Введение к работе
Актуальность проблемы
Урогенитальный трихомониаз (УТ) – широко распространенная инфекция, передаваемая половым путем, возбудителем которой является Trichomonas vaginalis – простейший одноклеточный микроорганизм, приспособившийся в процессе эволюции к паразитированию в органах мочеполовой системы человека. По данным официальной статистики, трихомониаз имеет наибольшую долю в структуре заболеваемости ИППП. В 2008 году его доля составила 38,9% из всех зарегистрированных случаев заболеваний инфекциями, передаваемыми половым путем (Иванова М.А., 2009). У женщин в воспалительный процесс могут вовлекаться вульва, влагалище, уретра, парауретральные протоки, шейка матки, матка и ее придатки, большие вестибулярные железы, мочевой пузырь, почечная лоханка; у мужчин – уретра, предстательная железа, семенные пузырьки, мочевой пузырь, почечные лоханки. Для трихомониаза, как и для других ИППП, в большинстве случаев характерно отсутствие специфических признаков заболевания, а у значительного числа пациентов инфекция протекает бессимптомно. Классический для трихомониаза “клубничный” симптом встречается только у 2% пациенток; пенистые выделения, которые можно связать с активным ростом трихомонад, наблюдаются только примерно у 12% инфицированных женщин (Fouts A.C., et al. 1980). Кроме того, часто трихомониаз сочетается с другими ИППП: гонореей, хламидиозом, микоплазмами, что объясняется общностью путей передачи инфекции (Щербакова Н.И., 1982; Делекторский В.В., 1985; Межевитинова, 1999).
В связи с неспецифическими клиническими проявлениями диагноз трихомонадной инфекции основывается на результатах лабораторных методов исследования, которые включают микроскопические, культуральные, серологические и молекулярно-биологические.
Согласно приказу Минздрава СССР № 1570 от 4 декабря 1986 г регламентированными методами диагностики трихомониаза считались микроскопия (нативного или окрашенного) препаратов и культуральное исследование. Несмотря на то, что приказом Минздрава РФ №398 от 23.12.2003 г приказ № 1570 от 4 декабря 1986 г. был признан не действующим, в нашей стране наиболее часто для диагностики трихомонадной инфекции используется метод микроскопии, что объясняется его относительно низкой стоимостью и быстротой исполнения (Фриго Н.В., с соавт., 2008). Тем не менее, данный метод недостаточно чувствителен и воспроизводим, субъективен и требует высокой квалификации исполнителя.
Культуральный метод долгое время рассматривался в качестве «золотого стандарта» диагностики трихомонадной инфекции. Но его эффективность в значительной степени зависит от качества используемых питательных сред. Ограничивают его применение также большие сроки получения результата анализа, вплоть до 11-17 суток после посева, т.к. длительность цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от посевной дозы. Кроме того, культуральный метод имеет высокие требования к транспортировке и хранению клинического материала.
В последние годы во всем мире в лабораторной диагностике различных инфекций, в том числе ИППП, все большее распространение стали получать методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), направленные на выявление специфических фрагментов ДНК или РНК возбудителей. Одним из наиболее распространенных МАНК является метод ПЦР. Преимуществами данного метода являются высокие аналитические и диагностические показатели чувствительности и специфичности, менее строгие требования к хранению и транспортировке клинического материала, короткие сроки исполнения, относительно невысокая стоимость анализа и его универсальность в отношении других урогенитальных инфекций.
Согласно рекомендациям Центра по контролю и профилактике заболеваемости (CDC – Centers for Disease Control and Prevention) в связи с более высокой аналитической чувствительностью амплификационных методов верификацию их результатов следует проводить на основе альтернативных амплификационных тестов (CDC, 2002). В своей работе A.J. McAdam предложил требования, которым должен соответствовать дополнительный метод для решения вопросов, связанных с дискордантными результатами: аналитическая чувствительность дополнительного метода должна быть сопоставима с исследуемым методом; должна использоваться отличная мишень для амплификации; должен использоваться другой принцип амплификации (McAdam A.J., 2000).
Одним из методов, соответствующих требованиям, предложенным McAdam, является метод определения рибосомальной РНК (рРНК) на основе реакции транскрипционной амплификации (Transcription-Mediated Amplification – TMA). На основе данного метода за рубежом применяется серийно выпускаемый тест для диагностики инфекции, вызванной T.vaginalis – APTIMA Trichomonas vaginalis Assay (Gen-Probe Inc., San Diego, CA). Данный тест имеет высокие показатели диагностической чувствительности не только по сравнению с методами микроскопии и микробиологического посева, но и в сравнении с ПЦР (Hardick A., et al., 2006; Nye M.B., et al., 2009; Andrea S.B., et al., 2011). Аналогом TMA является реакция транскрипционной амплификации НАСБА (Nucleic acid sequence-based amplification – NASBA). В работе Morre S.A. и соавт. на примере C.trachomatis была показана возможность с помощью метода НАСБА оценивать наличие жизнеспособных микроорганизмов в образце в процессе и после терапии (Morre S.A., et al., 1996).
