Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из важнейших и до сих пор мапо исследованных механизмов антимикробной защиты является колонизационная резистентность кожи и слизистых оболочек, под которой понимают устойчивость эпителия к колонизации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами (Бодяжина В.И., 1978; Долгушина В.Ф., 1991; Медведев Б.И., Казачкова Э.А. и др., 2001). Колонизационная резистентность обеспечивается совокупностью разнообразных факторов: на слизистых оболочках это, прежде всего, муцин, образующий достаточно сложноорганизованный биослой. В этот биослой встроены все защитные инструменты: резидентная микрофлора, секреторные антитела, разнообразные бактерицидные молекулы, типа лизо-цима, лактоферрина, токсические метаболиты кислорода, азота и т.д. (тендеров Б.А., Ануфриева Р.Г. и др., 1996; Рязанцев СВ., Хмельницкая Н.М. и др., 2000). До сих пор не ясна роль фагоцитирующих клеток, в частности нейтрофилов (Нф), в защите слизистых оболочек. Нейтрофилы-это, прежде всего, тканевые клетки. Именно в тканях они участвуют в воспалительных и антимикробных реакциях. А вот работают ли они в слизистом биослое — не ясно.
И.И. Долгушиным было высказано предположение, что Нф, мигрирующие на поверхности слизистых оболочек, играют важную роль в их защите (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Покидая ткани и выходя в слизистый биослой, Нф секретируют биоцидные продукты, которые могут участвовать не только в антимикробной защите, но и в регуляции микробиоценозов, заселяющих соответствующие биотопы. Данное предположение и обозначило цель исследования.
Цель исследования
Определить роль нейтрофилов и их секреторных продуктов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек нижнего отдела репродуктивного тракта женщин.
Задачи исследования
Исследовать состояние лейкоцитарного звена цервикального и вагинального секретов здоровых женщин в разные фазы менструального цикла.
Изучить состав растворимых антимикробных факторов цервикального и вагинального секретов здоровых женщин в разные фазы менструального цикла.
Определить in vitro влияние S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-І7), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp, и бактериального комплекса на жизнеспособность, функциональный статус, антимикробную активность и цитокинпродуцируюицую функцию нейтрофилов.
Разработать способ экспресс-обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек.
Изучить in vitro образование внеклеточных ловушек нейтрофила-ми периферической крови после взаимодействия с Е, coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или бактериальной смесью и оценить их эффективность.
Сравнить бактерицидный эффект секреторных продуктов интак-тных и активированных взвесью S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. нейтрофилов.
Установить in vitro влияние нейтрофилов и их секреторных продуктов на состав микрофлоры нижнего отдела генитального тракта и адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинального эпителия здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом.
Научная новизна
В работе дана комплексная оценка состояния факторов врожденного иммунитета слизистых оболочек нижнего отдела генитального тракта здоровых женщин в разные фазы менструального цикла, впервые проведена сравнительная оценка состава растворимых антимикробных факторов, в том числе и катионных пептидов цервикального и вагинального секретов. Показано, что в цервикальном секрете здоровых женщин содержится значительно большая концентрация антимикробных факторов (оксид азота, лактоферрин, дефенсины, БПИ, миелопероксидаза), чем в вагинальном.
Впервые определено влияние S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. и бактериального комплекса на жизнеспособность, функциональный статус, антимикробную активность и цитокинпродуцирующую функцию нейтрофилов периферической крови здоровых женщин. Показано, что представители нормоф-. лоры (лакто- и бифидобактерии) обладают выраженным апоптогенным действием, в меньшей степени стимулируют внутриклеточные киллин-говые системы, не провоцируют выброс провоспалитепьных цитокинов (ИЛ-1сс, ИЛ -1|3, ИЛ-8, ФНО-а, РАИЛ-1 и ИЛ-6), при этом усиливают секрецию бактерицидных белков (БПИ и лактоферрина).
Разработан способ экспресс-обнаружения нейтрофильных ловушек
(Долгушин И.И., Андреева Ю.С. Приоритетная справка от 01.04.2008г. Заявка на изобретение № 2008112636/20 (013666)) и способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах (Долгушин И.И., Андреева Ю.С, Савочкина А.Ю. Приоритетная справка от 26.01.2009г. Заявка на изобретение № 2009102579)
Впервые показано образование внеклеточных ловушек нейтрсфи-лами периферической крови после взаимодействия с Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или бактериальной смесью и оценена их эффективность.
Проведен сравнительный анализ бактерицидности секреторных продуктов интактных и активированных нейтрофилов на Е. coli (штамм М-1'7), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp.
