Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Вирусологические и патогенетические аспекты простого герпеса 12
1.2 Механизмы ускользания ВПГ от противовирусного надзора 15
1.3 Система интерферонов I типа в противовирусной защите 20
1.4 NK-клетки 25
1.4.1 Характеристика NK-клеток 25
1.4.2 NK-клетки и ВПГ-инфекция 33
1.4.3 Современные методы исследования функциональной активности NK-клеток: оценка дегрануляции NK-клеток. 35
1.5 Современные подходы к терапии простого герпеса 39
1.5.1 Ациклические нуклеозиды 39
1.5.2 Вакцинотерапия 47
1.5.3 Иммуномодулирующая терапия 49
Глава 2. Материалы и методы 54
2.1 Пациенты и доноры 54
2.2 Реактивы, расходные материалы и оборудование 57
2.2.1 Реактивы для культуральных работ 57
2.2.2 Моноклональные антитела 57
2.2.3 Флюоресцентные красители 57
2.2.4 Прочие реактивы для иммунофлюоресцентной окраски клеток 58
2.2.5 Реагенты для выделения РНК, обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени 58
2.2.6 Реагенты для гель-электрофореза 59
2.2.7 Расходные материалы 59
2.2.8 Оборудование 59
2.3 Забор крови и выделение мононуклеарных клеток 60
2.4 Культивирование клеток K562 61
2.5 Определение дегрануляции NK-клеток по экстернализации CD107a 61
2.6 Определение NK-активности МНК 62
2.7 Стимуляция МНК рекомбинантным ИФН–2b 63
2.8 Оценка уровней ИФН- в супернатантах стимулированных вирусом клеток методом иммуноферментного анализа (интерфероновый статус) 64
2.9 Выделение РНК 65
2.10 Спектрофотометрия 65
2.11 Гель-электрофорез 66
2.12 Обратная транскрипция 67
2.13 ПЦР в реальном времени 67
2.14 Статистическая обработка результатов 68
ГЛАВА 3. Результаты исследования 69
3.1 Клиническая характеристика пациентов с ЧРПГ 69
3.2Результаты оценки состояния системы «NK-клетка / ИФН I типа» у пациентов с ЧРПГ и у здоровых доноров 73
3.2.1 Оценка влияния ИФН- на дегрануляцию NK-клеток у здоровых доноров. 73
3.2.2 Оценка влияния ИФН- на дегрануляцию NK-клеток у пациентов с ЧРПГ 78
3.2.3 Оценка влияния ИФН- на цитотоксическую активность NK-клеток (NK-активность) у здоровых доноров и пациентов с ЧРПГ 85
3.2.4 Оценка особенностей синтеза ИФН- мононуклеарными клетками крови в ответ на вирусные индукторы у пациентов с различными вариантами ответа NK-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН- 91
3.2.5 Оценка экспрессии ИФН-индуцибельных генов с противовирусной функцией OAS1 и Mx1 у пациентов с ЧРПГ и у здоровых доноров 97
ГЛАВА 4. Обсуждение 101
Заключениe 119
Выводы 120
Практические рекомендации 121
Список литературы 122
- Система интерферонов I типа в противовирусной защите
- Реагенты для выделения РНК, обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени
- Результаты оценки состояния системы «NK-клетка / ИФН I типа» у пациентов с ЧРПГ и у здоровых доноров
- Оценка особенностей синтеза ИФН- мононуклеарными клетками крови в ответ на вирусные индукторы у пациентов с различными вариантами ответа NK-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН-
Введение к работе
Актуальность проблемы
Простой герпес (ПГ) вызывается вирусами простого герпеса 1-го и 2-го типов
(ВПГ-1 и ВПГ-2) и является значимой медико-социальной проблемой. Согласно
клиническим рекомендациям стандартом фармакотерапии пациентов с
рецидивирующими формами ПГ является эпизодическая или супрессивная терапия
ациклическими нуклеозидами. Однако монотерапия противовирусными
препаратами зачастую не позволяет добиться контроля над инфекцией. Высокая
частота рецидивов и вторичный иммунодефицит, развивающийся вследствие
длительной персистенции вируса, определяют необходимость патогенетического
лечения, направленного на коррекцию дефектов иммунного ответа при часто
рецидивирующих формах простого герпеса (ЧРПГ). На сегодняшний день в
арсенале врача имеется широкий спектр препаратов иммуномодулирующей
направленности, список которых постоянно пополняется. В последнее время в
терапии ЧРПГ широко применяются препараты рекомбинантного интерферона-
альфа (ИФН-) и индукторы ИФН- как с лечебной, так и с профилактической
целью. Огромное количество публикаций посвящено применению препаратов
данной группы в комплексной терапии ЧРПГ [Ophir J. et al. 1995, Тутушкина Т.В.
2005, Хаитов Р.М. 2005, Ершов Ф.И. 2008, Караулов А.В. 2008, Долгих Т.И. 2010,
Исаков В.А. 2013, Баринский И.Ф. 2013, Шульженко А.Е. 2013]. Однако именно
назначение иммуномодулирующей терапии является наиболее сложным вопросом в
терапии ЧРПГ. Этому способствует несовершенство современных подходов к
методологии назначения иммунокорригирующей терапии, которая сегодня очень
часто назначается эмпирически. Эмпирическое назначение провоцируется
отсутствием иммунодиагностического комплекса, позволяющего оценивать
вариабельность чувствительности пациента к этим препаратам в динамике
клинического процесса, предусматривать индивидуальный подход к назначению
иммуномодуляторов, оценивать индивидуальный характер выраженности
вторичного иммунодефицита и его динамику на фоне назначенной
иммунокорригирующей терапии.
