Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Состояние и перспективы фармакологической профилактики и ранней терапии радиационных поражений 12
1.1. Современные подходы к фармакологической профилактике радиационных поражений (радиопротекторы) 13
1.2. Современные подходы к ранней фармакотерапии радиационных поражений 35
1.3. Существующие схемы комбинированного применения радиозащитных фармакологических средств 46
Глава 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Материалы исследования 51
2.2. Характеристика фармакологических препаратов, использованных в исследовании 52
2.2.1. Характеристика препарата Б-190, способы и схемы его введения 52
2.2.2. Характеристика интерлейкина-1р\ способы и схемы его введения 53
2.3. Методика моделирования острого внешнего радиационного воздействия 54
2.4. Методы исследований 55
2.4.1. Определение показателей выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных 55
2.4.2. Определение количества колониеобразующих единиц на селезенке методом эндогенного колониеобразования 56
2.4.3. Определение количества колониеобразующих единиц на селезенке методом экзогенного колониеобразования 57
2.4.4. Определение общего количества лейкоцитов 60
2.4.5. Определение лейкоцитарной формулы 61
2.4.6. Определение содержания гликогена в нейтрофилах периферической крови 62
2.4.7. Определение активности миелопероксидазы в нейтрофилах периферической крови 63
2.4.8. Определение активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови 64
2.5. Методы статистической обработки результатов исследования 66
Глава 3. Экспериментальная оценка радиозащитной эффективности комбинированного применения препарата Б-190 и интерлейкина-1 р 67
3.1. Оценка радиозащитной эффективности комбинированного применения препарата Б-190 и интерлейкина-1р по критериям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей 67
3.1.1. Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-1р на выживаемость и среднюю продолжительность жизни белых беспородных мышей, подвергнутых у-облучению в дозах СД5о-юо 67
3.1.2. Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-1р на выживаемость и среднюю продолжительность жизни мышей-гибридов (СВА х С57В1) F1, подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе СД80/зо 75
3.2. Оценка радиозащитной эффективности комбинированного применения препарата Б-190 и интерлейкина-1(3 по критериям сохранности клеток-предшественников костномозгового кроветворения облученных мышей 79
3.2.1. Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-ір на функцию кроветворения облученных мышей-гибридов (СВА х С57В1) F1, оцененную в методике эндогенного колониеобразования 79
3.2.2. Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-ір на функцию кроветворения облученных мышей-гибридов (СВА х С57В1) F1, оцененную в методике экзогенного колониеобразования 82
3.3. Оценка радиозащитной эффективности комбинированного применения препарата Б-190 и интерлейкина-lp по критериям клеточного состава периферической крови и функционально метаболического статуса нейтрофилов облученных мышей 88
3.3.1. Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-ір на абсолютное количество лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови облученных мышей-гибридов (СВА X C57B1)F1 89
3.3.2. Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-1р на динамику содержания гликогена, активность миелопероксидазы и щелочной фосфатазы нейтрофилов периферической крови облученных мышей-гибридов (СВА х С57В1) F1 101
Глава 4. Возможности комбинированной фармакологической профилактики и терапии радиационных поражении (обсуждение полученных результатов) 108
Выводы 123
Практические рекомендации 125
Список литературы 126
- Современные подходы к фармакологической профилактике радиационных поражений (радиопротекторы)
- Существующие схемы комбинированного применения радиозащитных фармакологических средств
- Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-ір на функцию кроветворения облученных мышей-гибридов (СВА х С57В1) F1, оцененную в методике экзогенного колониеобразования
- Возможности комбинированной фармакологической профилактики и терапии радиационных поражении (обсуждение полученных результатов)
Введение к работе
Актуальность. Важными задачами современной фармакологии являются поиск и разработка новых эффективных лекарственных средств для профилактики и лечения различных заболеваний, изучение механизмов их действия в экспериментах на животных и научное обоснование рациональных схем их применения. Для решения этих задач проводится поиск новых биологически активных фармакологических веществ среди природных и синтетических соединений, продуктов биотехнологии, генной инженерии, на экспериментальных моделях патологических состояний осуществляется оценка их эффективности и безопасности, изучается индивидуальная чувствительность к существующим и разрабатываемым лекарственным средствам [Серсденин СБ., Вальдман Е.А., 2003; Гуськова Т.А., 2010; Лесиовская Е.Е., 2010].
Одной из наиболее тяжелых патологий, требующей интенсивной фармакотерапии и профилактики, являются лучевые поражения, возникающие при остром внешнем радиационном воздействии [Бушманов А.Ю. и др., 2006; Гуськова А.К., 2008; Pellmar Т.С., Rockwell S., 2005]. Возникновение таких поражений возможно при авариях и катастрофах на объектах атомной энергетики, в медицинских учреждениях, использующих источники ионизирующих излучений в диагностических или терапевтических целях, при диверсионном или террористическом применении радионуклидов [Аветисов Г.М., Гончаров С.Ф., 2002; Гребенюк А.Н. и др., 2009; Cirincione J. et al., 2002; Egger E., Miinger K., 2004; Kuna P. et al., 2009]. Нельзя забывать и о необходимости предотвращения и лечения лучевых поражений у экипажей длительных пилотируемых космических экспедиций [Ушаков И.Б. и др., 2010; Seed Т. et al., 2002]. Исходя из этого, одной из приоритетных задач современной фармакологии и радиобиологии становится разработка новых и совершенствование известных радиозащитных лекарственных препаратов, а также экспериментальное обоснование новых схем их применения.
