Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Система интерферона и цитокиновый ответ при гриппе, других ОРВИ и генитальном герпесе
1.1. Роль системы интерферона при вирусных инфекциях 13
1.2. Цитокиновый оівет на вирусную инфекцию 23
1.3. Методология изучения системы ИФН. Интерфероновый статус. 31
Глава 2 . Медикаментозная терапия гриппа, других ОРВИ и генитального герпеса
2.1. Терапия гриппа и ОРВИ 3 5
2.2. Терапия генитального герпеса 44
Глава 3. Характеристика нового отечественного индуктора ИФН — Кагоцела 47
A. Физические, химические свойства и состав лекарственной формы 47
Б. Фармакодинамика Кагоцела (специфическая активность) 48
B. Токсикологические исследования препарата 49
Г. Аллергенное действие 56
Д. Эмбриотоксичность 56
Е. Мутагенные свойства 57
Ж. Фармакокинетика и метаболизм препарата у животных 57
Глава 4. Материалы и методы
1.1. Характеристика обследованных больных 60
1.2. Клинико-лабораторные методы исследования 64
Глава 5 . Противовирусная и цитокининдуцирующая активность индуктора ИФН — Кагоцела на клеточных моделях
2.1. Противовирусная активность Кагоцела 77
2.2. Цитокининдуцирующая активность Кагоцела 82
Глава 6. Клиническая эффективность препарата Кагоцел при гриппе. Воздействие Кагоцела на систему ИФН у больных гриппом
3.1. Оценка клинической эффективности препарата Кагоцел и динамика показателей ИФН статуса больных гриппом при лечении Кагоцелом 86
3.2. Оценка клинической эффективности препарата Кагоцел и динамика показателей ИФН статуса больных гриппом, осложнённым бактериальной инфекцией (ангиной) 93
Глава 7. Клиническая эффективность Кагоцела и показатели ИФН статуса при ОРВИ 100
Глава 8. Клиническая эффективность Кагоцела и показатели ИФН статуса при лечении больных генитальным герпесом
5.1. Клиническая эффективность Кагоцела при монотерапии. Показатели ИФН статуса больных генитальным герпесом в динамикепри монотерапии Кагоцелом 103
4 5.2. Клиническая эффективность Кагоцела и показатели ИФН статуса больных генитальным герпесом в динамике при комбинированной терапии 105
Глава 9. Чувствительность к индукторам и препаратам ИФН лейкоцитов крови больных гриппом, ОРВИ и больных генитальным герпесом
6.1. Чувствительность к ИФН-индуцирующему воздействию индукторов ИФН 108
6.2. Чувствительность к праймирующему воздействию препаратов ИФН 113
Выводы 129
Список литературы 130
Практические рекомендации 145
- Цитокиновый оівет на вирусную инфекцию
- Терапия генитального герпеса
- Токсикологические исследования препарата
- Клинико-лабораторные методы исследования
Введение к работе
Актуальность исследования
Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции, а также генитальныи герпес относятся к числу повсеместно распространенных вирусных заболеваний, которые остаются мало контролируемыми, главным образом, из-за высокой изменчивости антигенной структуры вирусов и недостаточной эффективности применяемых средств лечения и профилактики.
При этих вирусных инфекциях снижается иммунологическая резистентность, происходит подавление функциональной активности различных звеньев иммунной системы, обостряются многие хронические заболевания и возникают вторичные бактериальные осложнения, что придает проблеме лечения и профилактики данных вирусных инфекций особую значимость и актуальность.
Одной из интегративных систем организма является система ИФН, играющая важную контрольно-регуляторную роль в поддержании гомеостаза [17, 23, 56]. Система ИФН является одним из первых рубежей защиты организма при внедрении вирусов, осуществляя их элиминацию на ранних этапах болезни [11, 70, 85, 112]. Кроме того, система ИФН играет роль связующего звена между механизмами врожденного и приобретенного иммунитета, обеспечивая пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток, а также регулируя их активность [72, 110, 120, 122].
Несмотря на большое количество противогриппозных и антигерпетических средств, профилактика и лечение гриппа, ОРВИ и генитального герпеса продолжают оставаться важной проблемой медицинской науки [15, 16, 20, 34, 69, 148,155].
Одной из наиболее перспективных групп препаратов, обладающих высокой лечебной эффективностью в отношении гриппозной и герпетической инфекций, является группа индукторов ИФН — препаратов с ИФН-индуцирующей активностью [11, 20, 49, 60, 62, 76].