Ключевыми факторами естественной противовирусной резистентности являются интерфероны I типа (ИФН I типа), которые обладают как прямым противовирусным, так и иммуномодулирующим действием. ВПГ-1 и ВПГ-2 являются мощными индукторами выработки ИФН I типа, в частности ИФН-, мононуклеарными клетками (МНК) крови здоровых людей [Rong et al. 2003]. Основными продуцентами ИФН I типа среди МНК являются плазмацитоидные предендритные клетки, которые распознают ВПГ с помощью рецептора TLR9 [Lund et al. 2003, Rasmussen et al. 2007]. При ЧРПГ имеется дефицит выработки ИФН I
типа МНК крови [Kuo et al. 1990, Pica et al. 2010, Tsutsumi et al. 2009]. Более того, врожденный дефект генов, отвечающих за индукцию выработки ИФН I типа (UNC93B, TLR3) проявляется именно тяжелыми инфекциями, вызванными ВПГ [Casrouge et al. 2006, Zhang et al. 2007].
Однако иммунологическая недостаточность у пациентов с ЧРПГ может быть вызвана не только недостаточностью интерфероногенеза, но и снижением ответа иммунокомпетентных клеток на эти цитокины. Так, известно, что некоторые белки ВПГ могут ингибировать ответ ряда клеточных линий на ИФН- [Mossman et al. 2000, Chee et al. 2004, Melchjorsen et al. 2006, Jonson et al. 2010]. В клетках, инфицированных ВПГ-1, ингибируется передача активационного сигнала от рецептора к ИФН-/ в ядро, что приводит к подавлению ответа клеток на ИФН- [Chee et al. 2004]. Эффект связан, в частности, с нарушением активации Jak/STAT-сигнального пути.
Одними из основных эффекторных клеток, противодействующих репликации
ВПГ, являются NK-клетки. В экспериментах на лабораторных животных показано,
что ранние стадии герпесвирусной инфекции могут контролироваться
исключительно интерферонами, тогда как NK-клетки в сочетании с Т- и B-клетками необходимы для противодействия вирусу на более поздних стадиях инфекции [Vollstedt et al. 2004]. По данным ряда исследований, при ЧРПГ имеет место снижение цитотоксической активности и дегрануляции NK-клеток [Мезенцева М.В. и соавт. 2002, Муругин В.В. и соавт. 2010]. NK-клетки способны к цитолизу вирус-инфицированных клеток без предшествующей активации. Однако ИФН I типа, продуцируемые в ответ на инфекцию, резко повышают цитотоксичность NK-клеток, являясь мощными активаторами NK-клеток [Хаитов Р.М. и соавт. 2010].
Учитывая снижение функциональной активности NK-клеток у пациентов с
ЧРПГ, способность ВПГ ингибировать эффекты ИФН I типа in vitro,
неэффективность интерферонотерапии у некоторых больных ЧРПГ, часто
наблюдаемую во врачебной практике клинико-лабораторную диссоциацию, когда
тяжлое течение ПГ и высокая частота рецидивов сопровождаются высокими
уровнями ИФН- в интерфероновом статусе, мы предположили, что при ЧРПГ
возможно угнетение ответа клеток иммунной системы, в частности NK-клеток, на
ИФН I типа. Для оценки функциональной активности NK-клеток помимо
стандартного метода - оценки NK-активности, использовали реакцию
дегрануляции, функциональная значимость которой доказана предыдущими исследованиями [Alter et al. 2004, Муругин В.В. и соавт. 2010]. Способность ВПГ ингибировать эффекты ИФН I типа показана на модельных клеточных линиях (Vero, HeLa) in vitro, тогда как возможность сходных процессов у пациентов с ЧРПГ не исследована. На сегодняшний день становится очевидным, что при выборе вектора иммунокоррекции необходим персонализированный подход с учтом
вариабельности «чувствительности» целевого показателя иммунной системы пациента к потенциальному лечебному воздействию в динамике клинического процесса.
Цель работы: изучить влияние рекомбинантного ИФН- на функциональную активность NK-клеток и экспрессию интерферон-индуцибельных генов с противовирусной функцией в сопоставлении с способностью к синтезу эндогенного ИФН- при часто рецидивирующих формах ПГ.
Задачи исследования:
-
Изучить влияние рекомбинантного ИФН- на дегрануляцию NK-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров
-
Изучить влияние рекомбинантного ИФН- на цитотоксическую активность NK-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров
-
Изучить экспрессию генов основных противовирусных белков OAS1 и Mx1, индуцибельных интерферонами I типа, у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров
-
Изучить особенности синтеза эндогенного ИФН- у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ с различными вариантами изменения функциональной активности NK-клеток
-
Выявить возможные варианты иммунологических нарушений в системе интерферонов I типа и NK-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ
Научная новизна
Впервые изучено влияние предварительной суточной стимуляции
рекомбинантным ИФН- на дегрануляцию NK-клеток и на цитотоксическую активность NK-клеток как у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ, так и у здоровых доноров.