Изучено действие супернатантов интактных и активированных нейтрофилов на состав микробиоценоза и адгезию грибов рода Candida на поверхности вагинального эпителия здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом. Впервые показано, что секреторные продукты нейтрофилов периферической крови обладают селективной бактерицид-ностью: они снижают в вагинальном секрете содержание условно-патогенных бактерий и не влияют на лактофлору, кроме того, супернатанты нейтрофилов здоровых женщин снижают адгезию грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов, у женщин с бактериальным вагинозом продукты секреции нейтрофилов не обладают антиадгезивной активностью.
Впервые определено, что на поверхности слизистых оболочек нейт-рофилы реализуют свой антимикробный потенциал в большей степени за счет внеклеточной секреции компонентов клетки в окружающую среду.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты исследований позволяют расширить представление о роли нейтрофилов в защите слизистых оболочек.
Полученные данные о содержании антимикробных продуктов и ци-токинов в супернатантах неактивированных и активированных нейтрофилов периферической крови, а также продукция нейтрофильных внеклеточных ловушек имеют существенное значение в понимании проблемы регулирующего влияния нейтрофильных гранулоцитов в формировании микробиоценозов слизистых оболочек. Нарушение функционирования нейтрофильного звена на поверхности слизистых оболочек может рассматриваться как один из факторов формирования патологических микробных сообществ и развития дисбактериозов.
Разработка экспресс-метода обнаружения нейтрофильных ловушек открывает возможность оценки антимикробной функции нейтрофилов даже после их гибели, а сам факт наличия внеклеточных нейтрофильных сетей является новым направлением в изучении физиологии грану-лоцита.
Селективная бактерицидность и антиадгезивная активность супер-натантов нейтрофилов открывают перспективу практического применения секреторных продуктов, а результаты исследований могут стать теоретическим обоснованием для проведения клинических испытаний локального использования продуктов секреции нейтрофилов с целью коррекции дисбиотических процессов нижних отделов генитального тракта женщин, повышения качества лечения больных с бактериальным ваги-нозом, что в конечном итоге, позволит снизить заболеваемость у женщин, частоту осложнений беременности и родов, а также перинатальную заболеваемость, смертность и будет способствовать улучшению репродуктивного здоровья и рождению здорового потомства.
Основные положения, выносимые на защиту
В цервикальном и вагинальном секретах содержится значительное количество лейкоцитов, среди которых доминирующими являются нейтрофилы, около 50% из них - это погибшие клетки, а остальные жизнеспособные и функционально активные.
Контакт нейтрофилов с микроорганизмами приводит к гибели гранулоцитов, при этом лактобактерии и бифидобактерии индуцируют апоптотическую гибель нейтрофилов.
Инкубация нейтрофилов in vitro со взвесью бактерий (Е. coli -штамм М-17, S. aureus - штамм 209, Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.) сопровождается секрецией гранулоцитами антимикробных продуктов разного состава: резидентные для слизистых микроорганизмы (лактобактерии и бифидобактерии) в сравнении с факультативными (Е. coli и S. aureus) в большей степени стимулируют выброс антимикробных продуктов, обладающих селективной бактерицидностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам.
Продукты нейтрофилов изменяют состав микробиоценозов слизистых нижнего отдела генитального тракта женщин: они подавляют рост условно-патогенной флоры (гарднерелл, стафилококков, кишечной палочки, протея, дрожжеподобных грибов), препятствуют адгезии грибов рода Кандида на поверхности вагинального эпителия и существенно не влияют на содержание лактобактерии.
5. Нейтрофилы могут участвовать в регуляции микробиоценозов и в формировании колонизационной устойчивости слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии, а также используются в практической деятельности лаборатории противоинфекционного иммунитета НИИ иммунологии ГОУ ВПО «Челябинской государственной медицинской академии» и проблемной лаборатории экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики Южно-Уральского научного центра РАМН.
Издано учебно-методическое пособие «Методы оценки функционального статуса нейтрофилов» для системы послевузовского образования врачей (Челябинск, 2009).
Апробация работы
Основные положения работы доложены и обсуждены на IV, V конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005; Оренбург, 2006); IX - XIII всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург2005,2006,2007,2008, 2009); республиканской научной конференции "Иммунология репродукции" (Иваново, 2005); российской научно-практической конференции "Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия" (Курск, 2006); 1 и 2 международном российско-чешском форуме (Челябинск, 2006, 2008); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2007); на национальной конференции "Аллергология и клиническая иммунология-междисциплинарные проблемы" (Москва, 2008); на объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008, 2009); на конференции, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН (Челябинск, 2008), на VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009), на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).
Работа была поддержана грантами Правительства Челябинской области в 2007 и 2008 гг.
Публикации
По теме диссертации опубликована 51 научная работа. Издана монография «Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов».
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 265 страницах текста, иллюстрирована 50 таблицами, 33 рисунками, 4 фотографиями, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, семи глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 303 источников, втом числе 179 отечественных и 124 зарубежных.