9 В настоящее время изучено более сотни соединений, относящихся к разным классам, которые способны стимулировать образование ИФН в организме животных и человека. Синтез ИФН является универсальным ответом живого организма на различные воздействия и в первую очередь на вирусную инфекцию. В медицинской практике существуют два направления - применение экзогенных ИФН (лейкоцитарных или рекомбинантных) и индукция эндогенных ИФН [17]. Было показано, что индукторы ИФН обладают рядом отличий по сравнению с препаратами ИФН. Так, при использовании индукторов ИФН образуется свойственный данному организму, и, следовательно, обладающий оптимальной биологической активностью, ИФН.
Индукторы ИФН, в большинстве своём, не имеют побочных эффектов и доступны. Продуцируемый эндогенный ИФН, оказывает неспецифическое противовирусное действие, а также стимулирует развитие специфического иммунного ответа [23, 50,72].
Новый индуктор ИФН растительного происхождения — Кагоцел, разработанный сотрудниками отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.
Гамалеи РАМН совместно с НИИ химии и физики полимеров АН Республики
Узбекистан, и производимый ООО "НИАРМЕДИК ПЛЮС" (Москва), относится к классу полифенолов — соединений, отличающихся сравнительной простотой строения и, что особенно важно для клинического применения, отсутствием антигенной активности [22, 57, 58]. В многочисленных доклинических исследованиях показано, что препарат подавляет репродукцию ортомиксо-, миксо-, герпес-, тога-, пикорнавирусов и обладает также выраженным радийпротективным действием, антибактериальными и иммуномодулирующими свойствами [16, 23, 26, 45, 57, 59]. Препарат, помимо
ИФН-индуцирующей активности, обладает этиотропным действием in vitro в отношении вирусов простого герпеса и гриппа [26, 45, 59]. На основании результатов подученных при проведении доклинических исследований препарата Кагоцел, было сделано предположение об его возможной клинической эффективности при лечении гриппа, других ОРВИ и генитального
10 герпеса у людей, что обусловило необходимость уточнения механизмов действия препарата и проведения клинических испытаний.
Цель исследования
Установить взаимосвязь коррекции нарушений системы ИФН и клинической эффективности препарата Кагоцел у больных гриппом, ОРВИ генитальным герпесом.
Задачи
Изучение противовирусной и цитокининдуцирующей активности индуктора ИФН Кагоцела на клеточных моделях.
Изучение клинической эффективности и интерферониндуцирующей активности индуктора ИФН Кагоцела при гриппе и других ОРВИ.
Изучение клинической эффективности и интерферониндуцирующей активности индуктора ИФН Кагоцела при генитальном герпесе.
Изучение индивидуальной чувствительности клеток крови пациентов in vitro к индукторам ИФН и препаратам ИФН при гриппе, ОРВИ, генитальном герпесе, а также характера изменения чувствительности к данным препаратам в процессе терапии больных индуктором ИФН Кагоцелом.
Установление взаимосвязи клинической эффективности препарата Кагоцел с его интерферониндуцирующей активностью и индивидуальной чувствительностью к ИФН и Кагоцелу при гриппе, других ОРВИ и генитальном герпесе.
Научная новизна работы
Впервые на модели человеческих клеток МТ-4 показана противовирусная и цитокин-индуцирующая активность индуктора ИФН Кагоцела при экспериментальной гриппозной инфекции и установлен характер влияния Кагоцела на цитокиновый профиль.
Впервые на модели клеток Vero показана противовирусная активность Кагоцела в отношении вируса герпеса простого 1 и 2 типов.
Впервые в рамках клинических исследований проведено изучение ИФН-индуцирующей активности и клинической эффективности нового отечественного индуктора ИФН Кагоцела у взрослых людей при гриппе, неосложнённом и осложнённом бактериальной инфекцией, других ОРВИ и генитальном герпесе: установлена высокая клиническая эффективность и показано корригирующее воздействие препарата Кагоцел на показатели ИФН статуса в процессе лечения.
Впервые в рамках клинических исследований изучен характер влияния препарата Кагоцел на клеточную чувствительность к различным индукторам и препаратам ИФН: показано, что Кагоцел обладает способностью восстанавливать нарушенную при гриппе, других ОРВИ и генитальном герпесе чувствительность клеток крови к ИФН, а также усиливать выработку ИФН праймированными лейкоцитами крови больных.
Практическая значимость
На основании полученных при проведении клинических исследований результатов, препарат Кагоцел разрешён МЗ РФ для медицинского применения в качестве лечебного средства при гриппе, других ОРВИ и генитальном герпесе (Регистрационное удостоверение Р № 002027/01-2003 от 09.01.03).