В настоящее время наиболее изученными и высокоэффективными медицинскими средствами противорадиационной защиты являются радиопротекторы [Бутомо Н.В. и др., 2004; Васин М.В., 2006; Bump Е., Malaker К., 1997; Seed Т:, 2005]. Но их применение ограничено сроками использования (исключительно до радиационного воздействия), часто - малой терапевтической широтой и, как следствие, достаточно высокой токсичностью в оптимальных радиозащитных дозах. В качестве наиболее перспективных фармакологических средств для ранней терапии лучевой патологии рассматриваются препараты цитокинов и-
2 ростовых факторов [Чигарева Н.Г. и др., 2000; Легеза В.И. и др., 2001, 2010; Иванов А.А. и др., 2004; Neta R., 1997].
Цистамин, гаммафос и препарат Б-190 считают наиболее эффективными препаратами из группы радиопротекторов [Ильин Л.А. и др., 1994; Giambarresi L.J., Walker R.J., 1989; Кипа P. et al., 2004]. В ходе ликвидации последствий аварии на Чернобыльской атомной электростанции для профилактики радиационных поражений использовался препарат Б-190 - радиопротектор из группы биогенных аминов, реализующий свой эффект за счет прямого действия на агадренорецепторы [Ильин Л.А. и др., 2001; Васин М.В., 2010]. К числу наиболее перспективных противолучевых средств из группы цитокинов относят ре-комбинантный интерлейкин-ір, в экспериментальных исследованиях показавший высокую эффективность как для профилактики, так и для ранней терапии лучевых поражений [Рождественский Л.М., 2001; Симбирцев А.С., 2008; Neta R., 1997; Grebenyuk A. et al., 2010].
Однако до настоящего времени остается нерешенным вопрос о сохранении радиопротекторной эффективности препарата Б-190 при последующем введении интерлейкина-ір, не изучены эффекты комбинированного применения этих лекарственных препаратов на состояние костномозгового кроветворения, количественный состав и функционально-метаболическое состояние лейкоцитов периферической крови. Вместе с тем, решение этих вопросов необходимо для создания новых высокоэффективных схем фармакологической профилактики и терапии радиационных поражений.
Целью исследования явилось экспериментальное обоснование схемы фармакологической профилактики и терапии острых радиационных поражений, включающей комбинированное применение препарата Б-190 до облучения и интерлейкина-ір в ранние сроки после радиационного воздействия.
Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи исследования:
-
Оценить радиозащитную эффективность последовательного профилактического применения препарата Б-190 и раннего лечебного использования ин-терлейкина-ір по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных в дозах СД50-100/30 мышей.
-
Изучить состояние костномозгового кроветворения у мышей, подвергнутых острому внешнему облучению без фармакологической защиты и в условиях последовательного применения препарата Б-190 до облучения и интерлей-кина-ір после радиационного воздействия.
-
Определить модифицирующее влияние последовательного применения препарата Б-190 и ингерлейкина-1 р на динамику общего числа лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови мышей после радиационного воздействия.
-
Установить динамику содержания гликогена, активности миелоперок-сидазы и щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови мышей, подвергнутых облучению без фармакологической защиты и на фоне профилактического введения препарата Б-190 и раннего лечебного применения интер-лейкина-ір.
Научная новизна. Впервые проведена экспериментальная оценка схемы фармакологической профилактики и терапии острых радиационных поражений, основанной на последовательном применении препарата Б-190 до облучения и интерлейкина-ір после острого внешнего радиационного воздействия.
Показано, что комбинированное применение препарата Б-190 и интерлей-кина-ір позволяет увеличить число выживших после острого внешнего радиационного воздействия мышей в большей степени, чем изолированное введение этих фармакологических средств. Выявлено, что использование данной лечебно-профилактическая схемы позволяет более эффективно снизить выраженность постлучевых нарушений костномозгового кроветворения, уменьшить глубину ранней постлучевой лейко-, лимфо- и нейтрофилопении, ускорить восстановление абсолютного содержания этих клеток в периферической крови, чем применение одного препарата Б-190 или ингерлейкина-1 р. Установлен стимулирующий эффект комбинированного применения препарата Б-190 и интер-лейкина-lp в отношении функционально-метаболического статуса нейтрофилов, измененного в результате облучения, который проявляется в поддержании более высокого уровня гликогена, уменьшении степени снижения активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы.
