Введение к работе
Актуальность темы.
Поиск новых высокоэффективных анальгетиков является актуальной проблемой современной фармакологии, поскольку применяемые в клинической практике обезболивающие препараты не удовлетворяют требованиям эффективности и безопасности (М.Л. Кукушкин, В.К. Решетняк, 1999; С.С. Павленко, 1999; Г.Н. Крыжановский, 1999; В.В. Чурюканов, М.В. Чурюканов, 2002; М.Л. Кукушкин, Н.К. Хитров, 2004; Trescot et al., 2008). Так, наркотические анальгетики характеризуются сильным обезболивающим действием, что обеспечивает возможность их использования при травмах и заболеваниях, сопровождающихся выраженным болевым синдромом (злокачественные новообразования, инфаркт миокарда и другие). Однако, наряду с анальгетическим эффектом, они оказывают влияние на центральную нервную систему человека, проявляющееся в развитии эйфории, а при их повторном применении возникает привыкание, наблюдаются синдромы психической и физической зависимости. Кроме того, увеличение дозы препарата сопровождается риском угнетения дыхательного центра (Э.Э. Звартау и др, 2007; Wintle, 2008).
Ненаркотические анальгетики не оказывают влияния на дыхательный центр, не вызывают эйфории и явлений физической и психической зависимости. Однако их анальгетическая активность проявляется, главным образом, при невралгических, мышечных, суставных болях, головной и зубной боли, а при сильной боли, связанной с травмами, полостными оперативными вмешательствами, злокачественными новообразованиями и т.п., они практически не эффективны; некоторые ненаркотические анальгетики характеризуются хорошими жаропонижающим и противовоспалительным эффектами. Нежелательным побочным действием этих препаратов является негативное влияние на желудочно-кишечный тракт, систему кроветворения, выводящую систему (Е.Л. Насонов, 1999; А.Ю. Беспалов, Э.Э. Звартау, 2000; В.С. Шухов, 2001; Ю.Б. Белоусов, А.Н. Грацианская, 2008; Krenzischek et al., 2008).
В настоящее время общепризнанна ведущая роль эндогенных пептидов в регулировании различных систем организма (И.П. Ашмарин и др., 1988). В нашей стране успешно развивается направление создания лекарственных средств на основе регуляторных пептидов. Внедрены в клиническую практику ноотроп и нейропротектор семакс (ИМГ РАН (Н.Ф. Мясоедов, И.П. Ашмарин, А.А. Каменский, В.Н. Незавибатько и др. 1982)), ноотроп ноопепт (НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (С.Б. Середенин, Т.А. Воронина, Т.А. Гудашева, Р.У. Островская и др. 1995), противоязвенный препарат даларгин (ИЭК РКНПК МЗ РФ (М.И. Титов, Ж.Д. Беспалова и др. 1983)), иммуномодулятор тимоген (ИБХ имени М.М. Шемякина РАН и Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова (В.И. Дейгин, В.Х. Хавинсон, и др. 1989)).
Существует несколько стратегий поиска веществ пептидной структуры с заданной фармакологической активностью. В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН успешно применяется подход конструирования новых пептидных лекарственных средств как трехмерных топологических аналогов известных непептидных лекарственных соединений (Т.А. Гудашева, 1985–2008). Часто используют множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белковых структур, которое позволяет определить общность происхождения, функцию отдельных аминокислотных остатков, консервативность определенных участков и совпадение пространственных структур (multiple alignments) (Minkiewicz et al., 2008). Другой подход связан с поиском закономерностей в последовательностях аминокислот, способствующих эффективно и специфично взаимодействовать с рецепторами (Bakalkin et al., 1992).
В нашем исследовании был выбран подход, связанный с поиском минимальной аминокислотной последовательности, отвечающей за проявление анальгетического эффекта, среди эндогенных опиоидных пептидов (ОП), и разработка на ее основе новых соединений.