На основании методов определения индивидуальной клеточной чувствительности к препаратам лейкоцитов крови больных научно обоснована
12 необходимость индивидуального подбора лекарственного препарата из группы индукторов ИФН при гриппе, ОРВИ и генитальном герпесе. Планируются к выпуску методические рекомендации по индивидуальному подбору индукторов
ИФН при вышеуказанных патологиях.
На основании проведенных исследований, Кагоцел рекомендован к применению в клинической практике в качестве препарата оказывающего противовирусное и корригирующее воздействие на нарушенные показатели системы ИФН при гриппе, осложнённом и неосложнённом бактериальной инфекцией, других ОРВИ (парагрипп и аденовирусная инфекция) и при генитальном герпесе.
Апробация материалов диссертации
Основные результаты исследования представлены на Международном конгрессе по Интерферонам и Цитокинам в Амстердаме (5-9 ноября, 2000), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ в Москве (12-14 сентября, 2001), VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Москве (26-28 марта, 2002), международной конференции «Цитокины, Воспаление, Иммунитет» в Санкт-Петербурге (23-26 июня, 2002), V Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии» в Москве (12-14 ноября, 2002).
Диссертация апробирована на научной конференции отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 28 февраля 2003 года.
ЧАСТЬ I
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Цитокиновый оівет на вирусную инфекцию
Цитокины — группа растворимых белков, посредством которых осуществляется взаимодействие между клетками и их внешним окружением. Все цитокины являются простыми пептидами или гликопротеийами, с относительно низкой молекулярной массой ( 30 кД), секрегируемыми клетками в окружающую среду. Цитокины главным образом оказывают аутокринные и паракринные воздействия, реализующиеся в коротком радиусе действия, но при экстремальных СОСТОЯНИЯХ могут обладать эндокринными, системными эффектами. В состоянии покоя выработка цитокинов ограничена жесткими контрольно-регуляторньши механизмами или полностью отсутствует. Выработка цитокинов индуцируется при инфекционном заражении и под воздействием различных факторов (химических, физических и др.). Спектр выделяемых цитокинов при заражении инфекционными агентами разных классов (вирусы, бактерии, паразиты) уникален для каждого отдельного класса возбудителей. При этом в норме, включаются различные, определяемые цитокинами, наиболее эффективные в отношении конкретного инфекционного агента защитные механизмы [27, 35, 36, 96].
Цитокины обладают исключительно высокой биологической активностью и эффект воздействия их на клетки проявляется уже при пикограммовых концентрациях медиаторов. Воздействие цитокинов на клетку осуществляется через высокоспецифические рецепторы, встроенные в мембрану чувствительных к цитокииам клеток. Количество рецепторов на клетке колеблется в пределах от нескольких десятков до десятков тысяч и определяется функциональным состоянием клетки. При активации клеток количество вновь синтезированных рецепторов может быстро (в течение нескольких часов) многократно возрастать. Рецепторы в большинстве своём имеют субъединичное строение и включают, как правило, внеклеточную, трансмембранную и внутриплазматическую части. Для ряда цитокинов, в том числе ИФН, имеются высокоаффинные «персональные» рецепторы, а для ряда цитокинов воздействие на клетку может осуществляться при одновременном связывании с несколькими рецепторными субъединицами других цитокинов рб, 96, 133]. Связывание шітокина с соответст - щим рецептором обеспечивает трансмембранное проведение сигнала в клетку, в результате которого происходит активация ряда цитоплазматических ферментов и, в частности, фосфоршщрование тирозинкяназ. Активация (фосфорилирование) тирозин/серино тх киназ приводит к запуску касжада ферментативных процессов, & резудЬїате кот чоых в клетках накапливаются фосфорилированные белки. Эти узлки из цитоплазмы поступают в ядро клетки и взаимодействуют с определенными генами в молекуле ДНК, активируя или ингибируя процесс транскрипции этих генов и синтез соответствующих мессенджер (информационных/ РНК (мРНК). Трансляция мРНК приводит к синтезу и накоплению в клеже набора новы белковых молекул, что проявляется в изменении фенотипичеокмх свойств и поведения клеток [35].
Цитокины характеризуются сетевым взаимодействием и могут модифицировать эффект воздействия других цитокинов на ту же клетку. Для цитокинов характерен каскадный :,г; :гн-н . дпіЬнгщя, при этом одни цитокины способны индуцировать в клетке процесс биосинтеза других цитокинов и изменять количество и структур} рецепторов к ним. По отношению друг к другу воздействие различных цитокинов мо ет проявляться как синер-дческие, антагонистическое или аддитивное (добавочное) [85,96].