Впервые использован комплексный подход к оценке системы интерферонов I
типа и NK-клеток, заключающийся в одновременной оценке как восприимчивости к
рекомбинантному ИФН- мононуклеарных клеток в целом (на основании изменения
экспрессии интерферон-индуцибельных генов) и NK-клеток в частности (по
изменению функциональной активности), так и способности к вирус-
индуцированному синтезу собственного ИФН- у пациентов с часто
рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров.
Впервые предпринята попытка установления факта ингибирования ИФН-сигналинга вирусом простого герпеса посредством оценки изменения экспрессии интерферон-индуцибельных генов не на модельных клеточных линиях, а на мононуклеарных клетках, полученных от реальных пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и от здоровых доноров.
Впервые идентифицировано два возможных варианта иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / NK-клетка».
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработан комплексный подход к оценке иммунологических нарушений в
системе «ИФН I типа / NK-клетка». С использованием данного
иммунодиагностического комплекса идентифицировано два варианта
иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / NK-клетка», что позволит применять индивидуальный, иммунодиагностически обоснованный подход к назначению иммунокорригирующей терапии, в особенности препаратами рекомбинантного ИФН- или индукторами ИФН. Установлено дозозависимое увеличение функциональной активности NK-клеток под влиянием рекомбинантного ИФН-, что подтверждает целесообразность применения иммуномодуляторов группы препаратов рекомбинантного ИФН- или индукторов ИФН при часто рецидивирующих формах ПГ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Пациенты с часто рецидивирующими формами ПГ представляют собой гетерогенную группу по особенностям изменения функциональной активности NK-клеток в ответ на рекомбинантный ИФН- и по способности их мононуклеарных клеток синтезировать ИФН- в ответ на вирусные индукторы.
-
У больных с часто рецидивирующими формами ПГ экспрессия генов ИФН-индуцибельных противовирусных белков OAS1 и Mx1 не нарушена.
-
При часто рецидивирующих формах ПГ выявлены два преобладающих типа функционального состояния системы «ИФН I типа / NK-клетка», что требует дифференцированного подхода к иммуномодулирующей терапии: при рецидиве ПГ у одних пациентов ответ NK-клеток на рекомбинантный ИФН- и синтез этого цитокина мононуклеарными клетками снижены, у других – функциональная активность NK-клеток при рецидиве полностью восстанавливается, а синтез ИФН- не нарушен.
Практическое внедрение полученных результатов
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при подготовке курсантов-слушателей на кафедре клинической иммунологии и аллергологии факультета послевузовского профессионального образования врачей ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России и используются в иммунодиагностической практике в лаборатории клинической иммунологии Федерального Государственного Бюджетного учреждения «Государственный Научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства.
Апробация работы
Апробация диссертационной работы состоялась 18 июля 2013 года на научно-практической конференции кафедры клинической иммунологии и аллергологии
факультета послевузовского профессионального образования врачей ГБОУ ВПО Первый
МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России. Основные положения диссертации
доложены и обсуждены на XII Международном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» 11-13 марта 2013 года, Москва; на Объединенном иммунологическом Форуме 5-9 июля 2013 года в Нижнем Новгороде; на Конгрессе Европейской академии клинической иммунологии и аллергологии и всемирной организации аллергии (EAACI-WAO) 20-26 июня 2013года в Милане, Италия.
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 оригинальные статьи в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.
Соответствие паспорту научной специальности
В работе выявлены особенности иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / NK-клетка» у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ, требующих дифференцированного подхода к назначению иммуномодулирующей терапии, что соответствует областям исследования «Изучение строения, функционирования иммунной системы и механизмов иммунной защиты», «Изучение патогенеза иммунодефицитных состояний», «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики иммунопатологических процессов», указанным в паспорте специальности научных работников 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология (по номенклатуре специальностей 2012 года).
Структура и объм диссертации
Диссертационная работа изложена на 149 страницах машинописного текста и
состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования,
результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.
Содержание работы иллюстрировано 14 рисунками и 13 таблицами. Список
литературы включает 71 отечественную и 226 зарубежных работ.
Система интерферонов I типа в противовирусной защите
В настоящее время у человека выделяют 9 видов интерферонов, обозначаемых греческими буквами : , , , , , , 1, 2, 3 [59, 71, 156]. Такие виды человеческого интерферона как , , , , , связываются с одним общим рецептором IFNAR(1/2) и объединены в семейство интерферонов I типа. Рецептор для ИФН I типа состоит из двух субъединиц IFNAR1 и IFNAR2 и экспрессируется практически всеми клетками организма. Их количество на поверхности клетки колеблется от 200 до 6000 на клетку [59] и характеризуются высокой афинностью. Молекула ИФН I типа связывается одновременно с обеими молекулами рецептора, встраиваясь между ними. Сигнал от IFNAR(1/2) рецептора передается JAK/STAT сигнальным путем: связывание молекулы ИФН I типа с рецептором приводит к его олигомеризации, в результате чего связанные с рецептором Janus тирозинкиназы Jak 1 и Tyk 2 фосфорилируют транскрипционные факторы STAT1 и STAT2, что необходимо для гомо- и гетеродимеризации молекул STAT и их последующей миграции в ядро, где молекулы STAT связываются с промоторными участками ДНК генов-мишеней и индуцируют их экспрессию. [211, 217, 267]. ИФН- имеет 13 разновидностей. Каждый вид и разновидность кодируется отдельным геном. Некоторые гены существуют в нескольких аллельных вариантах, которым соответствуют изоформы ИФН- (2а, 2b, 2c). Существует только одна разновидность ИФН-, кодируемая геном, также расположенным в кластере ИФН I типа на хромосоме 9 для человека.