Атипичные ОП образуются из разных предшественников, и не содержат консервативной последовательности Tyr[Phe]-Gly-Gly-Phe-Met[Leu], ответственной за связывание с опиоидными рецепторами (ОР) (Corbett et al., 2006). Особый интерес представляют эндоморфины (Tyr-Pro-Trp[Phe]-Phe-NH2), дерморфины (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2), и пептиды группы Tyr-МИФ-1 (Tyr-Pro-Leu[Trp]-Gly-NH2), которые преимущественно связываются с -ОР (Broccardo et al., 1981; Zadina et al., 1996; Tseng et al., 2000). Попыток выявить общую последовательность среди атипичных ОП ранее не проводилось. Эндоморфины синтезируются в мозге млекопитающих, в том числе человека, и проявляют активность при центральном введении (Sakurada et al., 2008). Высокая анальгетическая активность этих пептидов сопровождается побочными эффектами, характерными для морфина (Czapla et al., 2000; Soignier et al., 2004; Chen et al., 2003). Дерморфины проявляют анальгетическое действие при центральном и периферическом введении (Broccardo et al., 1981; Negri et al., 2000), при этом не влияют на частоту дыхания даже в кататонических дозах (Paakkari et al., 1990), вызывают более медленное развитие толерантности по анальгетическому действию и менее выраженный синдром отмены по сравнению с морфином (Broccardo et al., 1985; Negri et al., 1995; Riba et al., 2002). Tyr-МИФ-1 оказывает антиопиоидное действие, уменьшая анальгетическую активность и препятствуя развитию толерантности при использовании морфина (Erchegyi et al., 1993; Pan, Kastin, 2007), при этом в более высоких дозах обладает собственным анальгетическим действием (Zamfirova et al., 2003). Таким образом, поиск новых потенциальных анальгетиков на основе общей структуры атипичных ОП представляется достаточно перспективным, поскольку пептиды должны обладать менее выраженными побочными эффектами, характерными для классических опиоидов.
Целью настоящего исследования явился поиск новых средств фармакологической регуляции болевой чувствительности на основе функционально-значимой минимальной аминокислотной последовательности атипичных опиоидных пептидов.
В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:
1. Выявить наиболее часто встречающийся минимальный аминокислотный фрагмент в первичных последовательностях 60 атипичных ОП и исследовать его (Tyr-Pro) анальгетический эффект, психотропную активность, механизм действия и побочное действие при системном введении.
2. Исследовать влияние модификации остатка пролина в молекуле Tyr-Pro-содержащего атипичного ОП дерморфина на проявления анальгетической, психотропной активности и побочных эффектов.
3. Исследовать структурно-функциональные взаимоотношения в ряду удлиненных и модифицированных по остатку пролина аналогов Tyr-Pro на проявление анальгетической и опиоидной активности, и отобрать наиболее перспективные для дальнейшего углубленного изучения соединения.
4. Определить спектр анальгетической активности, эффективность и продолжительность действия при разных путях введения и исследовать нейропсихотропную активность отобранных соединений.
5. Изучить механизм действия отобранных соединений.
6. Изучить побочные эффекты отобранных соединений, в том числе влияние на дыхание, оценить синдром отмены, развитие толерантности и терапевтическую широту.
7. Изучить распределение по органам и тканям отобранных соединений.
8. Провести сравнительные исследования отобранных соединений с эталонными препаратами.
Научная новизна. Выявлена последовательность Tyr-Pro, встречающаяся у большинства (63%) атипичных ОП и продемонстрировано, что именно она является минимально необходимой для проявления анальгетической активности. Впервые показано, что дипептид Tyr-Pro в дозах 0.1 – 10.0 мг/кг при системном введении проявляет анальгетическую активность в тестах соматической и висцеральной боли при активации ноцицепторов химическим, термическим и механическим стимулами, и обладает противовоспалительным действием. Анальгетическое действие дипептида реализуется через налоксон-чувствительные механизмы; Tyr-Pro имеет низкое сродство к периферическим d-ОР, и не взаимодействует с периферическими -ОР. Tyr-Pro в дозах 1 – 800 мг/кг не влияет на частоту дыхания и не вызывает гибели мышей в течение последующих 24 часов. Установлено, что фармакологическая активность атипичных ОП не зависит от положения последовательности Tyr-Pro в молекуле и модификация C- и N-конца последовательности –Tyr-Pro– природными аминокислотами сохраняет анальгетическую активность полученных пептидов, что открывает возможности конструирования новых пептидов, стойких к протеолизу и обладающих анальгетическим действием.
Показано, что стереохимическая модификация или дегидрирование остатка пролина в молекуле атипичного ОП дерморфина (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2) не изменяет анальгетическую активность при химическом и механическом раздражении и уменьшает противовоспалительное действие. Наряду с этим, дегидрирование остатка пролина в молекуле дерморфина приводит к ослаблению противовоспалительного и анальгетического действия при механическом раздражении ноцицепторов, но вызывает появление анксиолитической и потерю противосудорожной активности.