Таким образоs биологические эффекты цитокинов являются результатом их сложного многой./ "штного каскадного и сетевого взаимодействия [35]. В последнее время цитокины, в основном, штсспфіщируются, согласно их эффекторной функции, на 2 основных семейства: Till и Th2. При этом, к ТЫ цитокинам относятся ИЛ-2 к И ФН-у, главной функцией которых является регулирование механизмов клеточного иммунного ответа, гиперчувствительности замедленного типа, процессов Т-клеточной пролиферации и активации макрофагов. Тп2 цитокины включают ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13, которые участвуют в регулировании гуморального иммунного ответа. Однако, такое чёткое функциональное разделение несколько искусственно ввиду того, что некоторые цитокины принимают участие и в клеточном и в гуморальном иммунных ответах [85, 123, 141]. Общие индукционные и функциональные характеристики цитокинов позволяют разделить их на четыре основные группы: а) ранние и неспецифические цитокины; б) адаптивные цитокины (цитокины слецифического иммунного ответа); в) хемокины; г) гематопоэтические ростовые факторы [96]. Ранние и неспецифические цитокины относятся к начальной стадии первичной инфекции и связаны с неиммунными клетками или клетками неспецифической иммунной системы — полиморфноядерными лейкоцитами, моноцитами, макрофагами, естественными киллерными и дендритными клетами. Экспрессия этих цитокинов способствует реализаций неспецифического иммунного ответа.
Адаптивные цитокины тесно связаны с более поздними событиями инфекции — развитием специфического иммунного ответа, при этом основные эффекты этих цитокинов направлены на Т- и В-лимфоциты. Этими цитокинами регулируется развитие клеточного или гуморального иммунного ответа. Хемокины связаны с воспалительным процессом, возникающим при инфекции, обуславливая его течение, как при неспецифическом, так и при специфическом иммунном ответе [96, 159]. Четвертая группа цитокинов включает в себя медиаторы роста и дифференцировки лейкоцитов. Основные функции, реализуемые цитокинами этой группы, направлены на нормальный леикопоэз, но некоторые из этих цитокинов могут индуцироваться в процессе инфекции. Существует также традиционная классификация, согласно которой цитокины подразделяют на группы: интерлейкины (1-25) — факторы взаимодействия лейкоцитов, интерфероны (а-, р-, у-, со-, т-)— цитокиш.. обладающие противовирусной и иммуномодулирующей активностью, факторы некроза опухолей (а-, {3-) — цитокины с цитотоксической активностью, колониестимулирующие факторы (ГМ-КСФ, М-КСФ, Г-КСФ) — гематопоэтические цитокины [85]. Согласно иной классификации, основанной на механизме действия, цитокины подразделяют на: ростовые факторы, контролирующие продукцию иммунокомпетентных клеток; провоспалительные цитокины, обеспечивающие мобилизацию и активацию клеток-участников воспаления; противовоспалительные цитокины с альтернативным характером действия, ограничивающие развитие воспаления; цитокины, регулирующие клеточный и гуморальный иммунный ответ; цитокины, обладающие собственными эффекторными функциями и др. [72].
Цитокины играют важную роль в регуляции процессов жизнедеятельности в норме. Физиологический уровень цитокинов и способность клеток к индуцированному синтезу цитокинов в норме формирует, так называемый цитокиновый профиль, отражающий функциональное состояние организма в целом.
Внедрение в организм инфекционного агента вызывает значительные изменения цитокинового профиля организма. Характерные для различных инфекционных агентов изменения цитокинового профиля обуславливают развитие неспецифического, а в дальнейшем и специфического иммунного ответа [36, 96].
Терапия генитального герпеса
В лечении генитального герпеса особое значение играет тактика ведения пациента и формирование у него на основе доверительных отношений е врачом адекватного образа жизни, медикаментозная терапия является при этом, значимым, но не исчерпывающим все компонентом.
В медикаментозном лечении генитального герпеса существуют два основных подхода: первый — применение этиотропных противовирусных химиопрепаратов и второй — патогенетическая терапия средствами различного иммунного действия [68, 74].
В современных подходах в лечении генитального герпеса всё большее внимание уделяется индивидуальной оценке показателей иммунного и ИФН статусов больного, что даёт возможность выбора наиболее оптимальной лечебной стратегии. Основными задачами проводимого лечения является предотвращение возникновения рецидивов заболевания, сокращение длительности и уменьшение тяжести течения рецидивов и предупреждение развития датентности и клинических рецидивов после первичной лнфекции [20., 31].
Протнвовирусныё химиопрепараты составляют самую многочисленную группу препаратов, используемых для терапии герпес-вирусной инфекции. Все известные сегодня химиопрепараты являются синтетическими аналогами естественных нуклеозидов, противовирусная активность которых основана на нарушении репликации ВПГ за счёт замены собой одного из нуклеозидо» в цепочке ДНК-вируса. В последние годы многочисленный список препаратов пополнили новые препараты; валтрекс, пенциклозир, фамцикловир, ганцнкдовир, обладающие высокой клинической эффективностью [20, 74].
