувыведения составляет 360-402 ч, а его среднее время удерживания колеблется от 526 до 580 часов в зависимости от способа введения) [Петренко Е. С., 2003]. Метод радиоизотопной метки [3Н] не обладает достаточной селективностью, так как тритий может распределяться и в отдельных компонентах биологической матрицы. Это приводит к завышенным концентрациям определяемого вещества и, как следствие, к установлению завышенных величин фармакокинетических
параметров.
В опытно-технологическом отделе ФГБУ «Научно-исследовательского института фармакологии имени В. В. Закусова» РАМН (руководитель профессор Б.М. Пятин) была разработана лекарственная форма гимантана - таблетки по 0,05 г [Цветкова Е. А., Волкова М. Ю. и др., 2002]. Показано, что по фармакодинамическим и фармакокинетическим свойствам она полностью соответствует субстанции препарата.
Пилотное клиническое исследование гимантана проведено у пациентов с ранними стадиями болезни Паркинсона. Определена оптимальная эффективная, переносимая и безопасная доза гимантана для лечения начальных форм болезни Паркинсона - 25 мг, однократно в утренние часы. Установлено, что повышение дозировки сопровождается развитием побочных эффектов центрального и периферического характера. Подтверждена целесообразность дальнейшего изучения гимантана на разных стадиях болезни Паркинсона, в том числе в составе комбинированной фармакотерапии [Катунина Е.А. и др. 2008].
Необходимой составляющей таких исследований является наличие данных о фармакокинетике препарата у пациентов. Ранее использованный метод радиоизотопной метки [3Н] нельзя применять у людей. В связи с вышеизложенным возникает необходимость в разработке новой безопасной, высокочувствительной и селективной методики количественного определения гимантана в биоматериале.
Данные о биотрансформации и фармакокинетике в эксперименте позволяют получить представления о путях метаболизма нового препарата, возможных лекарственных взаимодействиях и подойти к решению проблемы индивидуализации фармакотерапии.
Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР ФГБУ «Научно-исследовательского института фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН "Изучение механизмов эндо и экзогенной регуляции функций ЦНС, разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств" (№ госрегистрации 01.2006 06601).
Целью работы явилось экспериментальное изучение биотрансформации гимантана и его фармакокинетики.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать аналитический метод количественного определения гимантана и его метаболитов в биологическом материале на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.
-
Изучить фармакокинетику гимантана и его основных метаболитов в плазме крови и мозге крыс после однократного внутривенного и перорального введения.
-
Изучить фармакокинетику гимантана и его основных метаболитов в плазме крови кроликов после различных способов введения.
-
Определить абсолютную биологическую доступность гимантана.
-
Провести на кроликах сравнительное, перекрестное, открытое фармакокинетическое исследование гимантана после однократного введения таблеток гимантана 25 мг, приготовленных по разным технологиям. Определить относительную биологическую доступность гимантана.
-
Изучить экскрецию неизмененного препарата и его метаболитов с мочой и калом крыс.
Научная новизна работы
Впервые изучена биотрансформация и фармакокинетика нового противопаркинсонического препарата гимантана у крыс и кроликов на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, определены стандартные фармакокинетические параметры. Установлено, что при различных путях введения гимантан подвергается интенсивной биотрансформации, и уже в первые минуты в плазме крови и мозге крыс, а также плазме крови кроликов регистрируются значительные концентрации его метаболитов. По данным масс-спектральных характеристик были обнаружены 3 метаболита гимантана с m/z 250, m/z 266 и m/z 282, по- видимому, соответствующих гидроксилированным продуктам метаболизма, которые определяются в плазме крови кроликов в течение 24 часов, а у крыс - в течение 6 часов. В результате проведенного исследования установлено, что для гимантана характерна высокая степень проникновения в орган-мишень мозг и относительно высокая абсолютная биодоступность.
Практическая значимость работы
На основании данных исследований методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием обнаружены метаболиты гимантана. Перспектива создания лекарственных форм для орального применения гимантана подтверждена его относительно высокой степенью абсолютной биодоступности в эксперименте.
