Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Характеристика герпесвирусов человека и основных клинических проявлений инфекции 14
1.1. Структура и организация вирусного генома 14
1.2. Репродукция вирусных частиц 17
1.3. Основные клинические формы герпесвирусных инфекций 19
1.4. Герпесвирусные инфекции в неонатологии и педиатрии 21
Глава 2. Методы лабораторной диагностики герпесвирусной инфекции 24
2.1. Электронная микроскопия 24
2.2. Цитологический метод 25
2.3. Серологические методы 25
2.3.1. Иммунофлюоресцентный метод 25
2.3.2. Иммуноферментный метод 26
2.4. Вирусологический метод 27
2.5. Молекулярно-биологические методы 29
2.5.1. Мультипраймерная ГЩР 29
2.5.2. ПЦР в режиме реального времени 31
2.5.3. ПЦР in situ 33
2.6. Заключение 36
Собственные исследования
Глава 3. Материалы и методы исследования 38
3.1. Быстрый культуральный метод 38
3.2. Серологические методы диагностики 42
3.2.1. Твердофазный иммуноферментный анализ 42
3.2.2. Авидность антител 42
3.2.3. Реакция иммунопреципитации 42
3.3. Молекулярно-генетические методы 43
3.3.1. Полимеразная цепная реакция 43
3.3.2. Проведение мультипраймерной ПЦР 44
3.3.3. Проведение ПЦР в режиме реального времени 47
3.3.4. Проведение ПЦР in situ 55
3.4. Статистическая обработка данных 58
Глава 4. Результаты и обсуждение исследований 59
4.1. Разработка и сравнительный анализ молекулярно-генетических методов диагностики герпесвирусов 59
4.1.1. Мультипраймерная ПЦР 59
4.1.2. Сравнение методов пробоподготовки и эффективности выделения нуклеиновых кислот из различных клинических образцов 62
4.1.3. ПЦР в режиме реального времени 64
4.1.4. Модифицированный методом ПЦР in situ 66
4.1.4.1. Выявление ДНК вируса простого герпеса методом ПЦР in situ 66
4.1.4.2. Сравнительный анализ выявления вируса простого герпеса и цитомегалоаируса в материалах аутопсии 69
4.2. Выявление прямых и серологических маркеров вируса простого герпеса и цитомегалоаируса у новорожденных детей с подозрением на внутриутробную инфекцию 73
4.2.1. Сравнительный анализ методов диагностики прямых маркеров вируса простого герпеса и цитомегалоаируса у новорожденных детей с подозрением на внутриутробную инфекцию 73
4.2.2. Динамика выявления прямых маркеров вируса простого герпеса и цитомегаловируса у новорожденных детей в течение первого года жизни 76
4.2.3. Изучение параметров гуморального иммунитета у новорожденных детей в сыворотке крови серологическими методами 78
4.3. Разработка алгоритма лабораторной диагностики врожденной цитомегаловирусной инфекции у детей с клиническими признаками внутриутробного инфицирования 80
4.3.1. Определение прямых и серологических маркеров цитомегаловирусной инфекции у детей в неонатальном периоде 81
4.3.1.1. Частота выявления цитомегаловируса у новорожденных детей разных групп исследования на первых неделях жизни ПЦР и быстрым культуральным методом 81
4.3.1.2. Сравнительный анализ выявления цитомегаловируса у обследованных новорожденных детей на первых неделях жизни быстрым культуральным методом 83
4.3.1.3. Изучение показателей иммунитета у новорожденных детей разных групп на первых неделях жизни 83
4.3.2. Частота выявления цитомегаловируса у новорожденных детей на протяжении первого года жизни 86
4.3.2.1. Сравнительный анализ частоты выявления прямых маркеров цитомегаловируса в различных клинических образцах 86
4.3.2.2. Сравнительный анализ частоты выявления цитомегаловируса в клинических образцах методом ПЦР и быстрым культуральным методом 89
4.3.2.3. Изучение прямых маркеров цитомегаловируса у недоношенных новорожденных детей с внутриутробным инфицированием в динамике 90
4.3.2.4. Сравнительный анализ выявления маркеров цитомегаловируса серологическими и прямыми методами у недоношенных новорожденных детей с внутриутробным инфицированием на протяжении первого года жизни 93
4.4. Сравнительный анализ диагностики герпесвирусов с использованием ПЦР и быстрого культурального метода 95
4.4.1. Сравнительный анализ эффективности ПЦР и быстрого культурального метода при исследовании цельной крови новорожденных детей на присутствие вируса простого герпеса 1 и 2 типов 95