Многочисленные клинические исследования и большой опыт -.-клинического применения химиопрепаратов свидетельствуют об их высокой эффективности при купировании рецидивов простого герпеса и отсутствии профилактического действия, что ограничивает показания к их назначению. Пролонгированная терапия препаратами этой группы предотвращает развитие рецидивов только в течение курса приема препарата, после прекращения которого, рецидивы возобновлялись с той же частотой [69, 74].
Кроме того, за последнее время увеличилось число сообщений об устойчивости вируса герпеса к препаратам группы аномальных нукдеозидов, обусловленной, как правило, генетической изменчивостью вирусов, что в значительной степени ограничило применение этих препаратов. В настоящее время этиотропная химиотерапия заняла свою значимую нишу среди многообразия методов лечения этого заболевания, [69} 74, 88].
Патогенетическая терапия, направленная на формирование и повышение эффективности иммунных механизмов в организме при герПесвирусной инфекции, является в настоящее время наиболее перспективной и интенсивно развивающейся. Препараты, применяемые для коррекции иммунитета при герпесвирусной инфекции, разделяются на три основные группы: ИФН (природные и рекомбииантные), индукторы ИФН к иммуномодуляторы [20].
Препараты нативных и рекомбинантных ИФН, эффективные при множестве патологических состояний, длительное время использовались для лечения герПесвирусной инфекции и профилактики рецидивов, однако эффективность их применения в большинстве случаев была невысокой. Определенным преимуществом обладает комбинированный препарат Виферон, включающий в себя рИФН-а, витамины С и Е, показавший свою эффективность при купировании обострений и выраженное нротиворецидивное действие при длительном применении [5J.
Широкий спектр противовирусной активности известных индукторов ИФН позволяет эффективно использовать их для лечения генитального герпеса. В клинической практике хорошо зарекомендовали себя индукторы природного (Ридостин) и синтетического (Циклоферон, Амиксин) происхождения. Их высокая ИФН-индуцирзтощая активность способствует устранению нарушений в системе ИФН, купированию рецидивов заболевания и продлению периодов ремиссии [74]. Однако, эффективность применяемых препаратов достигает в лучшем случае 75%. свидетельствуя об отсутствии ответа на проводимую терапию у ряда больных [81].
При исследовании индукторов ИФН in vitro на клетках крови больных была выявлена различная индивидуальная чувствительность клеток крови к ЙФН-индуцирующему воздействию препаратов. Этим, возможно, объясняется отсутствие в ряде случаев ожидаемого клинического эффекта, и подчёркивается необходимость дальнейшего изучения механизмов антивирусной активности индукторов ИФН и поиск более эффективных препаратов» относящихся к этому классу [63].
Также, при генитальном герпесе широкое применение нашли иммуномодудяторы алпизарин, имунофан, ликопид, полиоксидоний и др., обладающие иммуностимулирующими свойствами и нормализующие окислительно-восстановительные процессы [14]. Одним ш спорных методов лечения герпетической инфекции является противогерпетическая вакцинация. И хотя в ряде исследований показана высокая эффективность (от 30 до 80 % пациентов при полном курсе лечения) вакцинотерапии, имеются данные о недостаточной иммуногенности вакцин, а применение их требует крайней осторожности в виду опасности развития аллергических и системных аутоиммунных заболеваний [74, 151].
Таким образом, к моменту выполнения настоящей работы в практической медицине уже был внедрен довольно широкий арсенал средств для лечения и профилактики гриппа, других ОРВИ и гениталь-ного герпеса. Однако, эффективность этих препаратов в ряде случаев была недостаточной, что явялется причиной продолжающегося поиска новых антивирусных препаратов. 1.1. Характеристика нового отечественного индуктора ІІФІІ —
Кагоцела А. Физические, химические свойства и состав лекарственной формы Кагоцел - гетероцепный полимер, молекулярной массой 120-130 кД, получаемый путем химического синтеза из растительного сырья -водорастворимой карбоксиметилцеллюлозы и госсипола. Содержание госсипола в Кагоцеле не превышает 3 масс %, в свободном виде в субстанции гаесипоа не определяется. Представляет собой гигроскопичный аморфный порошок от кремового до коричневого цвета, без запаха. Легко и медленно растворим в воде, практически нерастворим в 95% спирте, ацетоне, хлороформе [161.