На основании определения относительной биологической доступности гимантана у кроликов после однократного введения таблеток, приготовленных по различным технологиям, дана оценка целесообразности использования тех или иных лекарственных форм.
Личный вклад автора
Автором самостоятельно разработана методика количественного определения гимантана в биоматериале, проведены исследования по изучению фармакокинетики и биотрансформации гимантана у крыс и кроликов; обработаны результаты, сформулированы выводы. При активном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены на конференции "Фармация и общественное здоровье" (Екатеринбург, 2009, 2010 г.), V Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2010 г.), XI Региональном Конгрессе Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, 2011), на конференции в лаборатории фармакокинетики ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН (Москва, 2011).
Положения, выносимые на защиту Разработана и метрологически охарактеризована методика количественного определения гимантана и его метаболитов в биоматериале.
-
Масс-спектрометрически идентифицированы три гидрокси-производных метаболита гимантана.
-
Изучена фармакокинетика гимантана у кроликов и крыс после различных способов введения. Установлены межвидовые различия в фармакокинетических параметрах гимантана и в интенсивности его биотрансформации.
-
Неизмененное вещество и один из его продуктов превращения проникают через гемато-энцефалический барьер.
-
Целесообразность создания пероральных лекарственных форм гимантана подтверждена его достаточно высокой абсолютной биодоступностью.
-
Изучена относительная биодоступность двух таблетированных прописей гимантана и рекомендовано дальнейшее изучение одной из них.
-
Гимантан полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта в портальный кровоток и выводится из организма крыс в незначительных количествах как в неизменененном виде, так и в виде метаболитов.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 работ (3 статьи - в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией, 4 тезисов - в материалах российских и международных научных конференций). Одна статья принята в печать.
Объем и структура диссертации
Биофармацевтическая классификационная система лекарств
В Учреждении Российской академии Медицинских Наук НИИ Фармакологии им. В. В. Закусова РАМН на протяжении десятков лет ведется синтез производных адамантана и разработка на их основе высокоэффективных препаратов, среди которых психостимуляторы бромантан и хлодантан, иммуностимулятор кемантан. В рамках этих исследований ранее проводился и поиск противопаркинсонических препаратов [Шмарьян М.И., Климова Н.В., Лаврова Л.Н. и др., 1980; Вихляев Ю.В., Ульянова О.В., Воронина Т.А., 1980]. Были созданы противопаркинсонические средства бемантан, димантан. В качестве противопаркинсонического препарата первоначально был разрешен для проведения клинических испытаний и кемантан. Эти препараты обладали антикаталептической активностью, превосходящей таковую у мидантана в эксперименте. Однако клинические испытания не подтвердили высокой активности, что ограничило их дальнейшее продвижение в практику [Пигарев В. А., Вартанян К.З., 1984].
Соединение гидрохлорид 1Ч-адамант-2-ил-гексаметиленимина (гимантан) было отобрано для углубленного изучения в качестве потенциального противопаркинсонического средства из 24 синтезированных в опытно-технологическом отделе НИИ фармакологии РАМН (рук. проф. Б. И. Пятин) производных аминоадамантана по результатам скрининговых тестов, как обладающее наиболее выраженной антикаталептической активностью [Морозов И.С., Е. А. Вальдман, Воронина Т.А. и др., 2000] и наиболее эффективно устраняющее олигокинезию, вызванную нейротоксином МФТП у мышей линии С57В1/6.
Экспериментальное изучение противопаркинсонической активности гимантана проведено в соответствии с методическими рекомендациями по изучению потенциальных препаратов такого действия [Воронина и др., 2005]. На моделях угнетения дофаминергической и гиперактивации холинергической системы, МФТП-индуцированого паркинсонического синдрома установлено, что гимантан в дозах 5-20 мг/кг обладает широким спектром противопаркинсонической активности, ослабляет основные двигательные нарушения - олигокинезию, ригидность, тремор. [Вальдман Е. А. и др. 1999, Вальдман Е. А., 2000; Неробкова Л. Н. и др. 2000]
Доказаны преимущества гимантана перед имеющимися противопаркин-соническими препаратами. В качестве основного препарата сравнения использовали амантадин (мидантан, 1-аминоадамантана гидрохлорид). На модели МФТП-индуцированного паркинсонизма в отличие от мидантана, эффективного в дозах 20-50 мг/кг, активность гимантана проявлялась в дозах 5-20 мг/кг. По устранению нейролептической каталепсии действие гимантана было сопоставимо с эффектами L-ДОФА и циклодола и превосходит таковое мидантана.