4.4.2. Сравнительный анализ чувствительности выявления вируса простого герпеса в культуре клеток двумя лабораторными методами - ПЦР и быстрым культуральным методом 97
Выводы 98
Практические рекомендации 99
Список литературы 100
- Основные клинические формы герпесвирусных инфекций
- Проведение ПЦР в режиме реального времени
- Выявление ДНК вируса простого герпеса методом ПЦР in situ
- Изучение прямых маркеров цитомегаловируса у недоношенных новорожденных детей с внутриутробным инфицированием в динамике
Введение к работе
Актуальность проблемы. Герпесвирусная инфекция представлена группой ДНК-вирусов, широко распространенных в человеческой популяции. Наиболее существенное социальное и эпидемиологическое значение имеют вирусы простого герпеса (ВПГ); цитомегаловирус (ЦМВ) и вирус Эпштейн-Барра (ЭБВ). Существование передачи герпесвирусов от матери к ребёнку определяет одно из ведущих мест этих инфекций в перинатальной патологии и смертности [Пенкина Н.И. с соавг.,2000; Сухих Г.Т., 2003]. Как показали исследования, [Фёдорова Н.Е. и соавт.,2005], отрицательный результат обследования крови и мочи, полученный в первые дни жизни ребёнка, не исключает возможности отсроченной реализации внутриутробной инфекции, а недоношенные новорожденные дети представляют группу высокого риска по развитию цитомегаловирусной инфекции [Yamamoto A.Y. et al., 2001].
Принятые способы диагностики герпесвирусной инфекции - выявление антигенов при помощи иммунохимического анализа и специфических антител различными серологическими тестами являются лишь косвенным свидетельством активности инфекционного процесса. Для понимания этиологии, выявления стадии развития процесса необходимо располагать сведениями о наличии или отсутствии герпесвирусов или их антигенов. Прямое определение вируса путем его изоляции в культуре клеток требует специальных условий и длительно по времени. Разработка и практическое применение современных молекулярно-генетических технологий для выявления и количественной оценки содержания герпесвирусов является актуальной, так как позволит оперативно провести прямое определение присутствия, оценки количества и локализации герпесвирусов в различных клинических образцах для правильной и быстрой постановки диагноза и проведения мониторинга лекарственной терапии. Из молекулярно-генетических технологий наиболее перспективными являются амплификационные методы, в частности, полиме-разная цепная реакция (ПЦР) и ее разновидности.
Цель работы - разработка и клиническая апробация молекулярно-генетических технологий для диагностики герпесвирусных инфекций и сравнительная оценка их возможностей с традиционными методами.
Задачи исследования.
-
Разработка и клиническая апробация набора реагентов мультипрай-мерной ПЦР для одновременного выявления ДНК вируса простого герпеса, цитомегаловируса и вируса Эпштейн-Барра в одной пробе.
-
Оптимизация компонентов реакции и клиническая апробация наборов реагентов для определения ДНК вируса простого герпеса и цитомегаловируса методами ПЦР in situ и ПЦР в режиме реального времени для оценки вирусной нагрузки.
-
Проведение сравнительного анализа возможностей и характеристик ПЦР технологий, иммуноферментного и быстрого культурального методов.
-
Оценка динамики изменения маркеров цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни, находящихся в отделениях реанимации и интенсивной терапии.
-
Поиск неинвазивного клинического материала для выявления внутриутробной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей.
Научная новизна.
-
Проведена разработка, оптимизация компонентов и условий проведения реакций для мультипраймерного ПЦР, ПЦР in situ и ПЦР в режиме реального времени для диагностики герпесвирусных инфекций и последующая клиническая апробация наборов.
-
Впервые разработан и практически использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции на основании использования молекулярно-генетических и вирусологических методов для выявления герпесвирусной инфекции.