Госсипол — природный полифенол, являющийся специфическим пигментом хлопчатника Gossypium hirsutiim L. из семейства Malvaceae. Госсипол в препарате находится в связанном виде и в процессе метаболизма не выделяется. В молекуле госсипола имеются два нафталиновых ядра, замещённые гидроксильными, альдегидными и алкильньши группами, обуславливающих его высокую биологическую активность. Процесс получения субстанции Кагоцел заключается в химическом синтезе полимера из натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, дополнительно обработанной йодной кислотой и изопропиловым спиртом, и госсипола или его производного. Сама по себе карбоксиметилцеллюлоза ИФН-индуцирующей активностью не обладает, а с введением в молекулу полимера иизкомолекулярного полифеиола госсипола в концентрации 3%, образует новое соединение с высокой биологической активностью [57, 58, 61,].
Токсикологические исследования препарата
К настоящему времени многочисленными экспериментальными исследованиями доказана ИФН-индуцирующая и противовирусная активность Кагоцела. Обработка этим препаратом различных культур клеток и введение его в организм экспериментальных животных приводит к выработке ИФН и развитию противовирусной резистентности. Оптимальная ИФН-индуцирующая концентраций Кагоцела в экспериментах на культурах клеток составляет 250 мкг/мл, на лабораторных животных 20 мг/кг веса [22, 45]. 1). Исследование цитотоксичности
Препарат Кагоцел в дозах 250-2000 мкг/мл не оказывал видимого токсического воздействия на культуру клеток L-929 [22, 58, 59], До 500 мкг/мл на клетки FRhK-4 при 48 часовой длительности контакта с клетками [26]. 2). ИФН-индуцирующая активность in vitro
При исследовании ИФН-индуцирующей активности препарата Кагоцел in vitro показано, что препарат индуцирует выработку ИФН в культурах клеток мышиного происхождения L-929 и человеческой диплоидной клеточной культуре М-19. При этом пик продукции ИФН отмечался через 12 часов индукции, а максимальные титры ИФН достигали для М-19 — 2560 ед/мл, для L-929 — 2048 ед/мл, для обеих культур клеток оптимальная концентрация Кагоцел а составляла 250 мкг/мл 58].
При индукций Кагоцелом ИФН в клетках крови, костного мозга, тимуса и селезенки выделенных у интактных животных, наибольшие титры ИФН синтезируют спленоциты, клетки костного мозга (320 ед/мл), в меньшей степени лейкоциты периферической крови итимоциты [45].
При анализе антигенного состава ИФН, индуцированных препаратом Кагоцел, было установлено, что под воздействием препарата в клетках М-19 вырабатывается ИФН-р, а в кудьтуральной суспензии лимфоцитов крови человека вырабатывается смесь ИФН-а и -[} [58, 70]. 3). ИФН-индуцирующая активность in vivo
Результаты проведенных исследований по определению ИФН-индуцирующей акгивности препарата Кагоцел in vivo в зависимости от дозы и пути его введения показали, что при использовании препарата максимальные титры ИФН (1230 ед/мл) в сыворотке крови мышей отмечались при внутрибрюшинном введении индуктора в дозе 100 мг/кг веса. При подкожном способе введения максимальная продукция сывороточного ИФН достигала 640-1280 ед/мл и отмечалась при дозе 50 мг/кг веса. При пероральном пути введения индуктора достаточно высокие титры ИФН (640-1280 ед/мл) регистрировалась в кровотоке животных при дозе индуктора, равной 10 мг/кг веса, при этом количество вводимого вещества в 10 и 5 раз, соответственно, меньше по сравнению с парентеральными способами его введения [45].
При изучении динамики накопления ИФН в крови мышей при различных путях введения Кагоцела установлено, что при внутрибрюшинном и пероральном способах его введения, титры ИФН достигали максимальных значений через 48 часов (1024-2048 ед/мл). ИФН ответ организма животных при этом характеризовался продолжительной циркуляцией (до 72-96 часов) ИФН в кровотоке животных.
Характер распределения эндогенного ИФН в организме экспериментальных животных при пероральном введении препарата в значительной мере соответствовал характеру распределения самого Кагоцела изученного при введении в организм 14С-Кагоцела. Уже через 4 часа в кишечнике обнаруживался ИФН в концентрации более 10 000 ед/г ткани органа. В это время в сыворотке крови ИФН только начинал определяться, достигая максимума к 24-48 часам. Динамика накопления ИФН в печёночной, лёгочной ткани, а также в тимусе, повторяет динамику накопления ИФН в сыворотке крови, но уровень, определяемый в этих органах, на порядок ниже уровня активности сывороточного ИФН [58, 59].