В противоположность мидантану гимантан эффективно устранял дрожательные проявления на моделях тремора, вызванного оксотреморином и ареколином, не уступая по выраженности эффекта циклодолу [Вальдман Е. А., 2001; Неробкова Л. Н. и др. 2000]. Прекращение длительного применения гимантана не вызывает развития синдрома отмены. Установлена умеренно выраженная анксиолитическая, антидепрессивная и аналитическая активность гимантана [Вальдман Е.А., 2001].
При изучении механизма действия установлено, что гимантан, как и амантадин, обладает свойствами блокатора ионного канала глутаматных рецепторов NMDA подтипа в концентрации 10"5М [Елшанская М. В. и др, 2001]. Механизмы дофаминергического действия гимантана были изучены в ряде исследований in vitro, in vivo и ex vivo. Методом микродиализа у крыс, показано, что однократное введение в дозе 20 мг/кг приводит к повышению уровня внеклеточного дофамина и снижению содержания метаболитов дофамина и серотонина в стриатуме крыс [Андяржанова Э. А., 2001].
В условиях ex vivo после субхронического введения препарата (7x20 мг/кг/день, в/б) бьшо обнаружено модулирующее воздействие гимантана на подсистемы дофаминовых рецепторов Db D2 и D3, проявляющееся в изменении плотности рецепторов (Втах) без изменения их аффинности (Kd) [Абаимов ДА., Ковалев Г.И., 2007].
Гимантан при однократном системном введении (20 мг/кг, в/б) вызывал уменьшение уровней ДОФА, серотонина и его метаболита 5-ГИУК в стриатуме мышей и оказал умеренное ингибирующее действие на синтез ДА в стриатуме, что, по-видимому, связано с эффектом на пресинаптические дофаминовые ауторецепторы D3 [Абаимов Д.А Ковалев Г.И., 2007].
В концентрации 10"5М гимантан обладает свойствами обратимого ингибитора МАО-В [Вальдман Е.А. и др, 2003] , в концентрации 10"4М -проявляет умеренную антирадикальную активность. [Вальдман Е.А., 2001] Гимантан в дозе 10 мг/кг обладает иммунотропной активностью [Нежинская Г.И. и др. 2003].
При изучении безопасности гимантана установлено, что гимантан обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием. [Дурнев А.Д., 2003] Наличие эмбриотоксического и тератогенного действия гимантана свидетельствует о том, что препарат противопоказан для применения во время беременности. Гимантан не оказывает существенного влияния на генеративную функцию самок и самцов крыс.
В опытно-технологическом отделе НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН (руководитель профессор Б.М. Пятин) была разработана лекарственная форма гимантана - таблетки 0,05 г. Цветкова Е.А., Волкова М. Ю. др. 2002 Показано, что по фармакодинамическим и фармакокинетическим свойствам она полностью соответствует субстанции препарата [Вальдман Е.А., 2001].
По результатам доклинического исследования было получено разрешение на проведение фазы 1-2 клинического изучения. Клиническое изучение проведено у пациентов с ранними стадиями болезни Паркинсона
Определена оптимальная эффективная, переносимая и безопасная доза гимантана для лечения начальных форм болезни Паркинсона - 25 мг, однократно в утренние часы. Установлено, что повышение дозировки сопровождается развитием побочных эффектов центрального и периферического характера.