ИФН II типа представлены только одним видом - ИФН- [250]. Структурно ИФН- отличается от ИФН I типа и взаимодействует с другим рецептором. Продуцентами ИФН- могут быть различные типы клеток: NKT-клетки, NK-клетки, плазмацитоидные ДК и МФ, CD8+ ЦТЛ, CD4+ Th1 клетки [59, 71, 140, 180]. По некоторым данным к продукции ИФН- способны B-лимфоциты и нейтрофилы [59]. Индукция выработки ИФН- в клетках, не относящихся к Т-лимфоцитам (например, NK-клетки), происходит под влиянием цитокинов, особенно ИЛ-12 совместно с другими провоспалительными цитокинами, продуцируемыми мононуклеарными фагоцитами [24, 66, 229, 232, 249, 266]. ИФН- взаимодействует с рецептором IFNGR1/R2,состоящим из двух субъединиц R1 и R2. После связывания ИФН- с рецепторным комплексом происходит фосфорилирование ферментов JAK2 и затем JAK1. В результате происходит закрепление рецептора и комплекс R1- STAT1 перемещается к ядру, где связывается с ДНК и вызывает первую волну ответа [169, 218]. Многие из этих начальных продуктов являются факторами транскрипции, участвующими в дальнейшем регулировании ИФН- опосредованного клеточного ответа. Среди данных продуктов - ИФН- регулирующие факторы (IRFs), которые стимулируют или подавляют транскрипцию ИФН-генов. ИФН- участвует во всех иммунных реакциях макрофагов и нейтрофилов и обладает множественным действием, усиливая взаимодействие между лимфоцитами и нелимфоидными клетками (за счет стимуляции экспрессии антигенов МНС на клетках эндотелия, многих эпителиальных клетках и клетках опухолевых линий) и активируя макрофаги и способствуя эффективному уничтожению внутриклеточных микроорганизмов [166].
Помимо двух традиционных групп ИФН была описана III группа ИФН-подобных цитокинов и названа ИЛ-28А (ИФН-1), ИЛ-28В (ИФН-2) и ИЛ-29 (ИФН-3). Эти цитокины представляют собой противовирусные белки, взаимодействующие с рецептором, состоящим из ИФН-ARl и ИЛ-10R2 (содержит цепь, общую с рецептором для ИЛ-10). Хотя идентичность по аминокислотному составу между ИФН- и ИФН- составляет не более 20%, функционально интерфероны III типа сходны с ИФН I типа и обладают сильной противовирусной активностью [59, 129].
ВПГ являются мощными индукторами выработки ИФН I типа (в частности, ИФН -) МНК крови здоровых людей [193, 240]. Хотя практически все клетки, инфицированные вирусами или бактериями, могут синтезировать ИФН I типа, наиболее мощными их продуцентами являются плазмацитоидные ДК, которые распознают вирус с помощью рецептора TLR9 и синтезируют ИФН / в 1000 раз больше, чем любой другой клеточный тип [188, 234]. ДК, инфицированные in vitro ВПГ, экспрессировали мРНК ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ГМ- КСФ и ФНО- от 4 ч до 12 ч после инфицирования [192]. Установлено, что при РПГ имеется дефицит выработки ИФН I типа МНК крови [32, 33, 34, 172, 227, 276]. Более того, врожденный дефект генов, отвечающих за индукцию выработки ИФН I типа (UNC93B, TLR3) проявляется именно тяжело протекающими инфекциями, вызванными ВПГ [103, 295]. Все эти данные послужили теоретической основой для целого ряда клинических испытаний препаратов ИФН I типа и индукторов ИФН при РПГ, лечебный эффект которых связан как с прямым противовирусным, так и с иммуномодулирующим действием ИФН I типа. [9, 12, 13, 19, 41, 56, 57, 58, 64, 66]. ИФН образуют автономную группу цитокинов, общее свойство которых – наличие у них противовирусной активности. В то же время, подобно другим цитокинам, они участвуют в регуляции иммунных процессов. Сочетание этих свойств делает ИФН важными факторами врожднного (а в случае ИФН- ещ и адаптивного) иммунитета и служит основанием для широкого применения ИФН в качестве лечебных препаратов [11, 32, 33, 34, 71, 208, 244] В частности, ИФН I типа обладают противовирусным и антипролиферативным действием, активируют Т-лимфоциты, естественные киллеры, моноциты, МФ и ДК, повышают экспрессию молекул MHC-I, активируют про-апоптотические гены и ингибируют анти- апоптотические механизмы, модулируют дифференцировку клеток и блокируют ангиогенез [14, 24, 32, 33, 34, 200, 240, 245]. Для целого ряда вирусов описаны белковые структуры, вызывающие цитокиновый ответ организма [24]. Ранняя продукция цитокинов может зависеть от типа проникшего вируса в организм. Для ВПГ центральным белком, вызывающим первичный цитокиновый каскад, является гликопротеин D (gD). Этот этап выработки цитокинов включает продукцию ИФН/ и ФНО- посредством активации протеинкиназ. В экспериментах на лабораторных животных показано, что ранние стадии ГВИ могут контролироваться исключительно ИФН, тогда как NK-клетки в сочетании с Т- и B-клетками необходимы для противодействия вирусу на более поздних стадиях инфекции [282]. Дополнительно к немедленной gD-зависимой продукции цитокинов ВПГ вызывает выработку других цитокинов - ИЛ-6 и ИЛ-12 путем активации других более медленных механизмов. Многочисленными работами показано, что продукция и секреция провоспалительных цитокинов (ИФН /, ИЛ-1, ФНО, ИЛ 6, 8) является ранним неспецифическим ответом организма на ГВИ [24, 32, 33, 34, 70]. Таким образом, ранняя фаза иммунного ответа на первичное инфицирование или рецидив ВПГ-инфекции возникает в первые 6—12 ч развития инфекционного процесса и обеспечивается в основном выработкой ИФН I типа [282]. ВПГ — мощный индуктор ИФН, этот эффект опосредуется распознаванием вирусных нуклеиновых кислот паттерн-распознающими рецепторами TLR3, TLR9 и DAI [103, 272, 295]. Продуцентами ИФН I типа могут быть как инфицированные эпителиоциты, так и лейкоциты, среди которых основной вклад вносят плазмацитоидные дендритные клетки [252]. Ранняя продукция ИФН-/ коррелирует с устойчивостью к ВПГ. ИФН-/ препятствуют экспрессии немедленно-ранних генов ВПГ как в ганглиях, так и в эпителиоцитах [126]. Кроме того, ИФН I типа активируют протеинкиназу R, которая фосфорилирует фактор элонгации трансляции eIF-2, что ведет к остановке трансляции в клетке. Другой мишенью ИФН-/ является РНКаза L, которая неизбирательно разрезает клеточную РНК. Наконец, интерфероны I типа обладают мощным иммунорегуляторным действием, в частности индуцируют экспрессию хемокинов, активируют МФ, ДК и NK-клетки. Врожденные дефекты индукции интерферонового ответа проявляются именно тяжелой ВПГ-инфекцией в форме энцефалита [103, 126, 295].
Реагенты для выделения РНК, обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени
Прочие реактивы для иммунофлюоресцентной окраски клеток
Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) — 1 таблетку ФСБ («ПанЭко») растворяли в 100 мл дистиллированной воды, при необходимости доводили рН до 7,2—7,4. Хранили не более 1 месяца при +4С;
Раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) — 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (РАА, Австрия) в ФСБ. Хранили не более 1 недели при +4С; ФСБ с азидом натрия и ЭДТА 0,02% раствор азида натрия (Sigma, США) и 0,02% раствор ЭДТА (Лаверна, Россия) в ФСБ. Раствор хранится длительно при +4С. TRI Reagent (Sigma, США) - Хранили при температуре -4С; Хлороформ (Sigma, США) Хранили в тмном месте при КТ; Изопропанол (Sigma, США) - Хранили в тмном месте при КТ; PCR Master Mix (Applied Biosystems, США); Смесь праймеров и зондов для генов OAS1 (№00973637 m1) и Mxl (Hs00182073 ml); Эндогенный контроль TaqMan ActB (Applied Biosystems, США); MilliQ вода -воду, свободную от РНКаз, получали на аппарате MilliPore (Франция); 75% этанол - получали из 96% этанола путм разбавления MilliQ-водой; дистиллированная вода; 2.2.6 Реагенты для гель-электрофореза Сверхчистая агароза (Invitrogen, Великобритания); Краска «6хRNA loading» для гель-электрофореза (Fermentas, Канада); 50хТАЕ-буфер (Трис-ацетатный буфер) - для приготовления к 242 г трис основания добавляли 57,1 мл ледяной СНЗСООН и 100мл 0,5 М ЭДТА (рН ЭДТА доведн до 8,0 с помощью NaOH), дистиллированной водой доводили до 1 л; Этидий бромид (маточный раствор 10 мг/мл);
Планшеты 96-луночные круглодонные полистироловые (Ленинградский завод медицинских полимеров), пробирки однократного применения объемом 15 мл, 1,5 мл и 0,5 мл типа Эппендорф (все Corning, США) и цитометрические пробирки (Beckman Coulter,США); ПЦР-пробирки объмом 0,5 мл (Corning, США); Пипетки и наконечники RNase-free (Biohit, Финляндия); ПЦР-планшет, штатив для планшета, плнка и пластина для заклеивания (все Applied Biosystems, США);
Лазерный проточный цитометр Cytomics FC500 фирмы Beckman Coulter с возможностью одновременной детекции малоуглового (переднего) светорассеивания (канал FSC), бокового светорассеивания (канал SSC) и пяти параметров флюоресценции (каналы FL1 — FL5), из которых канал FL1 предназначен для детекции FITC и CFSE, FL2 — РЕ, FL3 — ECD или PEexas Red, FL4 — РС5 и PI, FL5 — РС7. Запись и анализ данных производили с помощью программного обеспечения СХР (Beckman Coulter).