Практическая значимость. Экспериментально обоснован новый подход к повышению эффективности медицинской противорадиационной защиты посредством последовательного применения фармакологических средств радиопротектора препарата Б-190 за 15 мин до облучения и рекомбинантного интер-лейкина-ір (беталейкина) через 15 мин после радиационного воздействия. В условиях острого внешнего радиационного воздействия комбинация этих фармакологических препаратов позволяет снизить глубину постлучевых наруше-2
4 ний гемопоэза, уменьшить выраженность лейкопении, ускорить восстановление основных субпопуляций лейкоцитов, нормализовать функционально-метаболический статус нейтрофилов, что, в конечном счете, приводит к увеличению выживаемости облученных в дозах СД50-100/30 мышей.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Последовательное введение препарата Б-190 до радиационного воздей
ствия и интерлейкина-ір в ранние сроки после облучения позволяет увеличить
выживаемость лабораторных животных, подвергнутых внешнему острому от
носительно равномерному облучению, в большей степени, чем их изолирован
ное применение.
2. Механизм фармакодинамического взаимодействия лекарственных
средств препарата Б-190 и интерлейкина-1(3 при их комбинированном примене
нии для профилактики и терапии радиационных поражений реализуется сни
жением глубины постлучевых нарушений гемопоэза, уменьшением выражен
ности ранней постлучевой лейко-, лимфо- и нейтрофилопении, ускорением вос
становления абсолютного числа лейкоцитов в периферической крови, стимуля
цией функционально-метаболического статуса нейтрофилов.
Реализация результатов исследования. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в научно-исследовательской работе Научно-производственного центра «Фармзащита» ФМБА России, учебном процессе на кафедрах военной токсикологии и медицинской защиты Государственного института усовершенствования врачей МО РФ и Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на 3-й международной научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология» (Минск, 2009), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы взаимодействия медицинских служб Вооруженных Сил в условиях современных вызовов и угроз» (Светлогорск, 2009), международной научной конференции «Медико-биологические последствия Чернобыльской катастрофы» (Гомель, 2009), 5 съезде радиобиологического товарищества Украины (Ужгород, 2009), I Европейском конгрессе по военной медицине (Светлогорск, 2010), Third European International Radiation Protection Association Congress (Helsinki, 2010), VI съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2010).
Связь темы диссертации с- плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждений. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ НПЦ «Фарм-защита» ФМБА России (тема НИР №Р-167 шифр «Букашка», тема НИР №169 шифр «Комплекс», тема НИР №170 шифр «Синтетика») и Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова (тема НИР № VMA.03.02.01.0808/0292 шифр «Гемо-поэз», тема НИР № VMA.02.02.02.O81O/0192 шифр «Цитокин»).
Личное участие автора. Автор принимала личное участие в планировании, организации и выполнении экспериментальных исследований, проводила учет и оценку их результатов, статистическую обработку, обобщение и анализ полученных данных.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации представлены 7 таблиц и 10 рисунков. Список литературы содержит 200 библиографических источников, из них 135 отечественных и 65 иностранных публикаций.
Современные подходы к фармакологической профилактике радиационных поражений (радиопротекторы)
В условиях острого облучения с высокой мощностью дозы наибольшее практическое значение для целей противорадиационной защиты имеют радиопротекторы.
К числу радиопротекторов относятся препараты или рецептуры, которые при профилактическом применении способны оказывать защитное действие, проявляющееся в сохранении жизни облученного организма или ослаблении степени тяжести лучевого поражения с пролонгацией состояния дееспособности и сроков жизни [20]. В отличие от других радиозащитных средств, противолучевой эффект для радиопротекторов среди прочих фармакологических свойств является основным. Радиопротекторы эффективны в условиях профилактического применения, действие их развивается впервые минуты или часы после введения, сохраняется на протяжении относительно небольших сроков (в течение 1-6 ч) и проявляется, как правило, в условиях импульсного или однократного кратковременного радиационного воздействия. Действие радиопротекторов направлено, прежде всего, на защиту костного мозга и других гемопоэтических тканей, поэтому препараты этой группы целесообразно применять для профилактики поражений, вызываемых облучением в «костномозговом» диапазоне доз: от 1 до 10 Гр [15, 139].
Однако существующие радиопротекторы не всегда отвечают требованиям по эффективности и переносимости. В связи с этим, как у нас в стране, так и за рубежом, продолжается изыскание новых радиопротекторов из различных классов химических соединений, весьма интенсивному первичному отбору (или скринингу) подвергаются десятки тысяч соединений как природного, так и синтетического происхождения.
Значительное число исследований связано с изучением радиозащитной эффективности биологически активных соединений, полученных из эндогенных регуляторов гомеостаза организма: белков, нуклеиновых кислот, витаминов и пр.