Обработка биологических проб, отделение гимантана от сопутствующих веществ из биологических образцов
Трамадола гидрохлорид, «Словакофарма» (SN 3360404), используемый в качестве внутреннего стандарта (IS), его рабочий раствор был приготовлен разведением 0,1 г субстанции в воде до получения концентрации 2 мкг/мл. Вода для ВЭЖХ (Merck, Германия). Ацетонитрил сверхчистый для масс-спектрометрии (Merck, Германия). Все остальные реагенты были аналитической степени чистоты. Модельные образцы были приготовлены в интактной плазме крыс. К 0,9 мл плазмы прибавляли 0,1 мл каждого из разведений гимантана и смешивали. Извлечение гимантана из плазмы крови проводили путем осаждения белков плазмы ацетонитрилом. В экстракционную пробирку вносили 0,45 мл полученной плазмы крови, прибавляли 1,5 мл адетонитрила и 0,05 мл IS и центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин. Супернатант отделяли и аликвоту (15 мкл) вводили в петлю хроматографа. Идентификация проведена на основании данных масс-спектрометрического анализа.
Изучение фармакокинетики, выведения и распределения по тканям препарата проводили на самцах беспородных крыс, полученных из питомника «Столбовая» РАМН, в диапазоне масс от 180 до 220 г. Животных содержали в индивидуальных клетках, обеспечивающих сбор суточной мочи и кала отдельно друг от друга. Препарат вводили крысам однократно перорально в виде водного раствора субстанции в дозе 50 мг/кг и внутривенно в дозе 25 мг/кг.
Динамика концентраций гимантана изучалась на беспородных кроликах-самцах массой 2,2 - 3,2 кг перекрестным дизайном, животным были присвоены соответствующие порядковые номера. Животных содержали в стандартных условиях вивария НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН при 12-ти часовом световом режиме. За 12 часов до эксперимента животных лишали корма. Гимантан вводили в виде водных растворов однократно в дозе 50 мг внутривенно (инъекционная ЛФ) в краевую ушную вену и перорально в дозе 100 мг (в среднем 40 мг/кг). В виде таблеток гимантан вводили через зонд по четыре штуки (чтобы достичь дозы 100 мг). Через две недели введение лекарственных форм гимантана повторяли в обратном порядке.
Крысы: Пробы крови отбирали декапитацией в центрифужные полиэтиленовые пробирки, предварительно обработанные гепарином натрия, до введения препарата (контроль) и в дискретные моменты времени после введения: 0,05, 0,1, 0,16, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6 ч для внутривенного и 0,25, 05, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 ч для перорального способов. На каждый момент времени использовали по 8 животных.
Полученные образцы крови центрифугировали (4000 об/мин в течение 15 мин) с целью получения плазмы крови. У декапитированных крыс изымали мозг целиком, промывая его в изотоническом растворе и промакивая фильтровальной бумагой. Мочу и кал крыс собирали в течение 24 ч после однократного внутривенного и перорального введения препарата, во время сбора образцов экскретов животных содержали в метаболических клетках, в условиях отсутствия воды и корма. До начала непосредственно анализа образцы хранили при температуре -20С, кал сушили при температуре 50С и хранили в сухом месте.
Кролики: Образцы крови (1,0 мл) отбирали из краевой ушной вены с помощью игл и переносили в конические полиэтиленовые пробирки (предварительно обработанные гепарином). После внутривенного введения пробы крови отбирали в дискретные интервалы времени до введения препарата и через 0,05, 0,1, 0,16, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 24 ч. У животных, которым гимантан вводили перорально, пробы крови отбирали до введения раствора и через 0,25, 0, 5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 24 ч. Пробы крови обрабатывали так же, как и крысиные образцы, предварительно отстаивая в течение 15 минут в условиях комнатной температуры. Плазма крови хранилась при температуре -24 С [Guide for the care and use of laboratory animals, 1986].
Обработка биологических проб, отделение гимантана от сопутствующих веществ из биологических образцов
Осаждение белков плазмы крови и мозга ацетонитрилом: Исследуемые вещества извлекали из плазмы крови, осаждая белки ацетонитрилом. В центрифужную пробирку вносили 0,45 мл плазмы крови, добавляли 1,5 мл ацетонитрила и 0,05 мл водного раствора (2 мкг/мл) внутреннего стандарта (IS) так, чтобы конечная концентрация внутреннего стандарта составляла 50 нг/мл, и центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин. Супернатант отделяли и аликвоту (15 мкл) вводили в петлю хроматографа.