Ламинарный бокс (Flow, США), создающий непрерывный ламинарный поток воздуха для обеспечения стерильных условий работы. Центрифуги мультифункциональные программируемые и термостатируемые Allegra 25R (Beckman Coulter, США) и Heraeus Sepatech (Германия), микроцентрифуга 22R Microfuge (Beckman Coulter, США);
Инкубатор с поддержанием температуры +37С и концентрации СОг 5% (Jouan, Франция);
UV/Vis-спектрофотометр DU 730 (Beckman Coulter, США); электрофорезная камера с гребнкой (BioRad Laboratories, США) и источник питания для проведения горизонтального электрофореза Power Supply Model 200/2.0 (BioRad Laboratories, США);
УФ-трансиллюминатор (Vielber Lourmat, Франция);
Прибор для проведения ПЦР с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени «7300 Real Time PCR System» («Applied Biosystems», США);
Термоциклер (амплификатор) TPersonal (Biometra, Германия);
Прочее оборудование: холодильник «Саратов 1615-М» (Россия); электрическая плитка; аналитические электронные весы (Ohaus Analytical Plus, Швейцария), рН-метр (Mettler Toledo, Швейцария); шейкер Vortex-Genie (США); пипетки автоматические с переменным объемом «Ленпипет» (Россия); камера Горяева, модель 851 (Ленинградское производственное объединение «Красногвардеец»); морозильная камера с поддежанием температуры -70С (Sanyo, Япония) и -20С (Минск-17, Беларусь); микроскоп Laborlux D (Leitz, Германия); дисстилятор;
Забор крови (15 мл) осуществляли из периферической вены в стерильные пробирки фирмы Sarstedt (Германия), содержащие литий-гепарин. Кровь разводили средой 199 в 2 раза, и по 10 мл разведенной крови наслаивали на 3 мл фиколл-верографина. Пробирки центрифугировали при 400g в течение 25 минут при +15С, после чего отбирали слой мононуклеарных клеток (МНК) с границы между фиколл-верографином и плазмой. Клетки трижды отмывали средой 199, ресуспендировали в ПКС, считали в камере Горяева и доводили до концентрации 12,5 млн/мл (для определения дегрануляции), 5 млн/мл (для определения NK-активности). Жизнеспособность МНК после окраски трипановым синим составляла не менее 98%.
Клетки K562 вели в ПКС, пассировали каждые 2—3 сут. Для опыта использовали клетки на вторые сутки после пересева.
Дегрануляцию NK-клеток оценивали методом проточной цитометрии по появлению на поверхности NK-клеток (экстернализации) маркера CD107a после стимуляции in vitro. Использовали методику Alter и соавт. [74], с небольшими модификациями. В качестве индукторов дегрануляции NK-клеток использовали клеточный стимул — клетки эритромиелоидной HLA-I-негативной линии K562. Клетки К562 в требуемом для опыта количестве отбирали из культурального флакона, осаждали, отмывали средой RPMI-1640 (300g; 10 мин), считали в камере Горяева с красителем трипановым синим и доводили до концентрации 12,5 млн/мл. Жизнеспособность клеток К562 после окраски трипановым синим составляла не менее 95%.
В лунки 96-луночных круглодонных планшетов вносили в указанном порядке: 1) 40 мкл PC5-меченных МАТ к CD107a, разведенных на ПКС 1/50; 3) 40 мкл суспензии МНК с концентрацией 12,5106/мл (5105 клеток на лунку) и 3) индуктор дегрануляции: 40 мкл клеток К562 (5105 клеток / 40 мкл, соотношение МНК: К562 = 1:1). Конечные разведение МАТ к CD107a — 1/200. В лунку отрицательного контроля вместо индукторов дегрануляции добавляли равный объем ПКС. Для контроля окраски на CD107a в еще одну контрольную лунку не добавляли антитела к CD107a.
Результаты оценки состояния системы «NK-клетка / ИФН I типа» у пациентов с ЧРПГ и у здоровых доноров
Для выявления возможных иммунологических нарушений в системе «NK клетка / ИФН I типа» был использован комплексный подход, в котором оценивали влияние рекомбинантного ИФН- на изменение функциональной активности NK-клеток и экспрессию ИФН-индуцибельных генов с противовирусной функцией одновременно с оценкой собственной способности МНК к синтезу ИФН- в ответ на вирусные индукторы. Значимость реакции дегрануляции в оценке функциональной активности NK-клеток доказана в исследованиях Alter et al. 2004, Муругина и соавт. 2010. Под дегрануляцией NK-клеток понимается процент NK-клеток, дегранулирующих в присутствии MHC-негативных клеток-мишеней k562 (%CD107a+CD3-CD56+ клеток). В исследовании Муругина и соавт. по изучению дегрануляции NK-клеток выявлено снижение данного показателя у пожилых людей, однако в дизайне исследования проводилось сравнение данного показателя в возрастной группе старше 65 лет по сравнению с группой младше 40 лет и выявлено статистически значимое снижение в первой группе по сравнению со второй. Однако возрастная группа от 40 до 65 лет исследована не была. Следует отметить, что возрастная группа от 40 до 65 лет преобладает среди пациентов с ЧРПГ, включнных в наше исследование. В связи с этим для корректной оценки влияния ИФН- на дегрануляцию NK-клеток, на первом этапе нами изучена исходная (неактивированная) дегрануляция у здоровых лиц в разных возрастных подгруппах, включая ранее не изученную – от 40 до 65 лет. Данные нашего исследования подтверждают факт снижения дегрануляции NK-клеток с возрастом и существенно дополняют знания о дегрануляции NK-клеток здоровых лиц, а именно: снижение анализируемого показателя у здоровых людей начинается уже после 30-35 лет (рисунок 4).