3. Проведен сравнительный анализ разработанных молекулярно-
генетических методов с традиционными, включающими иммуноферментный
анализ и вирусологическое исследование быстрым культуральным методом.
-
Показаны возможности количественной оценки вирусной нагрузки методом ПЦР в режиме реального времени.
-
Проведена апробация модифицированного метода ПЦР in situ для выявления ДНК ВПГ, ДНК ЦМВ и сравнительный анализ данной модификации с быстрым культуральным методом и стандартной ПЦР.
Практическая значимость.
-
Использование быстрых, высокочувствительных и высокоспецифич-ных ПЦР-технологий дает возможность оперативной постановки диагноза, выявления внутриклеточной локализации инфекционного агента и количественной оценки вирусной нагрузки, что особенно важно для неонатологиче-ской и педиатрической практики.
-
Лабораторный скрининг прямых маркеров герпесвирусных инфекций недоношенных новорожденных детей предпочтительнее проводить по моче, так как в ней вирусные частицы накапливаются в больших количествах, а получение биологического материала проводится неинвазивным способом.
-
Для постановки лабораторного диагноза внутриутробного инфицирования герпесвирусной инфекцией у недоношенных новорожденных детей и детей раннего возраста наиболее оптимальным является сочетание ПЦР и быстрого культуралыюго методов. Серологические тесты применяются в качестве дополнительных для уточнения фазы течения заболевания.
-
Использование современных молекулярно-генетических технологий в диагностике герпесвирусных инфекций новорожденных в неонатальном периоде позволяет найти этиологическое объяснение причин врожденных дефектов и снизить смертность детей в раннем возрасте.
5. Внедрение в практику предложенного алгоритма лабораторной диагностики цитомегаловируса у недоношенных новорожденных детей позволит быстро установить диагноз и уменьшить количество осложнений.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Отечественный мультипраймерный набор для ПЦР-анализа с одновременным выявлением ДНК вирусов простого герпеса, Эпштейн-Барра и цитомегаловируса перспективен для проведения скрининговых обследований населения.
-
Метод ПЦР in situ по чувствительности не уступает стандартному ПЦР, а использование указанной технологии наиболее целесообразно для изучения патогенеза инфекции и установления внутриклеточной локализации вирусной ДНК.
-
Определение количества ДНК ВПГ и ДНК ЦМВ с использованием метода ПЦР в режиме реального времени позволяет проводить оценку вирусной нагрузки и осуществлять выбор адекватной лекарственной терапии.
-
Маркеры цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей с сочетанной врожденной патологией выявляются достоверно чаще, чем у доношенных новорожденных. Проведение трехкратного вирусологического обследования на наличие цитомегаловирусной инфекции в разные сроки первого года жизни повышает эффективность диагностики.
-
Молекулярно-генетические, вирусологические и серологические методы диагностики герпесвирусных инфекций у недоношенных новорождённых детей рационально применять комплексно согласно разработанному алгоритму.
Внедрение результатов исследования.
Полученные результаты используются в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ № 8 и ДГКБ № 13 г. Москвы. Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и прак-
тических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ, кафедры неонатологии ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ, аспирантов и ординаторов кафедры кожных и венерических болезней РУДЫ.
Апробация работы.
Апробация диссертационной работы состоялась 28 февраля 2011 года на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ и отдела разработки лабораторных технологий ГБОУ ВПО РНИМУ.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций, 4 - в сборниках конгрессов и форумов. Результаты работы докладывались на 1 Национальной конференции «Нейроинфекции» с международным участием, 2007; VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», 2007; VI Российском конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилакти-ки у детей», 2007; па VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», 2007; на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации», Москва, 2007; на X Всероссийском съезде дерматовенерологов, 2008; на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии, Финляндия, 2008.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы с изложением результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 69 отечественных и 127 иностранных источников. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 20 рисунками.
Основные клинические формы герпесвирусных инфекций
Клинические проявления, характер течения герпесвирусной инфекции разнообразны и зависят от ряда факторов [27,28,47]. В таблице 1 представлены основные клинические формы герпесвирусных инфекций [36].