При изучении участия иммунокомпетентных клеток в продукции ИФН установили, что при индукции in vivo наблюдалась некоторая избирательность, хотя практически все клетки иммунной системы продуцировали ИФН в ответ на индукцию Кагоцелом. Среди исследованных клеток наибольший уровень ИФН отмечался в спленоцитах, лимфоцитах крови и селезенки, наименьший - в клетках тимуса. Пик продукции ИФН лимфоцитами приходился на 2-3 сутки после индукции, по-видимому, за счет активности Т-клеток. В-лимфоциты и гранулоциты периферический крови синтезировали максимум ИФН в первые 24 часа после индукции [45, 70, 71]. 4). Изучение противовирусной активности препарата Кагоцел in vitro
Исследования антивирусного действия препарата Кагоцел в отношении вируса гриппа проводилось на модели клеточной культуры MDCK. Максимальный защитный эффект выявлялся при внесении Кагоцела в дозе 1 MF/МЛ за 24 часа до заражения клеток (20 ГА ед/мл) и через 24 часа после заражения (80 ГА ед/мл, по сравнению с контролем — 5120 ГА ед/мл) [45]. Также была показана противовирусная активность препарата Кагоцел в отношении вируса энцефаломиокардита мышей на клетках L-929, вируса гепатита А на клетках FRHK-4 [26, 58]. 5), Изучение противовирусной активности препарата Кагоцел при экспериментальной гриппозной инфекции in vivo Активность Кагоцела была изучена на модели экспериментальной инфекции, воспроизводимой посредством заражения белых мышей вирусом гриппа. При этом было изучено: влияние Кагоцела на выживаемость и продолжительность жизни мышей зараженных летальной дозой вируса при применении профилактической и лечебной схем; - определение степени подавления репродукции вируса гриппа в легких мышей в различные сроки после инфицирования с использованием различных схем применения Кагоцела; - изучение защитного эффекта Кагоцела при пероральном введении препарата Кагоцел. Наилучшие показатели по выживаемости и продолжительности жизни мышей, заражённых летальной дозой вируса гриппа, достигнуты при введении препарата в дозе 20мг/кг веса за 24 часа до заражения мышей (выживаемость 50%, средняя продолжительность жизни 9,4 дня) и через 24 часа после заражения (выживаемость 45%, средняя продолжительность жизни 8,4 дня), при 100% гибели животных в контроле.
В другой серии экспериментов животных инфицировали вирусом A/Aichi 1/68 (H3N2), адаптированным к легким мышей в дозе 100 LD50. Кагоцел вводился мышам в дозе 100 мкг/мышь по следующим схемам: 1) 4 суток подряд до заражения вирусом гриппа, 2) однократно за 1 сутки до заражения, 3) однократно через 4 часа после заражения, 4) однократно через 1 сутки после заражения. Определение степени подавления репродукции вируса гриппа в
Клинико-лабораторные методы исследования
Лабораторные методы исследования больных включали клинический анализ крови, анализ мочи, биохимическое исследование крови (активность трансамютаз, билирубин, холестерин, мочевина, общий белок, глюкоза), ЭКГ, биологический метод определения ИФН статуса, иммунофлуоресценцию, иммуноферментный анализ, реакцию торможения гемагглютинации, полимеразную цепную реакцию. При работе с клеточной моделью применялись: метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, реакции гемагглютинациии и торможения гемагглютинации, метод оценки антивирусной активности препарата, метод бдяшкообразования. , Биохимические методы Были использованы для определения показателей активности сывороточных трансаминаз (АЛТ и ACT), билирубина (прямого и непрямого), холестерина, мочевины, общего белка, глюкозы в крови. Исследования проводились автоматизированным биохимическим анализатором «Cobas integra» (Франция). Исследование общего анализа крови проводились гематологическим анализатором «Cobas Micros ОТ-18» (Франция).
Линия клеток МТ-4 — суспензионная перевиваемая культура клеток лимфобластоидного происхождения. Клеточную культуру МТ-4 культивировали в среде RPMI-1640 с 10% сывороткой крови крупного рогатого скота, глутамином и гентамицином. Линия клеток L-41 — перевиваемая культура клеток лимфобластоидного происхождения. До применения в реакции титрования ИФН культуру клеток культивировали в среде Игла с 10% сывороткой крови крупного рогатого скота, глутамином и гентамицином. Культуру клеток Vero полученная из почек африканской зеленой мартышки. Перевиваемую культуру клеток Vero культивировали в ростовой среде Игла, содержащей глютамин, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и бензилпеницилЛИН.