Для объективизации отмеченного явления, мы разделили группу здоровых лиц на две возрастные подгруппы по медиане возраста Возраст здоровых доноров, включнных в исследование, составил 35 [22-59,4] лет. Данные представлены как Me [10p-90p]. Таким образом были сформированы две подгруппы: здоровые лица 35 лет и моложе (15 человек) и здоровые лица старше 35 лет (17 человек). Анализ показателя исходной дегрануляции неактивированных NK-клеток в двух выделенных возрастных подгруппах показал, что показатели дегрануляции неактивированных NK-клеток во второй возрастной подгруппе здоровых лиц 35 лет и моложе достоверно более чем в 3 раза снижены, по сравнению с аналогичными показателями в первой возрастной подгруппе здоровых лиц старше 35 лет (p 0,001 в тесте Манна-Уитни) (рисунок 5).
На втором этапе мы оценивали влияние на k562-индуцированную дегрануляцию NK-клеток у здоровых доноров стимуляции рекомбинантным ИФН-. Для стимуляции МНК использовали три концентрации рекомбинантного ИФН–, а именно 10, 100 и 1000 Ед/мл. В результате суточная стимуляция МНК in vitro рекомбинантным ИФН- приводила к увеличению процента дегранулирующих NK-клеток, причм данное явление наблюдалось при всех трх используемых концентрациях рекомбинантного ИФН- и эффект стимуляции имел дозозависимый характер. Однако каждый из ИФН-стимулированных показателей, также как и исходный, снижался после 30-35 лет (рисунок 6).
При сравнении ИФН-стимулированных показателей к562-индуцированной дегрануляции NK-клеток в подгруппах «старше 35 лет» и «до 35 лет» оказалось, что здоровые доноры после 35 лет имеют достоверно более низкие ИФН-стимулированные показатели, чем здоровые доноры до 35 лет при той же концентрации ИФН- (таблица 2) Как видно из таблицы, итоговый «эффект» суточной стимуляции ИФН-, т.е. разница между NK-дегрануляцией под влиянием максимальной концентрации ИФН 1000 Ед/мл и исходной NK-дегрануляцией (для краткости обозначим его «[1000-0]») в обеих группах не имел статистически значимых отличий и составил около 20 % (20,2% в группе до 35 лет, 18,9 % в группе после 35 лет, 19 в группе доноров в целом).Таким образом, достоверно более низкие показатели в группе старше 35 лет по сравнению с группой младше 35 лет обусловлены низкими исходными нестимулированными показателями. В нашем исследовании при оценке влияния ИФН- на NK-дегрануляцию наблюдается «лимит» действия цитокина в виде 20% увеличения ИФН-стимулированного параметра в независимости от исходного нестимулированного. Другими словами, ответ на цитокин в абсолютных цифрах с возрастом не меняется, с возрастом падает исходный показатель и как следствие ИФН-стимулированный показатель в итоге оказывается «низким».
На следующем этапе работы мы изучали влияние ИФН- на дегрануляцию NK-клеток у пациентов с ЧРПГ. Учитывая выявленную у здоровых доноров зависимость исходного процента дегранулирующих NK-клеток от возраста и зависимость ИФН-стимулированных показателей от исходных нестимулированных показателей, для корректной оценки влияния суточной стимуляции рекомбинантным ИФН- in vitro на дегрануляцию NK-клеток у пациентов мы разделили группу наблюдения на две возрастные группы по медиане возраста (44 года): «44 года и моложе (44)» и «45 лет и старше (45)».
Перед тем, как описывать результаты влияния ИФН- на NK-дегрануляцию, представляется логичным охарактеризовать показатели исходной дегрануляции NK-клеток у пациентов в сформированных подгруппах. Самые высокие показатели исходной (нестимулированной) дегрануляции NK-клеток наблюдались в группе здоровых доноров «44 года и моложе». Медиана данного показателя составила 22,2 %. В остальных анализируемых подгруппах показатель дегрануляции NK-клеток был достоверно вдвое снижен по сравнению с «молодыми» донорами. Так, медиана в группе пациентов с ЧРПГ «44 года и моложе» составила 11,1% и 11,4% в обострении и в ремиссию соответственно, в группе пациентов с ЧРПГ «45 лет и старше» 11,3% и 11,6% в обострении и в ремиссию соответственно, в группе здоровых доноров «45 лет и старше» 11,2% (рисунок 7).