В частности, проведена оценка радиопротекторной активности комплексных соединений Мп(И), Со(И), Zn(II) и Fe(III) с этиловыми эфирами N-никотиноил аминокислот по показателям выживаемости облученных животных [10]. Изучаемые соединения в дозе 20 мг/кг вводили за 1 ч до облучения животных в дозе СДюо/зо О Гр). Наиболее выраженные эффекты были получены на фоне действия комплексов Fe(III) с этиловым эфиром никотиноил-триптофана (по степени снижения частоты хромосомных аберраций), Со(Ш) с этиловым эфиром никотиноил-тирозина и Fe(III) с этиловым эфиром нико-тиноил-триптофана (по степени снижения пролиферативной активности), комплексов Мп(И), Со(П), Fe(III) с этиловым эфиром никотиноил-триптофана и Со(И) с этиловым эфиром никотиноил-тирозина (по числу полиплоидных форм клеток). Однако в некоторых случаях были отмечены противоположные эффекты: многократное увеличение числа хромосомных аберраций по сравнению с облученным контролем на фоне комплекса Мп(И) с этиловым эфиром никотиноил-триптофана, а также резкая стимуляция пролиферативной активности клеток костного мозга облученных животных на фоне предварительного введения в организм комплексов Мп(И) с этиловым эфиром никотиноил-гистидина, Со(П) с этиловым эфиром никотиноил-триптофана, и, особенно, Zn(II) с этиловым эфиром никотиноил-триптофана [10, 197].
Р.А. Щеголевой с соавторами (2005) в опытах на собаках, подвергшихся острому однократному тотальному у-облучению в дозе 3,2 Гр, изучена переносимость и противолучевая активность металлокомплексного соединения — препарата тизоль при различных вариантах его использования: защитном, лечебном и защитно-лечебном. При внутримышечном введении препарата интактным собакам в оптимальной дозе не было отмечено каких-либо проявлений общей реакции или местно-раздражающего действия. Показано, что препарат тизоль обладает противолучевым действием при внутримышечном его применении в защитном и защитно-лечебном вариантах, обеспечивая выживаемость 20% и 33% облученных собак соответственно при полной гибели животных в контрольной группе [135].
Отмечается, что внутрибрюшинное введение мышам апотрансферрина из сыворотки крови человека в дозах 100 и 198 мг/кг за 1 сут до острого воздействия у-излучения в дозе 6 Гр приводит к увеличению числа эндогенных колониеобразующих единиц в селезенке (КОЕ-С) на 8-е сут после облучения в 2,5 и 2,6 раза соответственно [70].
Экспериментально доказано, что тромбопоэтин (гормон, ранее известный как лиганд рецептора, кодируемого протоонкогеном) является наиболее важным регулятором продукции тромбоцитов и стимулятором восстановления разных линий кроветворения после облучения [167, 192]. Авторы исследовали влияние трех временных режимов введения тромбопоэтина на численность клеток крови, гемопоэтических предшественников костного мозга и 30-дневную выживаемость мышей C57BL6/J после общего облучения в дозах 7-10 Гр. Однократную дозу мышиного тромбопоэтина вводили за 2 ч до, через 2 ч или 24 ч после облучения. Тромбопоэтин стимулировал восстановление численности клеток крови и костного мозга по сравнению с placebo вплоть до 9 Гр независимо от схемы введения, однако лучший эффект оказывало введение тромбопоэтина за 2 ч до или через 2 ч после облучения. В то же время введение тромбопоэтина через 24 ч не оказывало влияния на выживаемость мышей, облученных в дозе 9 Гр. Авторы делают заключение, что применение тромбопоэтина до или вскоре после облучения повышает выживаемость мышей при сверхлетальном облучении (до 9 Гр) за счет стимуляции восстановления гемопоэза [167, 192].
Показано также, что введение тромбоцитарного фактора 4 повышает выживаемость облученных мышей, увеличивает содержание ДНК, численность мононуклеарных клеток костного мозга и способность формировать КОЕ-ГМ, снижает пролиферативный индекс гемопоэтических клеток и повышает отношение селезенка/тело и тимус/тело [198].
М.Н. Whitnall с соавторами (2005) исследовали радиозащитную эффективность 11 стероидов, которые вводили за 24 или 48 ч до общего у-облучения животных. Спустя 2 сут после облучения в дозе 3 Гр подсчитывали численность клеточных элементов крови, а после облучения в дозах 9— 12,5 Гр регистрировали выживаемость в течение 30 сут. В результате проведенных исследований из 11 стероидов специфическая радиозащитная эффективность выявлена только у 5-андростендиола. Другой стероид — 16-а-фторандро-5-стен-17а-ол оказывал заметное действие на выживаемость, но был менее эффективным, чем 5-андростендиол. Стероиды 5-андростентриол и 4-андростендиол слабо увеличивали выживаемость. Полученные данные являются первой демонстрацией наличия профилактического интервала длительностью 48 ч, когда одна подкожная инъекция 5-андростендиола повышает выживаемость мышей. Более того, показано, что одно подкожное введение 5-андростендиола через 1 ч после облучения менее эффективно, чем его применение за 24 8 ч до облучения. По мнению авторов, полученные эффекты являются результатом взаимодействия специфических рецепторов для конкретных стероидов, так как при подкожном введении очень похожие молекулы с такими же физико-химическими свойствами, как и 5-андростендиол, не обладали радиопротекторным эффектом [194, 195].