Перевиваемые клетки почек собаки — MDCK. Клеточную культуру MDCK культивировали в среде RPMI-1640 с 10% сывороткой крови крупного рогатого скота, глутамином и гентамицином. Клетки диплоидной культуры фибробластов эмбриона человека — Ml9 были получены из ГУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (Москва). Клетки культивировали в ростовой среде Игла, содержащей глютамин, 10% бычьей сыворотки и бензнлпенициллин.
Клеточные культуры МТ-4, L-41, Vero, MDCK были получены из музея клеточных культур ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (руководитель д.б.н. профессор Подчерняева Р.Я.). В исследованиях использовали вирусы: болезни Ньюкасла, в дозе 10 ИДэо на 1 лейкоцит (любезно предоставлен руководителем лаборатории биосинтеза интерферона ГУ НИИ ЭМ им, Н.Ф. Гамалеи РАМН [проф. В.П. Кузнецовым)). гриппа A/Aichi/1/68(H3N2), титр вируса 1:2560 в реакции ГА с человеческими эритроцитами I группы (любезно предоставлен ведущ. научн. сотр. лаборатории иммунологии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН к.б.н. Исаевой Е.И.). - энцефаломиокардита мышей штамм «Колумбия SK-Col-SK», с титром 107 ТЦДзо, полученный из Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Руководитель д.м.н. профессор Фадеева Л.Л.). - герпеса простого типа 1 (ВПГ-1) штамм Л2 и типа 2 (ВПГ-2) штамм ВН получены из Государственной коллекции музея вирусов ГУ НИИ вирусологии им, Д.И. Ивановского РАМН. Вирусы, устойчивые к действию ацикловира, фосфоноуксусной кислоты, комбинации ацикловира и фосфоноуксусной кислоты получены путем проведения серийного пассирования ВПГ-1 Лг в градиенте концентраций соответствующих препаратов. Множественность инфицирования составляла 0,01 БОЭ/мл. 1.2.4. Препараты
Фитогемагглютинин (ФГА Р, «Difco») — природный митоген. Использовался в дозе от 1 до 10 мкг/мл в зависимости от эксперимента. Индукторы ИФН и иммуномодуляторы: Кагоцел (000 "НИАРМЕДИК ПЛЮС", Москва, Россия) — производное природного полифенола госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, рабочая концентрация 250 мкг/мл. Ридостин (ДГУ ПП "Вектор-фарм", Новосибирск, Россия) — индуктор ИФН представляющий собой двуспиральную РНК, полученную из лизата киллерных дрожжей Saccharamyces cervisiae, рабочая концентрация 1 мг/мл. Циклоферон (НТФФ "Полисан", Санкт-Петербург, Россия) — низкомолекулярный синтетический индуктор ИФН, относящийся к классу акридонов, рабочая концентрация 600 мкг/мл. Саврац — высокомолекулярное соединение природного происхождения, производное ацетилцеллюлозы и окснальдегида (фрагмент полифенола — госсипола, выделяемого из хлопчатника), рабочая концентрация 250 мкг/мл. Препарат проходит доклинические испытания. Полиоксидоний (000 "Иммафарма", Москва, Россия) — синтетический иммуномодулятор с широким диапазоном иммунотропного действия — N-оксидированное производное полиэтиленпиперазина, рабочая концентрация 600 мкг/мл. Препараты ИФН: Человеческий лейкоцитарный ИФН (НПФ "Иитекор", Москва, Россия) — препарат очищенного, концентрированного ИФН синтезируемого в культуре индуцированных донорских лейкоцитов. Лейкинферон (НПФ "Интекор", Москва, Россия) препарат, включающий комплекс цитокинов: ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ФНО-а, МИФ, ЛИФ, выделяемых индуцированными вирусными агентами лейкоцитами. Реаферон (НПО "Вектор", Новосибирск, Россия) препарат рекомбинантного ИФН-сс-2В, Концентрация 10б МЕ/мл. Реальдирон (ЗАО "Биотехна", Литва) препарат рекомбинантного ИФН-а-2В. Концентрация 106 МЕ/мл. Гаммаферон (НПО "Фермент", Рига, Латвия) препарат рекомбинантного ИФН-у. Концентрация 105 МЕ/мл. Препараты природных и рекомбинантных ИФН использовались в реакции праймирования в дозе 10-20 МЕ/мл. Ацикловир (Зовиракс) (GlaxoWellcome, Великобритания) (9-(2-гидроксиэтоксиметил)-гуанин) в виде натриевой соли для внутривенных инъекций, использовался в качестве референс-препарата. Референс-препарат человеческого лейкоцитарного ИФН с известной активностью использовали при каждом титровании ИФН (любезно предоставлен руководителем лаборатории биосинтеза интерферона ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН [проф. В.П. Кузнецовым])