Уникальными биологическими свойствами всех герпесвирусов человека являются тканевой тропизм, способность к персистенции и латенции в организме инфицированного человека. Штаммы герпесвирусов обладают неодинаковой способностью к персистенции и латенции, чувствительностью к противогерпетическим препаратам в связи с особенностями их ферментных систем. Известны шесть генотипов ЭБВ поразному представленных в различных географических областях [118]. У каждого герпесвируса имеется свой темп персистенции и латенции: наиболее активны в этом отношении - БПГ, наименее - ЭБВ [11]. Герпесвирусы способны поражать практически все органы и системы организма-хозяина, вызывая различные формы течения инфекции.
По данным многочисленных исследований [11,142] к 18 годам более 90% жителей городов инфицируются одним или несколькими вирусами, по меньшей мере 7-ю клинически значимыми герпесвирусами (ВПГ 1 и 2-го типов, ВЗВ, ЦМВ, ЭБВ, вирус герпеса человека 6 и 8-го типов), что сопровождается клиническими симптомами соответствующего острого инфекционного заболевания в среднем не более чем у 50% людей: детская эритема (вирус герпеса человека 6-го типа), афтозный стоматит (ВПГ 1 или 2-го типов), ветряная оспа (ВЗВ), инфекционный мононуклеоз (ЭБВ), мононуклеозоподобный синдром (ЦМВ). В последнее время с герпесвирусами связывают атеросклероз и ишемическую болезнь сердца, ревматоидный артрит и рассеянный склероз. Так, например, ВПГ-1 и ЦМВ обладают тропностью к тканям сердечно-сосудистой системы, что неоднократно подтверждалось отечественными исследователями определением ДНК этих вирусов в крови и материале атеросклеротических бляшек всех обследованных пациентов с ишимической болезнью сердца [45].
Все известные ГВИ могут рецидивировать, однако, порог и причины трансформации острой формы в рецедивирующую для каждого типа герпесвируса свои. Так, например, рецидивирование инфекций, вызванных ВПГ, нередко наблюдается на фоне стрессов, неспецифических эндокринных нарушений, изменения географической зоны проживания, гиперинсоляции и др. Субклинические рецидивы ЦМВИ чаще всего наблюдаются у беременных и больных, получающих иммуносупрессорную терапию. В то же время инфекции, вызванные ЭБВ, рецидивируют крайне редко и только у больных с врожденным или приобретенным иммунодефицитом. В целом ГВИ принимают рецидивирующее течение не более чем у 8-20% больных.
Наибольшее распространение и социальную значимость получил рецидивирующий генитальный герпес [22,36,50,86,142] - одна из наиболее часто встречающихся инфекций передающихся половым путем (ШИН). Проблема диагностики рецидивирующего генитального герпеса осложняется тем, что у женщин почти в 65% случаев заболевание протекает атипично. По данным зарубежных и отечественных исследователей часто рецидивирующий генитальный герпес наблюдается у 50-75% больных, а редко рецидивирующий -только у 10% [50,74,86]. Генитальная локализация герпеса у беременных встречается в 7-35 % случаев и за последние годы этот показатель постоянно увеличивается [53]. Вне сомнения ГВИ у беременных женщин создаёт прямой и серьёзный риск для плода и новорожденного, является одной из причин развития неврологических соматических и эндокринных проблем у новорожденных и детей старшего возраста [3,35,58,127,128,136,140].
Проведение ПЦР в режиме реального времени
В качестве мишеней для ПЦР-диагностики ГВИ используют различные участки вирусного генома такие как: сверхранний регион (IE); ранние (Е) гены, кодирующие ДНК-полимеразу, тимидинкиназу (ТК); поздние (L) гены, кодирующие белки гликопротеины gB, gC, gD. Нам представлялось перспективным создание праймеров фланкирующих участки генов гликопротеинов. ПНР РВ для качественного и количественного определения ДНК ВПГ 1,2 и ЦМВ проводили с помощью наборов «HSVl,2-PB-KOJIH4ECTBO» и «CMV-PB-КОЛИЧЕСТВО», разработанных совместно с фирмой «Синтол».