Оценка особенностей синтеза ИФН- мононуклеарными клетками крови в ответ на вирусные индукторы у пациентов с различными вариантами ответа NK-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН-
На данном этапе мы изучали особенности синтеза ИФН- МНК крови пациентов с ЧРПГ в ответ на вирусные индукторы в динамике клинического процесса в зависимости от особенностей функционирования NK-клеток, что стало возможным в силу комплексного подхода, заключающегося в одновременной оценке вышеуказанных параметров в конкретной временной точке клинического процесса. В качестве индукторов помимо стандартного и широко используемого с данной целью индуктора вируса болезни Ньюкасла (ВБН) были использованы вирусы простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ-1 и ВПГ-2). Предварительно перед описанием результатов, полученных при выполнении данной задачи, целесообразно описать результаты оценки вирус-индуцированного синтеза ИФН- МНК крови в целом по группе пациентов с ЧРПГ в сравнении со здоровыми донорами, а именно: уровни ИФН- в супернатанте МНК пациентов с ЧРПГ, стимулированных ВПГ-1, ВПГ-2 и ВБН, не имели достоверных отличий от таковых в контрольной донорской группе ни по одному из используемых индукторов, как в стадию обострения, так и в стадию клинической ремиссии. В таблице 7 представлены полученные результаты, причм данные представлены не только в формате Me [10p-90p], но и в формате Mean±SE, что сделано для удобства сопоставления данных в связи с тем, что формат представления результатов широко используется в отечественных публикациях исследований по
На следующем этапе мы проанализировали особенности синтеза ИФН- МНК крови пациентов с ЧРПГ в зависимости от особенностей функционирования NK клеток, а именно в зависимости от выявленного ранее ответа NK-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН- (А или В) и получили следующие данные. У пациентов с ответом NK-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН- типа А способность МНК крови к синтезу ИФН- в ответ вирусные индукторы была сопоставима с таковой у здоровых доноров как в стадию клинической ремиссии, так и в обострение. Напротив, пациенты с ответом NK-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН- типа В имели принципиальные отличия от показателей здоровых доноров как при обострении заболевания, так и в стадию клинической ремиссии. При обострении заболевания у пациентов с ответом NK-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН- типа В регистрировались достоверно сниженный уровень синтеза ИФН- в ответ на ВБН и в ответ на ВПГ-1, и достоверно повышенный уровень спонтанного синтеза ИФН- по сравнению с группой контроля и по сравнению с типом А. В стадию клинической ремиссии эти пациенты не только не имели сниженной способности к интерфероногенезу, но регистрировался достоверно повышенный по сравнению со здоровыми донорами и по сравнению с типом А уровень ИФН- в ответ на индуктор ВПГ-2, а также тенденция к повышению уровня ИФН- в супернатанте в ответ на индуктор ВПГ-1 (таблица 8). При анализе исследуемых показателей в динамике клинического процесса отмечалось отсутствие какой-либо тенденции к изменению показателей в зависимости от фазы клинического процесса при типе А (рисунок 13). У пациентов подгруппы В, напротив, отмечалась интересная динамика в ходе клинического процесса, а именно: стадия ремиссии характеризовалась повышенными показателями интерфероногенеза, достигающими статистически значимой разницы в ответ на индуктор ВПГ-2, в то время как наступившая стадия обострения характеризовалась резким падением способности к синтезу ИФН- в ответ на вирусные индукторы по сравнению со стадией ремиссии на ВПГ-1 в 5 раз, на ВПГ-2 в 3 раза, на ВБН в 2,3 раза, при этом достоверно повышенным становился спонтанный синтез ИФН- (рисунок 14).
На данном этапе мы исследовали ответ мононуклеарных клеток пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и здоровых доноров на действие ИФН- на основании экспрессии интерферон-индуцибельных генов с противовирусной функцией OAS1 и Mx1. Для этого мы оценивали уровни транскриптов противовирусных белков OAS1 и MxА после 3-х-часовой стимуляции мононуклеарных клеток крови пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и здоровых доноров возрастающими концентрациями рекомбинантного ИФН-. Использовали рекомбинантный ИФН- в концентрации 1, 10 и 100 Ед/мл. Оценку проводили как в стадию обострения, так и в стадию клинической ремиссии. В результате проведнной оценки получены следующие результаты.
Относительное определение уровня представленности транскриптов OAS1 в образцах МНК пациентов, стимулированных в течение 3-х часов рекомбинантным ИФН- и в образцах МНК здоровых доноров, стимулированных в течение 3-х часов рекомбинантным ИФН- не выявило статистически значимых различий ни в стадию обострения, ни в стадию клинической ремиссии. Статистически значимые различия отсутствуют как в образцах, стимулированных рекомбинантным ИФН- в концентрации 1 Ед/мл, так и в образцах, стимулированных более высокими концентрациями 10 и 100 Ед/мл.
Относительное определение уровня представленности транскриптов Mx1 в образцах МНК пациентов, стимулированных в течение 3-х часоврекомбинантным ИФН- и в образцах МНК здоровых доноров, стимулированных в течение 3-х часов рекомбинантным ИФН- также не выявило статистически значимых различий ни в стадию обострения, ни в стадию клинической ремиссии, причм данная тенденция также имела место как при стимуляции рекомбинантным ИФН- в концентрации 1 Ед/мл, так и в более высоких концентрациями 10 и 100 Ед/мл. Результаты определения относительной экспрессии генов OAS1 и Mx1 после стимуляции МНК рекомбинантным ИФН- подробно представлены в таблице 9.