Также показано, что подкожная инъекция 5-андростен-Зр,17-р-диола (AED) стимулирует иммунную систему мышей и предотвращает смертность, вызванную подавлением гемопоэза после тотального облучения у-лучами [65, 193]. При подкожном введении 5-андростен-ЗР,17-р диола в дозах от 0 до 200 мг/кг самцам мышей СЗН/HeN за 24 ч до тотального у-облучения в дозе 9 Гр отмечено увеличение выживаемости облученных животных при дозах препарата вплоть до 5 мг/кг. Введение 5-андростен-Зр,17-Р-диола в дозе 1600 мг/кг перорально также повышало выживаемость [65, 193, 196].
Существующие схемы комбинированного применения радиозащитных фармакологических средств
В литературных источниках встречаются единичные данные о комбинированном применении различных радиозащитных препаратов.
В частности, исследование Л.А. Вернигоровой с соавторами (2005) посвящено изучению эффективности совместного профилактического приме-нения рибоксина и альгисорба при инкорпорации Ри. Эксперименты проводили на белых нелинейных крысах, которым раздельно и совместно вводили рибоксин (перорально и внутрибрюшинно) и альгисорб (перорально) перед пероральным введением 239Ри. В результате исследований получены данные, показавшие, что совместное введение рибоксина и альгисорба в желудочно-кишечный тракт до поступления туда 239Ри способствовало большему, чем при назначении одного альгисорба, снижению содержания плутония в органах депонирования. Внутрибрюшинное введение рибоксина уменьшало эффективность перорального применения альгисорба в связывании плутония. Авторы заключают, что эффективность совместного применения рибоксина и альгисорба в снижении накопления Ри в органах зависит от способа введения рибоксина и проявляется только при пероральном его поступлении [25].
В эксперименте на мышах изучали возможность совместного применения радиопротекторов (индралина и рибоксина) и препаратов антидотов (йо-дид калия и ферроцина) при внешнем у-облучении и инкорпорации I и Cs [61]. Показано, что при комбинированном воздействии внешнего и внутреннего радиационного фактора радиопротекторы и препараты-антидоты не влияют на эффективность друг друга. В отсутствии антидотов радиопротекторы изменяют кинетику обмена радионуклидов.
Хорошо известно, что эмоциональный стресс после облучения может осложнить течение радиационных поражений. В проведенных Б.Б. Морозом с соавторами (2007) исследованиях было показано, что эмоциональный стресс у животных после облучения в летальной дозе тормозит процессы пострадиационного восстановления гемопоэза, усиливает тяжесть острой лучевой болезни и снижает радиозащитную эффективность радиопротектора индралина. Мексидол, обладающий анксиолитической и антистрессорной активностью, полностью купировал нарушения адаптационных реакций в системе крови и нормализовал ее компенсаторные возможности у животных в условиях сочетанного воздействия эмоционального стресса и облучения. Этот лекарственный препарат снимал также ингибирующее действие эмоционального стресса на кроветворную систему животных, облученных в летальной дозе и защищенных индралином. По мнению авторов, фармакологическая коррекция мексидолом проявления эмоционального стресса в случае развития его после облучения в различных дозах может быть важным звеном в системе лечебных мероприятий [82].
Кроме того, было показано, что эффективно купировать эмоциональный стресс после воздействия на организм ионизирующей радиации может и афобазол, разработанный в Научно-исследовательском институте фармакологии РАМН [83].
В исследованиях Е.Е. Лесиовской (2010) показано, что актопротектор с антигипоксическим и антиастеническим действием метапрот является весьма перспективным препаратом для использования в программах профилактики и лечения широкого спектра патологических состояний и заболеваний, вызванных воздействием различных неблагоприятных факторов среды на организм человека [78]. Результаты экспериментальных исследований эффективности этого препарата в условиях моделирования острой гипоксической, тканевой гипоксии, истощающих физических нагрузок, перегревания и переохлаждения позволяют рассматривать метапрот в качестве возможного компонента комбинированной профилактики и терапии лучевых поражений, формирующихся в условиях аварийного острого внешнего облучения.
По мнению А.Е. Баранова и Л.М. Рождественского (2008), основу кон-сенсуальной схемы лечения лучевых поражений составляют комбинированная поддерживающая (асептика, антибиотики широкого спектра, переливание тромбо-, эритромассы) и миелостимулирующая терапия комбинациями цитокинов. Остается дискуссионным вопрос о применении трансплантации несингенных стволовых кроветворных клеток для лечения тяжелых лучевых поражений в связи с высокой вероятностью иммунологического конфликта между трансплантантом и организмом пострадавшего пациента [11].
Д.В. Ремизовым (2005) доказано, что ронколейкин существенно увеличивает радиозащитный эффект нафтизина и цистамина при комбинированных радиационных поражениях. Автор считает, что совместное использование цитокинов с радиопротекторами повышает эффективность терапии комбинированных радиационно-механических поражений [95].