При изучении 22 оригинальных пептидов выявлена новая группа соединений, обладающих анальгетическим действием, общей формулы А-Tyr-Pro(D-Pro, Pro, D-Pro, Hyp)-В-X, где А, В – природные аминокислоты, а Х – метильная или амидная группировка. Установлено, что анальгетическая активность этих пептидов не зависит от взаимодействия с периферическими m- и d-ОР подвздошной кишки морской свинки (ПКМС) и семявыносящего протока мыши (СПМ), что предполагает низкий риск развития лекарственной зависимости. Среди пептидов этой группы отобраны Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2, которые обладают наиболее высокой анальгетической активностью. Установлено, что в смеси стереоизомеров Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH2 (1:1), получаемой в результате амидирования Tyr-Pro-L-Ser-OMe, анальгетической активностью обладает только D-стереоизомер (Tyr-Pro-D-Ser-NH2).
Впервые показано, что Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 в дозах 0.1 – 10.0 мг/кг при системном введении проявляют анальгетическое действие в тестах по оценке болевой чувствительности, основанных на активации ноцицепторов термическими, химическими или механическим стимулами. Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH2 активен на модели нейропатической боли; Tyr-D-Pro-Ser-NH2 оказывает прямое действие на первичные афференты ноцицептивного флексорного рефлекса. Анальгетическое действие Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH2 уменьшается при холодной (4С) и жаркой (31-32С) температуре окружающей среды.
Показано участие опиоидергической системы в анальгетическом действии Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2: анальгетическая активность ослабляется неселективным антагонистом центральных ОР налоксоном и периферических ОР – налоксоном метиодидом. Установлено, что Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 взаимодействуют с «высокоаффинными» центрами связывания (1.5 – 3 нМ) дерморфина и не взаимодействуют с «низкоафинными» (> 5 нМ). Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2, в отличие от дерморфина и морфина, проявляют слабое сродство (IC50 3.3*10-5 моль и 4.5*10-5 моль, соответственно) к периферическим m-ОР ПКМС и не обладают сродством (IC50 6.5*10-4 моль и 5.3*10-4 моль, соответственно) к периферическим d-ОР СПМ.
Установлено, что Tyr-[3H]Pro-[D,L]-Ser-NH2 и Tyr-[3H]D-Pro-Ser-NH2 наиболее интенсивно распределяются в сильно васкуляризированных органах выделения (печень, почки) и меньше – в слабоваскуляризированных (мозг, легкие, сердце). Оба соединения выводятся из организма (t1/2el из крови = 53.6 и 57.8 мин, MRT из крови = 43.2 и 46.1 мин, соответственно), а их протеолиз осуществляется ферментами крови, сердца, легких и мозга. В качестве основного меченного метаболита обнаруживаются пролин и D-пролин, соответственно.
Научно-практическое значение. Выявлена новая группа оригинальных веществ регуляции болевой чувствительности общей формулы А-Tyr-Pro(D-Pro, Pro, D-Pro, Hyp)-В-X, где А, В – природные аминокислоты, а Х – метильная или амидная группа, с отличным от классических ОП механизмом действия (зарегистрирован патент РФ №2286169 (приоритет от 18.04.2005), подана заявка на международный патент WO 2008/020778 A1 (от 21.02.2008)). Преимущества наиболее активных соединений этой группы перед морфином заключаются в отсутствии угнетающего влияния на дыхательный центр, более медленном развитии толерантности по анальгетическому действию и достоверно меньшей выраженностью синдрома отмены, в связи с чем, новые соединения имеют большую, чем морфин, безопасность и терапевтическую широту. При сравнении с диклофенаком пептиды активны в меньших дозах и обладают более широким спектром анальгетических эффектов. Отобранные пептиды Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 сочетающие анальгетическую активность и безопасность применения, можно рассматривать в качестве базисных соединений для создания потенциального анальгетика пептидной природы.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной конференции “Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности” (Минск, 1999), Международной научной конференции «Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника» (Минск, 2001), Всероссийском симпозиуме «Механизмы терморегуляции и биоэнергетики: взаимодействие функциональных систем» (Иваново, 2002), III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), 10th German-Russian Peptide Symposium (Turingia, 2003), 8th ECNP Regional Meeting (Moscow, 2005), I съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), IV международной научной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006), 15th World Congress of Pharmacology (Beijing, 2006), II международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2006), XVIII симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2006), Российских научно-практических конференциях с международным участием «Актуальные вопросы острой и хронической боли» (Самара, 2005) и «Хронические болевые синдромы» (Новосибирск, 2007), II и III съездах фармакологов России (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2007), I, II, III и IV Российских симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2005; Пущино, 2007; Казань, 2009).
Объем и структура диссертации. Представленная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 687 отечественных и зарубежных источников, приложения. Диссертация изложена на 297 страницах машинописного текста, содержит 54 таблицы и 74 рисунка.