1,0 г мозга крыс измельчали и гомогенизировали в 0,5 мл физиологического раствора с добавлением 0,5 мл 96% этилового спирта (пеногаситель) в электрогомогенизаторе. Отбирали 1 мл гомогената, добавляли к нему 0,1 мл внутреннего стандарта и 2,9 мл ацетонитрила так, чтобы концентрация IS составляла 50 нг/мл. Смесь центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин. Супернатант отделяли и аликвоту (15 мкл) вводили в петлю хроматографа [Shudan F., Yuan Т. et al, 2009].
Экстракция гимантана диэтиловым эфиром: К 1,0 мл опытных образцов мочи добавляли 0,2 мл 2 М раствора КОН и экстрагировали 20-ти кратным объемом диэтилового эфира, в течение 15 мин на электрическом встряхивателе. Экстракцию проводили дважды. Эфирный экстракт отбирали и упаривали в токе азота. Сухой остаток растворяли в 1,0 мл ацетонитрила, в инжектор хроматографа вводили 15 мкл аликвоты [Freudenthaler S., Метеке I. et al, 1998].
Абсолютная биодоступность гимантана у кроликов
Важным этапом при проведении фармакокинетических исследований является изучение абсолютной биодоступности новых потенциальных лекарственных средств. Связано это, прежде всего, с тем, что изучение абсолютной биодоступности помогает выбрать оптимальный путь введения препарата, дающий преимущества в проявлении желаемой фармакологической активности при минимальной дозировке действующего вещества, что является крайне важным для его продвижения в медицинскую практику [Жердев В. П., Литвин А. А., 2005, Evans G., 2004]. Цель исследования - определить абсолютную биологическую доступность гимантана.
Результаты и их обсуждение Фармакокинетика гимантана после его перорального введения кроликам существенно отличается от кинетики внутривенного введения, прежде всего более низкими концентрациями неизмененного препарата (рис. 4.6, 4.7). В таблице 4.4 представлены фармакокинетические параметры гимантана в плазме крови кроликов после его однократного внутривенного и перорального введения.
Анализ полученных параметров кинетики гимантана позволяет заключить, что препарат быстро выводится из организма, на что указывает среднее значение константы скорости элиминации (kej), которое составило 0,255 ч"1 для перорального способа введения и 0,247 ч"1 — для внутривенного.
Содержание гимантана в плазме крови кроликов после перорального введения достигает максимума в среднем через 0,85 ч. Затем наблюдается двухфазное снижение концентрации неизмененного гимантана. Быстрое выведение препарата из организма характеризуется также такими величинами фармакокинетических параметров, как среднее время удерживания препарата в организме (MRT) - 5,04 ч и период полувыведения препарата из организма (ti/2ei) - 3,39 ч. Однако при сравнении этих величин для внутривенного и перорального путей введения видно, что дольше препарат выводится из организма животных после перорального введения (ti/2ei per os больше tj/2ei iv в 1,2 раза, а значение MRT для внутривенного способа введения меньше перорального в 2,17 раз). Известно, что в идеальном случае эти параметры, полученные на одном виде животных, не должны значительно отличаться друг от друга. В нашем исследовании такую разницу в величинах t1/2ei и MRT можно объяснить малой выборкой животных (п=5), недостаточной для более объективной статистической оценки.
Полученные результаты по изучению фармакокинетики гимантана позволяют заключить, что лекарственное вещество элиминирует из организма животных с высокой скоростью и его можно отнести к группе "короткоживущих" препаратов.
После внутривенного введения AUCo-oo гимантана в среднем составляет 1328,6 нг/млхч, а М-2 - 429,59 нг/млхч, что приблизительно в 3 раза меньше величины AUCo-oo неизмененного вещества. Однако после перорального способа величина AUCo-«, метаболита М-2 превышает этот параметр гимантана в десять раз. Стах гимантана после перорального введения в среднем составляет 68,04 нг/мл, а М-2 — 788,83 нг/мл. М-1, в отличие от внутривенного введения препарата, после перорального регистрируется в незначительных количествах, что указывает на основной путь метаболизма гимантана через образование метаболита М-2.