В качестве мишени для определения ДНК ВПГ 1,2 типа был выбран ген UL 27 гликопротеина В, так как он наиболее часто используется для определения и дифференциации ГВ. Ген гликопротеина В имеет консервативные и дивергентные домены. Консервативная для всех а-герпесвирусов последовательность домена С1 расположена в пределах 300-1500 н.п. Для подбора праймеров способных выявлять оба типа вируса ВПГ, был проведен дополнительный сравнительный анализ последовательностей гена UL 27. Последовательность ВПГ 1 типа приведена для штамма MP-R15 (GenBank Accession № EF177455). Последовательность ВПГ 2 типа приведена для штамма OGM-890 (GenBank Accession № АВ442016). Сравнительный анализ проведен с помощью программы CLUSTAL W Интернет-ресурса Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ).
Праймеры были подобраны вручную на участок, где оба типа вируса имеют идентичную последовательность. Размер продукта 173 н.п.
HSVup: 5 - CATCGCGGTGGTCTTCAAGGAGA Та=67 С
HSVlow: 5 - ТСТ TGT CGA ТСА ССТ ССТ CGA А Та=62С
ДНК ВПГ 1,2 используется зонд, меченный красителем R6G. Pb HSV R6G: AGC GGT GGC CGA АСС АСА ССТ GCG А Та=74С
Выбранные последовательности были проанализированы с помощью программы OligoCalc для оптимизации температуры отжига праймеров и зонда и устранения участков возможной самокомплиментарности последовательностей праймеров, т.о. снижая риск образования праймер-димеров и истощения пула праймеров в ходе реакции.
Для анализа наличия в исследуемой пробе ДНК ЦМВ методом ПЦР РВ был выбран фрагмент гена UL 13. Гликопротеин В входит в состав оболочки вируса и является консервативным доменом для всех штаммов ЦМВ. Ниже приведена последовательность гена UL13 штамма AD 169. С помощью программы Primer 3 были выбраны подходящие по длине и температуре отжига последовательности праймеров и зонда. Далее они были дополнительно проанализированы в программах OligoCalc и Oligo, дающих представление о термодинамических характеристиках олигонуклеотидов в условиях, приближенных к реакционным (концентрация солей, ионов магния, дезоксинуклеотидтрифосфатов), а так же информацию о возможной само- или взаимокомплиментарности праймеров, возможности образования вторичных структур, так называемых «шпилек», что является негативным фактором для ПЦР.
Праймеры:
CMV-338up 5 - GAC AAG AAA ТТС AAC GCA САС ТСА АС
CMV-4371ow 5 - TTC CCG CAT TAT TCC TTC TСТ TCT CG
Зонд:
PB CMV-4371ow R6G: R6G- 5 - TCG CGC ССТ СТС TCG AAA CGT ССТ -BHQ2
Амплифицируемый фрагмент 122 н.п.
Расчетная температура отжига праймеров - 65С, а зонда - 71С.
В качестве маркерного гена, по которому можно было бы оценивать относительное количество вирусной нагрузки, приводимой на 10 клеток человека, был взят ген Ь-актина человека. Ь-актин является высококонсервативным, конститутивно экспрессируемым геном человеческого генома, поэтому он наиболее часто берется в качестве маркерного для исследований методом ПЦР. По количеству копий гена Ь-актина можно судить о приблизительной эффективности выделения ДНК из клеток образцов ВАСТ up: 5 -AGG CCA АСС GCG AGA AGA TGA C, BACT low: 5 - AGT GGT AGG GCC AGA GGC GTA, Pb BACT up FAM: 5 GA GAC GTT CAA CAC CCC AGG CAT G-BHQl. Подбор и анализ праймеров проводили, как описывалось ранее. Длина фрагмента 109 н.п. Температура отжига праймеров 65С, а зонда- 71 С Внутренний положительный контроль (ВПК) - плазмидная ДНК в большом разведении. Служит для определения рабочего состояния системы, сохранности всех реактивов, а так же несет информацию о присутствии ингибиторов в анализируемом образце.
Праймеры и зонд для внутреннего контроля, плазмида р1РС2.
IPCsyntZF: 5 - GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG Т
IPCsyntZR: 5 - CАА CCG CCA ACT TAT CCA GCA
IPCsyntZ Cy5: 5 - Cy5 - GGA TGT TTC CCA GAG ATG GGT TGC GGC-BHQ2
Амплификацию проводили с использованием отечественного анализатора нуклеиновых кислот «АПК», разработанного институтом аналитического приборостроения РАН (Санкт-Петербург).