Возможность сочетанного применения индралина и ферроцина для профилактики радиационных поражений при комбинированном воздействии на организм животных внешнего У-облучения и инкорпорации Cs показана Е.С. Жоровой с соавторами (2010). Получены данные, свидетельствующие о том, что при совместном применении индралина и ферроцина препарат индралин не влияет на эффективность ферроцина в ограничении накопления Cs в основных органах депонирования радионуклида [48]. Радиопротектор индралин при изолированном введении влияет на распределение и кинетику обмена Cs, способствуя большему по сравнению с контролем накоплению радионуклида в печени и почках. Скорость и величина накопления цезия в печени и почках зависят от интервала времени между приемом индралина и поступлением в организм животных Cs. Авторы делают вывод о том, что при комбинированном воздействия двух радиационных факторов (внешнее У облучение и инкорпорация Cs) введение индралина без ферроцина не желательно [200].
В.В. Зацепин (2009) показал, что как изолированное, так и совместное применение цистамина и интерлейкина-1 [3 способствует снижению выраженности постлучевых нарушений гемопоэза и увеличению пролифератив-ной активности стволовых кроветворных клеток. Экспериментально доказано, что в условиях внешнего радиационного воздействия последовательное применение цистамина в дозе 225 мг/кг и раннее терапевтическое введение интерлейкина-ір в дозе 50 мкг/кг позволяет существенно увеличить выживаемость облученных животных, способствует снижению глубины постлучевых нарушений гемопоэза и увеличению пролиферативной активности стволовых кроветворных клеток, более эффективно предотвращает развитие ранней постлучевой лейко-, лимфо- и нейтрофилопению и значительнее ускоряет темп восстановления количества клеток белой крови, чем изолированное применение этих препаратов. Стимулирующий эффект совместного применения препаратов в отношении показателей функционально-метаболического статуса нейтрофилов, измененных в результате облучения, проявляется в предотвращении снижения содержания миелопероксидазы и щелочной фос-фатазы, поддержании более высокого уровня гликогена в клетках [51]. В то же время, данных об эффективности схемы фармакологической профилактики и терапии радиационных поражений, основанной на применении препарата Б-190 до облучения и рекомбинантного ИЛ-ір в ранние сроки после радиационного воздействия, в доступной литературе нет.
Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-ір на функцию кроветворения облученных мышей-гибридов (СВА х С57В1) F1, оцененную в методике экзогенного колониеобразования
Эксперименты выполнены на 141 самце мышей-гибридов (СВА х С57В1) первого поколения. Для проведения исследований мыши были разделены на две группы — доноры (24 животных) и реципиенты (105 животных). Кроме того, в отдельную группу были выделены 12 мышей, содержавшихся в тех же условиях, но не подвергавшихся радиационному и/или фармакологическому воздействию (биологический контроль).
Схема эксперимента представлена в таблице 4.
Животные-реципиенты подвергались общему относительно равномерному рентгеновскому облучению в дозе 8,5 Гр.
На следующий день 12 мышам из группы доноров внутрибрюшинно вводили препарат Б-190 в дозе 50 мг/кг. В дальнейшем 6 из этих мышей в дальнейшем подвергались облучению в дозе 4 Гр и формировали две опытные группы, оставшиеся шесть не облучались и рассматривались в качестве контроля. Облученных животных делили на 4 группы. Через 15 мин после облучения 3 мышам, не получавшим препарат Б-190, внутрибрюшинно вводили интерлейкин-ір в дозе 50 мкг/кг, разведенный в 0,2 мл физиологического раствора, еще 3 мышам — физиологический раствор. Также делили животных из числа облученных на фоне профилактического введения Б-190: 3 мышам через 15 мин после облучения внутрибрюшинно вводили интерлейкин-1(3, еще 3 животным — только физиологический раствор.
Оставшихся 12 мышей из группы доноров костного мозга (в том числе 6 мышей, которым вводили Б-190), также делили на 4 группы. После этого, не подвергая облучению, 3 мышам, получавшим Б-190, внутрибрюшинно вводили интерлейкин-ір, а другим 3 мышам, получавшим Б-190 — 0,2 мл физиологического раствора. Оставшимся животным, не получавшим Б-190 и не подвергавшимся облучению, внутрибрюшинно вводили интерлейкин-1(3 в дозе 50 мкг/кг (3 мышам) или 0,2 мл физиологического раствора (3 мышам).
Через 1 ч после введения препаратов животных подвергали эвтаназии. У каждой из мышей-доноров извлекали по одной бедренной кости и готовили суспензию костного мозга для определения количества КОЕ на селезенке в методике экзогенного колониеобразования, предложенной J.E. Till и Е.А. McCulloch (1961). Для этого мышей-реципиентов делили на 9 групп по 15 животных в каждой:
- мышам 1-й группы в хвостовую вену вводили 0,5 мл суспензии костного мозга от облученных доноров, получивших физиологический раствор; - мышам 2-й группы вводили 0,5 мл суспензии костного мозга от облученных доноров, получивших препарат Б-190;
- мышам 3-й группы вводили 0,5 мл суспензии костного мозга от облученных доноров, получивших интерлейкин-1(3;
- мышам 4-й группы вводили 0,5 мл суспензии костного мозга от облученных доноров, получивших Б-190 и интерлейкин-1(3;
- мышам 5-й группы вводили 0,5 мл суспензии костного мозга от необ-лученных доноров, получивших физиологический раствор;
- мышам 6-й группы вводили 0,5 мл суспензии костного мозга от необ-лученных доноров, получивших препарат Б-190;
- мышам 7-й группы вводили 0,5 мл суспензии костного мозга от необ-лученных доноров, получивших интерлейкин-іР;
- мышам 8-й группы вводили 0,5 мл суспензии костного мозга от необ-лученных доноров, получивших Б-190 и интерлейкин-1Р;
- мышам 9-й группы (эндогенный фон) вводили 0,5 мл среды Хэнкса.