На сегодняшний день за рубежом предложено множество протоколов выявления ДНК T.vaginalis с помощью метода ПЦР (Riley D.E., et al., 1992; Kengne P., et al., 1994; Shaio M.F., et al., 1997; Madico G., et al., 1998; Mayta H., et al., 2000). Было показано, что диагностическая чувствительность ПЦР выше, чем у традиционных методов выявления T.vaginalis (микроскопия и культуральный посев), однако она варьировала в широких пределах (от 60 до 100%), а сами исследования проводили на различном биологическом материале (моча, вагинальное отделяемое, соскобы из уретры и цервикального канала), среди различных групп населения, полученном от мужчин и женщин. При этом аналитическая чувствительность в предложенных протоколах не была установлена. В свою очередь аналитические характеристики (аналитическая чувствительность и специфичность) определяют диагностические чувствительность и специфичность метода. Для повышения аналитической чувствительности метода необходимо выбрать оптимальную мишень, размер амплифицируемого фрагмента, программу амплификации и метод его детекции. Одной из причин, ограничивающих использование ПЦР в клинической лабораторной практике, является отсутствие в методиках образцов, которые бы контролировали проведение всего процесса ПЦР-исследования (от экстракции нуклеиновых кислот, до детекции продуктов амплификации) предотвращающих выдачу лабораторией ложноотрицательных и ложноположительных результатов исследования.
На сегодняшний день отсутствуют нормативные документы, регламентирующие использование метода ПЦР при лабораторной диагностике конкретных нозологических форм, и нормативно-правовая база диагностики мочеполового трихомониаза, как таковая, отсутствует. Поэтому необходима разработка новых регламентирующих документов, которые, в свою очередь, должны базироваться на объективных данных об аналитических и диагностических характеристиках различных лабораторных методов.
Цель исследования
Разработка стандартизованных методик лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза на основе технологий ПЦР и НАСБА в реальном времени и обоснование необходимости их применения.
Задачи исследования
-
Разработать методику для выявления ДНК T.vaginalis на основе метода ПЦР в реальном времени;
-
Разработать методику для выявления РНК T.vaginalis на основе метода НАСБА в реальном времени;
-
Определить и сравнить аналитическую чувствительность микроскопии (нативного и окрашенного препаратов), культурального посева, ПЦР и НАСБА;
-
Оценить эффективность лабораторной диагностики трихомониаза на биологическом материале, полученном от пациентов, исходя из значений аналитической чувствительности методов выявления T.vaginalis.
Научная новизна и теоретическая значимость исследования
Впервые проведено сравнение аналитической чувствительности методов амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА) и рутинных методов диагностики трихомонадной инфекции (микроскопия нативного и окрашенного препаратов, микробиологический посев).
Впервые в отечественной лабораторной практике разработана методика для выделения РНК T.vaginalis на основе реакции транскрипционной амплификации NASBA в режиме реального времени.
Использование разработанной методики на основе ПЦР позволяет оптимизировать и повысить качество лабораторной диагностики трихомонадной инфекции.
Практическая значимость исследования
Разработаны методики на основе высокочувствительных и специфичных методов амплификации нуклеиновых кислот, которые увеличивают эффективность диагностики трихомонадной инфекции. Методика НАСБА может быть использована как дополнительный высокочувствительный МАНК для решения вопросов, связанных с получением дискордантных результатов при совместном использовании метода ПЦР и традиционных методов выявления трихомонад (микроскопии и культурального посева).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Разработана методика ПЦР для диагностики урогенитального трихомониаза с высокими показателями чувствительности и специфичности.
-
Разработана методика НАСБА для диагностики урогенитального трихомониаза с высокими показателями чувствительности и специфичности.
-
Аналитическая чувствительность разработанных методик на основе технологий ПЦР и НАСБА достоверно выше, чем у методов микроскопии и культурального посева.
Внедрения результатов исследования
На основе разработанных методик созданы наборы реагентов: «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL», «АмплиСенс T.vaginalis-РИБОТЕСТ», которые зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.
Разработанные методики применяются для диагностики урогенитального трихомониаза в более чем 800 лабораториях различных регионов Российской Федерации, ближнего и дальнего зарубежья.
Материалы проведенных в ходе работы исследований входят в программу сертификационного цикла усовершенствования «ПЦР — диагностика инфекционных заболеваний» на базе ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и НМАПО им. П.Л. Шупика МЗ Украины.
Апробация материалов диссертации
Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, протокол №10 от 1 ноября 2012 г.
Основные положения диссертации были доложены на IХ Всероссийском съезде дерматовенерологов, 7-10 июня 2005 (г. Москва); Международной конференции «Фундаментальные науки – биотехнологии и медицине», 3-7 сентября 2006 (г. Новосибирск); Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» 19-20 мая 2006 (г. Алматы, Казахстан); 23rd IUSTI-Europe Conference on Sexually Transmitted Infections and HIV/AIDS, 11-14 октября 2007 (г. Дубровники, Хорватия); VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней - 2007» 28-30 ноября 2007 (г. Москва); 11th IUSTI World Congress, 9-12 ноября, 2009 (г. Кейптаун, Южная Африка); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика -2010», 24-26 ноября 2010 (г. Москва); 20th EADV Congress, 20-24 ноября 2011, (г. Лиссабон, Португалия); Всероссийской научной конференции «Фундаментальная медицина: от науки к технологиям», 15-16 декабря 2011 (г. Санкт-Петербург); XII Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов, 26-26 июня 2012 (г. Москва)
Публикации
По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация представлена на 154 страницах, включая 38 рисунков, 16 таблиц, список литературы и приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов с выводами. Список использованной литературы включает 41 отечественных и 139 зарубежных источников.