В наборе используются три независимых реакций, которые проводятся в одной пробирке одновременно.
Первая реакция позволяет обнаружить и определить количество специфического фрагмента ДНК (ВПГ 1,2 или ЦМВ). Наличие положительной динамики изменения флуоресценции по отношению к отрицательному контролю для этой реакции говорит о наличии в образце ДНК искомого организма. Сопоставление с динамикой изменения флуоресценции калибровочных образцов путем анализа полученных кинетических кривых позволяет оценить исходное количество микроорганизма в пробе. Для обнаружения ДНК ВПГ 1,2 и ЦМВ используется зонд, меченный красителем R6G. Чувствительность набора реагентов - не менее 50 копий ДНК в пробе. Диапазон количественного определения составляет от 10 до 10 копий ДНК (или геномэкв./мл) в пробе.
Вторая реакция позволяет обнаружить и определить количество специфического фрагмента гена Ь-глобина ДНК человека. Наличие положительной динамики изменения флуоресценции по отношению к отрицательному контролю для этой реакции говорит о наличии в образце ДНК человека. Сопоставление с динамикой изменения флуоресценции калибровочных образцов путем анализа полученных кинетических кривых позволяет оценить исходное количество ДНК человека в пробе. Для обнаружения и определения количества ДНК Ь-глобина используется зонд, меченный красителем FAM. Чувствительность набора реагентов - не менее 50 копий ДНК в пробе. Диапазон количественного определения составляет от 10 до 107 копий ДНК в пробе.
Данная реакция позволяет оценить количество выделенной ДНК человека из клинических образцов и исключить недостоверные отрицательные результаты в случае отсутствия положительной динамики изменения флуоресценции по первой реакции (на наличие ДНК ВПГ 1,2 или ДНК ЦМВ). Сопоставление количества ДНК ВПГ 1,2 (ЦМВ) и количества ДНК Ь-глобина человека позволяет оценить количественную вирусную нагрузку в клиническом материале человека.
Третья реакция позволяет обнаружить ДНК внутреннего положительного контроля (ВПК) и исключить недостоверные результаты. Положительная динамика изменения флуоресценции по этой реакции в случае отсутствия положительной динамики по первой и второй реакции подтверждает отсутствие специфических фрагментов ДНК ВПГ 1,2 (ДНК ЦМВ) и ДНК человека в пробе.
Отсутствие положительной динамики изменения флуоресценции по всем трем реакциям свидетельствует об ингибировании ПЦР, что позволяет исключить недостоверный отрицательный результат. Для обнаружения ДНК ВПК используется зонд, меченный красителем Су5.
Выявление ДНК вируса простого герпеса методом ПЦР in situ
Была проведена серия экспериментов с целью сравнения эффективности использования двух пар праймеров для ВПГ отдельно и в смеси. Показано, что количество клеток содержащих метку на зараженных препаратах было приблизительно одинаковым, и интенсивность окрашивания положительных клеток также не различалась. На рисунке 11 представлены препараты после проведения ПЦР in situ двумя различными парами праймеров (А, Б). При использовании смеси из двух пар праймеров наблюдалось более интенсивное окрашивание клеток и при подсчете количества меченых клеток, их оказалось больше, чем при использовании одной пары праймеров (рис. 11 В). В качестве отрицательных контролей применяли препараты культуры клеток не зараженные вирусом. При проведении ПЦР на препаратах отрицательных клеток в ПЦР смеси также были использованы различные праймеры и смесь из двух праймеров.
Для проверки специфичности сигнала в отношении ВПГ при амплификации были использованы две пары праймеров, меченные биотипом и направленные к консервативному участку гена ДНК-полимеразы ВПГ 1, 2 типов:
1. ВПГ 1,2 типов (461 п.н.)
ttc aag gcc асе atg tac tac aaa gac gt gcc gta aaa cgg gga cat gta cae aaa gt
2. ВПГ 1,2 типов (220 п.н.)
egg agg gca teg egg tgg tct tea agg aga ttg cgc acg tac ttg gcc gtg gac cga cag a
В результате проведенных опытов было показано, что количество клеток содержащих метку на зараженных препаратах было приблизительно одинаковым, и интенсивность окрашивания положительных клеток также не различалась.