И гимантан, и метаболиты быстро выводятся из организма кроликов (табл. 4.4). Через 24 ч регистрировались лишь следовые концентрации исследуемых веществ.
По-видимому, после перорального введения гимантан полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта кроликов в портальный кровоток, затем подвергается «эффекту первого прохождения», в результате чего в системный кровоток поступает менее 8 % от введенной дозы препарата.
В таблице 4.5 представлены абсолютные величины степеней превращения гимантана в продукты биотрансформации после введения кроликам растворов субстанции исследуемого вещества (внутривенно и перорально) и таблетированных лекарственных форм.
После внутривенного введения гимантан интенсивнее превращается в М-1 (степень превращения 0,498), чем в М-2 (0,323). М-З в плазме крови кроликов не регистрировался даже в следовых количествах. Абсолютная величина степени превращения гимантана в М-2 после перорального введения раствора в 30 раз выше аналогичной величины, полученной после внутривенного введения. Подобная закономерность наблюдается и после введения таблеток: степень превращения исходного соединения в М-2 относительно внутривенного введения выше в 15 раз.
Степень превращения гимантана в метаболит m/z 266 после введения кроликам таблеток в два раза меньше аналогичной величины, полученной после перорального введения раствора. Известно, что биодоступность лекарственных препаратов, а также их биотрансформация в значительной степени зависят от таких биофармацевтических факторов, как вид вспомогательного вещества, его количество и технология получения готовой лекарственной формы [Frick A., Moller Н. et al, 1998, longejan G. A. M., Smit I.C.A. et al, 1989]. По-видимому, вспомогательные вещества в таблетках гимантана оказывают влияние на биотрансформацию исходного соединения. Возможно, образуется комплекс гимантан-вспомогательное вещество, предохраняющий от ферментативного воздействия исходное соединение на фазе всасывания из ЖКТ и эффекта первого прохождения.
Изучена фармакокинетика гимантана в плазме крови кроликов после внутривенного и перорального введения. Показано, что есть отличия в кинетике препарата при различных путях введения, в том числе и по сравнению с крысами. Рассчитана абсолютная биодоступность гимантана после перорального введения (7,95%), также величины степеней превращения исходного соединения в продукты биотрансформации.
Определение относительной биодоступности таблеток гимантана по отношению к субстанции
Поскольку после внутривенного введения количество гимантана в кале в 4,3 раза выше, чем после перорального введения, можно сделать вывод, что препарат полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта в системный кровоток.
Помимо неизмененного гимантана (m/z 234) в моче и кале крыс зарегистрированы продукты его биотрансформации, которые уже обнаруживались в плазме крови. Исследуемые соединения получили условные обозначения по такому же принципу, который применялся для обозначения метаболитов в плазме крови: М-1, М-2 и М-3. Возрастание массы метаболитов на 16, 32 и 48 соответственно, позволяет предположить, что образуются оксо-или гидрокси-производные [Петренко Е. С, 2003].
В качестве основного метаболита в моче и кале животных можно считать соединение с 250 m/z, вследствие его высоких концентраций во всех образцах экскрементов (рис. 5.2, 5.3). Из рис. 5.3 видно, что в кале после внутривеного введения количество М-1 в 1,9 раза меньше, чем после перорального введения. Подобная тенденция наблюдалось и для М-2 (3,9 раз). Полученные результаты свидетельствуют о выраженном эффекте первого прохождения гимантана через печень после перорального способа введения. Однако метаболит М-3 при пероральном приеме препарата обнаружен не был.
После добавления к пробам мочи (3-глюкуронидазы и проведения гидролиза количество М-1 и М-2 достоверно не увеличилось (при Р 0,95), в отличие от М-3. По-видимому, далеко не все метаболиты гимантана образуют глкжуроноконъюгаты.
Полученные результаты подтверждают литературные данные о том, что выведение производных адамантана происходит за счет образования гидроксилированных метаболитов [Петренко Е. С, 2003].
Анализ процессов экскреции гимантана и его метаболитов с мочой и калом крыс позволяет заключить, что элиминация препарата из организма животных происходит почти полностью за счет его биотрансформации в печени: суммарное выведение метаболитов в течение суток с мочой в среднем в 9-10 раз выше по сравнению с экскрецией с калом, а основное направление метаболизма, по-видимому, - гидроксилирование.