На 9 сут мышей-реципиентов подвергали эвтаназии, извлекали у них селезенки, размещали их на бумажных полосках в чашках Петри и заливали жидкостью Буэна на 1 сут. На следующий день подсчитывали число колоний, выросших на свободной поверхности селезенок, и рассчитывали среднее число колоний, образовавшихся на селезенках после облучения в каждой группе. Из результатов, полученных при подсчете числа колоний после введения различных образцов суспензии костного мозга, вычитали среднее значение «эндогенного фона». Для расчета числа КОЕ-С9 в 1 бедре донора их содержание умножали на 2 (получали содержание КОЕ в 1 мл) и на кратность разведения исходной суспензии: на 100 — для необлученного костного мозга, и на 40 - для облученного в дозе 4 Гр костного мозга. Число КОЕ-С9 в расчете на 106 миелокариоцитов определяли путем деления их содержания в одном бедре на количество МКЦ в бедре, выраженное в миллионах. Результаты эксперимента представлены в таблице 5.
Как видно из данных, приведенных в таблице 5, радиационное воздействие вызывало почти 5-кратное уменьшение количества КОЕ-С9 у самцов мышей-гибридов (СВА х С57В1) F1.
Изолированное применение препарата Б-190 или интерлейкина-ір не оказывало существенного влияния на количество 9-суточных колониеобра-зующих единиц (КОЕ-С9) в селезенках мышей-самцов гибридов (СВА х С57В1) F1, выявленных в методике экзогенного колониеобразования. В то же время, у облученных мышей-гибридов, которым за 15 мин до облучения вводили препарат Б-190, а через 15 мин после радиационного воздействия - ин-терлейкин-13, число КОЕ-С9 было в 2 раза выше, чем у животных контрольной группы (облучение). По данному критерию комбинированная фармакологическая профилактика и ранняя терапия радиационных поражений была более эффективна, чем изолированное введение отдельных препаратов: количество КОЕ-С9 у защищенных по этой схеме мышей было в 1,4 раза выше, чем у животных, получавших только препарат Б-190, и в 1,7 раз выше, чем у животных, леченных только интерлейкином-ір.
Таким образом, результаты исследования, изложенные в настоящем разделе, доказывают, что последовательное введение препарата Б-190 за 15 мин до облучения и интерлейкина-1 р через 15 мин после облучения способствовало увеличению пролиферативной активности гемопоэтических клеток и уменьшению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения. При этом комбинированное использование радиопротектора и средства ранней терапии лучевых поражений оказывало более выраженное защитное действие в отношении гемопоэза облученных мышей, чем изолированное применение отдельных препаратов.
Возможности комбинированной фармакологической профилактики и терапии радиационных поражении (обсуждение полученных результатов)
Полученные нами данные о радиопротекторной эффективности препарата Б-190 и ранней терапевтической активности интерлейкина-1(3 совпадают с результатами исследований ряда авторов [21, 23, 75, 99, 173] и дополняют их, расширяя представления о механизмах действия этих препаратов.
Общеизвестно, что наиболее тяжелые последствия воздействия ионизирующего излучения возникают в связи с повреждением системы кроветворения и развитием постлучевого костномозгового синдрома [47, 39, 146]. В частности, острое радиационное воздействие в дозах, вызывающих костномозговой синдром, сопровождается быстрым клеточным опустошением кроветворных органов. Наиболее радиопоражаемыми как раз и являются поли-потентные стволовые клетки, а также лимфоциты и самые ранние коммити-рованные предшественники гемопоэза [64, 66]. Во многом исход лучевого поражения зависит от способности сохранившихся стволовых клеток к пролиферации, причем источником пострадиационного восстановления являются не только неповрежденные, но и обратимо пораженные клетки [99].
Постепенное снижение числа функционирующих клеток в периферической крови происходит на фоне гибели гемопоэтических клеток-предшественников. В частности, транзитное время пребывания гранулоцитов в пуле созревающих и резервных клеток костного мозга составляет, приблизительно, 3-5 сут, и, следовательно, в условиях пострадиационного торможения пролиферации и дефицита их численности, частичное опустошение костного мозга развивается уже к исходу 1-й недели. Степень депопуляции зависит от тяжести лучевого поражения и, в частности, в фазе начального опустошения определяет выраженность лейко- и гранулоцитопении. Следовательно, одной из актуальных проблем современной радиобиологии является поиск средств и методов, действие которых направлено на защиту и восстановление жизнеспособности клеток системы гемопоэза в условиях облучения [23,31,35].