Появление в последние годы высокочувствительных методов диагностики (реакции иммунофлуоресценции, амплификационные технологии) позволили выявлять значительную группу пациентов с атипичными бессимптомными формами ГВИ, причем ВПГ часто выделяют из биологических жидкостей и тканей предстательной железы, семенных пузырьков и яичек, а также в сперматозоидах мужчин. Исследовали 48 проб эякулятов, в 14 из которых (29%) ВПГ был обнаружен, как методом ГЩР, так и БКМ, что совпадает с результатами других авторов [94]. Восемь проб, положительных по данным обоих методов, были разведены в 5 и 50 раз и повторно изучены в ГЩР и БКМ. При использовании БКМ положительными оказались 4 пробы в обоих разведениях, тогда как в ПЦР положительными были 2 пробы в разведении 1/50 и 3 пробы в разведении 1/5. Одним из возможных объяснений ложноотрицательных результатов ПЦР могло быть присутствие в эякулятах ингибитора(ов) Taq-полимеразы.
Модифицированный метод ПЦР in situ вначале отрабатывался для выявления ДНК ВПГ непосредственно в клетках эякулятов (в сперматозоидах). Для анализа использовались фиксированные препараты клеток эякулятов от пациентов с проблемами фертильности и идиопатическим бесплодием. Сравнительный анализ чувствительности трёх методов (ПЦР с электрофоретической детекцией, ПЦР in situ и БКМ) для выявления ВПГ в эякулятах был проведен у 32 мужчин, страдающих бесплодием. Методом БКМ ВПГ был выявлен в 17 пробах, ДНК ВПГ в ПЦР in situ была обнаружена в 10 пробах, а в стандартной ПЦР - только в 6 пробах. Все положительные пробы в стандартной ПЦР совпали с положительными образцами в БКМ и ПЦР in situ. В 7 случаях пробы были положительными двумя методами - БКМ и ПЦР in situ. Так как для исследования БКМ брали общую фракцию (сперматозоиды и семенная жидкость), а для ПЦР in situ только сперматозоиды, то выявление 10 дополнительных положительных проб БКМ можно объяснить наличием вирусных частиц в семенной жидкости. Три пробы дали положительные результаты в ПЦР in situ, но отрицательные - БКМ, что, вероятно указывает на большую чувствительность метода ПЦР in situ.
Установлено, что в период новорожденности диагностируется только 15-20% врожденной патологии [101,110,123]. Признаки врожденной патологии могут проявляться как на первом году жизни, так и в более позднем возрасте, а уКвЇЇГнои отсталости иногда становятся очевидными только в дошкольном или школьном возрасте. Использование современных молекулярно-биологических, электронно-микроскопических и культуральных методов лабораторной диагностики пока не нашло широкого распространения в практическом здравоохранении для установления посмертного диагноза. В связи с этим одним из направлений работы явилось комплексное вирусологическое и молекулярно-биологическое исследование для выявления ГВИ в случаях мертворождения.
Проведено сравнение эффективности выявления ВПГ и ЦМВ методом ПЦР in situ и традиционными лабораторными методами. Патологоанатомические исследования проводились на базе Морозовской детской городской клинической больницы г.Москвы. Методами ПЦР, ПЦР in situ, РИФ и БКМ проведен анализ материалов (п=147) аутопсии мертворожденных, у которых кроме диагноза: анте -или интранатальная асфиксия, в окончательном заключении после проведения патологоанатомического и вирусологического исследований в качестве основного, конкурирующего, сопутствующего или фонового заболевания указывалась врожденная генерализованная ВУИ и/ или множественные врожденные пороки развития (МВПР).
Результаты выявления ВПГ и ЦМВ четырьмя методами лабораторной диагностики в одних и тех же аутопсийных образцах от мертворожденных представлены в таблице 8.