Литвин Е. А. Экскреция гимантана и его метаболитов с мочой и калом крыс / Е. А. Литвин, Д. В. Бастрыгин, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев, В. П. Жердев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. Принята в печать. Заключение
В организме крыс гимантан интенсивно трансформируется при любом способе введения, образуя три метаболита. При внутривенном введении уже на третьей минуте обнаруживается один метаболит, второй - на шестой минуте. При пероральном введении крысам все три метаболита обнаруживаются на шестой минуте, их концентрации нарастают в течение часа, причем их значения выше, чем при внутривенном введении, особенно у метаболита с m/z 266 по отношению к неизмененному веществу. Это может быть объяснено «эффектом первого прохождения». Метаболит с m/z 282 обнаруживается только после перорального введения крысам, а также в суточной моче и кале, наряду с неизмененным соединением и двумя остальными метаболитами.
Все продукты биотрансформации регистрируются в крысиной плазме крови в течение 6 часов после введения.
Для неизмененного гимантана характерна высокая степень проникновения в мозг. В мозге крыс отсутствуют метаболиты с m/z 282 и 266, метаболит с m/z 250 присутствует в меньшей степени, чем в плазме крови, что может быть объяснено его более высокой гидрофильностью.
Поскольку массы метаболитов отличаются на 16 углеродных единиц, можно предположить, что один из основных путей биотрансформации препарата заключается в окислении молекулы данного вещества. Изучена фармакокинетика гимантана в плазме крови кроликов после внутривенного и перорального введения. Рассчитана абсолютная биодоступность гимантана после перорального введения (14,1%) и величины степеней превращения исходного соединения в продукты биотрансформации.
После внутривенного введения гимантан интенсивнее превращается в М-1 (степень превращения 0,498), чем в метаболит с m/z 266 (0,323). Однако при введении таблеток степень превращения исходного соединения в М-2 выше в 15 раз относительно внутривенного и в два раза меньше по отношению к водному раствору субстанции. После внутривенного введения гимантана концентрации метаболитов в плазме крови кроликов в абсолютных значениях ниже, чем в плазме крови крыс. Также у них при любом способе введения не обнаруживается М-3, а при пероральном также отсутствует М-1.
Полученные нами данные не сходятся с результатами ранее проведенных исследований [Петренко Е. С, 2003] по ряду фармако-кинетических параметров: время полувыведения, процент от введенной дозы в суточной моче, биодоступность, степень проникновения в мозг, клиренс. Предшествующие данные были получены методом радиоизотопной метки [ Н], однако, необходимо отметить, что этот метод лишен селективности. Разработанный новый метод с применением масс-спектрометрии на основе ВЭЖХ вследствие более высокой чувствительности и селективности дает более объективную картину поведения препарата в организме экспериментальных животных.
По-видимому, вспомогательные вещества в таблетках гимантана оказывают влияние на биотрансформацию исходного соединения. Возможно, образуется комплекс гимантан-вспомогательное вещество, предохраняющий от ферментативного воздействия исходное соединение на фазе всасывания из ЖКТ и «эффекта первого прохождения».
После введения кроликам таблеток гимантана, приготовленных влажным гранулированием (Т-1), и таблеток гимантана, приготовленных прямым прессованием (Т-2), величины концентраций препарата в плазме крови животных достоверно не отличаются, фармакокинетические параметры близки друг к другу. Относительная биодоступность гимантана из таблеток Т-1 по отношению к таблеткам Т-2 составила 104,15±9,99%.
Поэтому целесообразно отдать предпочтение той таблетированной лекарственной форме, технология которой более экономична и проста.
Элиминация препарата из организма животных происходит почти полностью за счет его биотрансформации в печени: суммарное выведение метаболитов в течение суток с мочой в среднем в 9-10 раз выше по сравнению с экскрецией с калом. В опыте с применением Р-глюкуронидазы показано, что значимо увеличиваются концентрации только М-3, по-видимому, остальные метаболиты не образуют глюкурониды.