В настоящее время существуют некоторые различия в подходах к профилактике и лечению лучевых поражений в интервале доз 1 до 10 Гр, преимущественно используемые отечественными и зарубежными исследователями в эксперименте [11]. В отечественной радиобиологии акцент сделан на однократном применении для повышения радиорезистентности классических радиопротекторов и. высокомолекулярных соединений разной химической структуры и природного происхождения, названных впоследствии индукторами цитокинов [23,55]. Зарубежные исследователи, начав с аналогичных соединений, постепенно перешли исключительно на использование цитокинов [173]. В отечественной радиобиологии уже давно развивается направление по экстренной (в пределах 2 ч) и ранней (в пределах 6-24 ч) патогенетической терапии острых лучевых поражений. Практической реализацией этого направления исследований стали, соответственно, препараты беталейкин и де-зоксйнат, разрешенные к применению при радиационных авариях [11]. Кроме того, для профилактики радиационных поражений традиционно используют радиопротекторы, одним из которых является препарат Б-190 [23]. Однако данных об эффективности комбинированного применения радиопротектора Б-190 со средствами ранней терапии радиационных поражений беталей-кином или дезоксинатом в литературе нет.
В связи с этим нами была проведена оценка радиопротекторной эффективности совместного и изолированного применения препарата Б-190 и ин-терлейкина-1 (3 по критериям выживаемости, состояния постлучевого гемопоэза, динамики количества клеток периферической крови и функционально-метаболического статуса нейтрофилов облученных животных.
В частности на первом этапе нашего исследования было установлено, что при применении за 15 мин до радиационного воздействия препарат Б-190 эффективно защищает от лучевой гибели облученных в дозах СД5о-юо/зо мышей, увеличивая их выживаемость на 10-30%. Ранее высокая степень противолучевой защиты при применении препарата Б-190 была выявлена в экспериментальных исследованиях на многих видах лабораторных животных: мыши, крысы, сирийские хомячки, морские свинки, кролики, собаки и обезьяны [21, 23, 24].
Важно подчеркнуть, что широта радиозащитного действия индралина, действующего вещества препарата Б-190, в отличие от цистамина и мекса-мина, существенно не меняется при переходе от мелких лабораторных животных к собакам и обезьянам. Основной причиной данного факта является, по мнению М.В. Васина (2006), влияние более низкой интенсивности потребления кислорода в радиочувствительных тканях у крупных животных и человека на механизм действия данного ряда противолучевых соединений. Для препарата Б-190 роль циркуляторной гипоксии в реализации противолучевого эффекта достаточно ограничена, а определяющим моментом является фармакологическая интенсификация потребления клетками кислорода с развитием острой клеточной гипокситензии. В данной ситуации циркуляторная гипоксия способствует усилению клеточной гипокситензии за счет повышения сосудистого тонуса и роста периферического сопротивления при применении препарата Б-190 и, таким образом, повышению радиорезистентности клеток и всего организма в целом [22, 23, 58].
Важным аспектом механизма радиозащитного действия препарата Б-190 является его способность к снижению содержания кислорода в клетке, что ослабляет выраженность «кислородного эффекта» и проявлений оксида-тивного стресса. Реализуется этот механизм через прямое аг адреномиметическое действие препарата Б-190, следствием которого является сосудосуживающий эффект. В частности, у наркотизированных животных (кошки, кролики, крысы) при внутривенном введении в дозах 0,05-0,1 мг/кг препарат вызывает выраженное и кратковременное повышение артериального давления [23]. а-Адреноблокаторы (тропафен и фентоламин) полностью нейтрализуют подобный эффект препарата Б-190. Прессорное действие препарата сохранялось при предварительном применении резерпина, т.е. препарат обладает прямым адренергическим эффектом [23]. При увеличении дозы препарата Б-190 возрастает продолжительность его фармакологического действия. При дозах препарата 0,5-5,0 мг/кг длительность радиозащитного эффекта достигает 30-60 мин. В то же время, применение ингибитора моноами-ноксидазы ипразида, затрудняющего метаболизм препарата Б-190, увеличивает время действия препарата в 2-3 раза [23].
Показано, что арадреноблокаторы тропафен и празосин блокируют противолучевое действие Б-190, а (3-адренолитик индерал не влияет на радиозащитный эффект препарата [19, 23]. Предотвращение влияния опосредованного адреномиметического действия, достигаемого предварительной ре-зерпйнизацией животных, а также введением кокаина, не изменяло радиозащитную эффективность индралина. В то же время, адреноблокатор центрального действия аминазин препятствовал противолучевому эффекту радиопротектора, а применение ацетилхолина не влияло на радиозащитные свойства препарата [23].
Между проявлением фармакологического вазоконстрикторного эффекта, снижением напряжения кислорода в костном мозге и противолучевыми свойствами Б-190 существует тесная корреляционная связь. Однако фарма-кодинамика препарата Б-190 по противолучевым свойствам отличается более быстрым изменением, чем сдвиги в артериальном давлении животных. Так, максимальный подъем артериального давления у собак под влиянием Б-190 отмечался через 15-20 мин после введения препарата, а наиболее выраженные противолучевые свойства регистрировались через 5-10 мин [23].