Изучение прямых маркеров цитомегаловируса у недоношенных новорожденных детей с внутриутробным инфицированием в динамике
Из 107 ННД 1-й группы, первично обследованных на 1-й неделе жизни, клинические материалы 26 детей были изучены в динамике трижды. Повторные обследования проводили через 1-3 и 5-7 месяцев после рождения. Результаты обследования ННД с признаками ВУИ в динамике представлены в таблице 14. На 1-й неделе жизни прямые маркеры ЦМВ (положительный анализ БКМ и/или ПЦР) были обнаружены у 9 из 26 детей (34,6%). При выявлении инфекционного ЦМВ методом БКМ вирусная нагрузка составила 10-15 вирусных частиц в 1 мл клинического материала. При повторном обследовании детей через 1-3 месяца после рождения у 7 из 9 (77,7%) )ервично онфицировонных хедей йивус обнаружен не был, у 2 детей ЦМВ был выявлен повторно (22,2%). Можно предположить, что отсутствие обнаружения вируса у ННД с внутриутробной ЦМВИ явилось результатом проведения комплексной этиотропной, посиндромной и иммуномодулирующей терапии в отделениях реанимации новорожденных. Возможно, отсутствие ЦМВ является следствием сочетанного действия терапии и активации собственного гуморального и клеточного противовирусного иммунного ответа у повторно обследованных детей.
Важно отметить, что у 5 из 17 (29,4%) детей, отрицательных по ПЦР и БКМ на 1-й неделе жизни, через 1-3 месяца после рождения ЦМВ был обнаружен впервые. При этом у 3 из 5 детей, у которых был выявлен ЦМВ методом БКМ, в указанное время была обнаружена высокая вирусная нагрузка, которая варьировала от 1000 до 200000 вирусных частиц в 1 мл пробы. Методом ПЦР РВ - от 2,3x10 до 6,3x10 геномэкв./мл. У 2 из 5 детей была обнаружена только ДНК ЦМВ в количестве 10 и 100 геномэкв./мл.
Примечание: пустые ячейки означают отсутствие прямых маркеров ЦМВИ. Возможно, выявление ЦМВ у части детей через 1-3 месяца является отсроченным проявлением внутриутробной бессимптомной ЦМВИ. Не исключено также, что инфицирование этих новорожденных ЦМВ произошло уже в неонатальном периоде, в частности, при гемотрансфузиях или при вскармливании младенцев инфицированным грудным молоком. Такие дети нуждаются в дальнейшем обследовании, поскольку ЦМВИ часто выявляется, а иногда и служит причиной гибели детей во втором полугодии жизни [55]. Всего в возрасте 1-3 месяцев у 7 из 26 детей были найдены прямые маркеры ЦМВИ (27%). Интересно отметить, что данный показатель был близок к частоте выявления прямых маркеров вируса у детей с ВУИ 4-й группы при их первичном обследовании, когда они находились в таком же возрасте (табл. 11).
Через 5-7 месяцев после рождения у одного из 7 детей (14,3%), у которых в возрасте 1-3 месяцев выявлялись прямые маркеры ЦМВИ, вирус не найден. У остальных 6 детей (85,7%) ЦМВ продолжал определяться. Важно отметить, что в эти сроки ещё у 3 детей (17,6%о) с ВУИ при рождении впервые появились прямые маркеры ЦМВ.
Через 12-18 месяцев жизни у 9 из 26 детей (34,6%) в клинических материалах продолжал присутствовать ЦМВ.
Из групп доношенных и недоношенных НД без ВУИ повторно были обследованы 15 детей через 7-12 месяцев после рождения. У одного ребёнка, в моче, спустя 8 месяцев после первичного обследования был обнаружен вирус БКМ (5000 вирусных частиц в 1 мл). ДНК ЦМВ была выявлена у 5 из 15 детей (33,3%), однако ПЦР РВ показала, что количество ДНК ЦМВ в пробах было низким (5-Ю геномэкв./мл).
Таким образом, на 1-м году жизни из 26 обследованных в динамике ННД с клиническими признаками ВУИ у 17 детей (65,4%) в различные сроки были выявлены прямые маркеры ЦМВИ. Это согласуется с результатами других исследований [193], подтверждающими высокий риск развития ЦМВИ у этой группы НД (рис.20А). За время проведения исследования в первой группе отмечены 12 летальных исходов (11,2%), в 7 случаях из 12 были выявлены прямые маркеры ЦМВИ (58,3%), В контрольной группе летальных исходов не было.
