Введение к работе
Актуальность исследования.
В настоящее время диагностика лейкозов основывается на сопоставлении результатов морфологических, проточно-цитометрических и молекулярно-генетических исследований.
Иммунофенотипирование злокачественных клеток периферической крови и костного мозга с помощью метода проточной цитометрии остается необходимым инструментом для постановки диагноза, классификации, определения стадии и мониторинга гематологических опухолей. За последние 10-15 лет проточная цитометрия интенсивно развивалась, был расширен диапазон моноклональных антител (МКА) и флюорохромов, что позволило повысить качество идентификации субпопуляций нормальных клеток и распознавание редких аберрантных иммунофенотипов даже при анализе небольшого количества клеток (Craig F.E., 2008). Определение варианта лимфопролиферативного заболевания (ЛПЗ) методом проточной цитометрии основывается на установлении иммунофенотипа опухолевых клеток периферической крови или костного мозга. В большинстве случаев опухолевые лимфоидные клетки имеют нормальные клеточные аналоги, т.е. соотносятся с определенным этапом дифференцировки лимфоцитов. Воздействие различных этиологических факторов приводит к развитию мутаций онкогенов в клетке, блоку в дифференцировке и накоплению опухолевого клона, сохраняющего набор антигенов нормальной лимфоидной клетки (Луговская С.А. и др., 2005; Van Dongen J.J.M. et al., 2002). Это определяет многообразие лимфопролиферативных заболеваний (4th Edition WHO Classification … 2008). В то же время при хронических ЛПЗ не всегда возможно установить стадию дифференцировки, на уровне которой наступила онкогенная трансформация.
Важным при изучении опухолей иммунной системы является формирование панели диагностических МКА (Луговская С.А. и др., 2005; Van Dongen J.J.M. et al., 2006). Набор используемых МКА может различаться в зависимости от целей исследования. Британским комитетом по стандартам в гематологии (BCSH) разработаны рекомендации по иммунофенотипированию ЛПЗ и предложена, так же как и для фенотипирования острых лейкозов (ОЛ), двухлинейная панель МКА (General Haematology Task Force of BCSH, 1994). На первом этапе проводится дифференциальная диагностика В-клеточных от Т- или NК-клеточных ЛПЗ и в группе В-клеточных опухолей выделяется ХЛЛ или другие варианты неходжкинских злокачественных лимфом. В зависимости от результатов первого этапа исследования и морфологии клеточных элементов проводится второй этап типирования, в ходе которого уточняется иммунофенотип ЛПЗ. Подходы к выбору панели моноклональных антител, алгоритмам иммунофенотипирования и оценке полученных результатов были предложены и обобщены сравнительно недавно (Ван Донген Ж. и др., 2002; Catovsky D., 1997; Braylan R.C. et al, 2001). Несмотря на существование основных принципов, выбор набора МКА остается прерогативой исследователя, а единые алгоритмы иммунофенотипирования методом проточной цитометрии отсутствуют.
Классическая многоцветная проточная цитометрия в основном использует определение позитивных и негативных по экспрессии анализируемого маркера клеток. Оценка положительной экспрессии антигена в зависимости от интенсивности флюоресценции для выделения популяций клеток dim, moderate и bright применяется редко. Анализ интенсивности флюоресценции маркеров позволяет значительно расширить возможности диагностики онкогематологических заболеваний с помощью метода проточной цитометрии. В последнее время анализу яркости флюоресценции антигенов стали уделять особое внимание и внедрять в рутинную практику, поскольку для этого не требуется дополнительных финансовых вложений (Куртова А.В. и др., 2008).
В связи с вышеизложенным, усовершенствование дифференциальной диагностики хронических лимфопролиферативных заболеваний с использованием проточно-цитометрического метода продолжает оставаться важной медицинской проблемой.
Цель исследования.
Оптимизация дифференциальной диагностики опухолей из зрелых В- и Т-клеток на основании изучения аберрантной экспрессии антигенов методом проточной цитометрии.
Задачи исследования:
1. Исследовать антигенный профиль опухолевых клеток и интенсивность экспрессии В- и Т-клеточных антигенов в периферической крови или костном мозге при различных хронических лимфопролиферативных заболеваниях.
2. Установить иммунофенотипический диагноз лимфопролиферативного заболевания.
3. Сопоставить результаты иммунофенотипирования с клинической картиной и данными морфологических и цитогенетических методов исследования для постановки окончательного диагноза.
4. Для I этапа иммунофенотипирования создать панель наиболее информативных трехцветных комбинаций моноклональных антител и разработать алгоритм предварительной дифференциальной диагностики хронических лимфопролиферативных заболеваний.
5. На основании результатов I этапа иммунофенотипирования создать панель трехцветных комбинаций антител для II этапа и разработать алгоритм дифференциальной диагностики вариантов хронических В- и Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.
Научная новизна исследования.
Выявлены редкие иммунологические варианты В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) - CD5+CD23-В-ХЛЛ, CD5-CD23+В-ХЛЛ, лимфомы из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) - CD5+CD23+ЛКМЗ и изучены их иммунофенотипические особенности. Впервые установлено, что для дифференциации В-клеточного хронического лимфолейкоза, включая редкие иммунофенотипические варианты CD5-негативного В-ХЛЛ и CD23-негативного В-ХЛЛ, от других хронических В-клеточных ЛПЗ диагностически наиболее значимым является характер экспрессии антигенов FMC7, CD79b, CD22.
Получены новые данные о том, что иммунологический вариант CD5+CD23-В-ХЛЛ, в отличие от классического CD5+CD23+В-ХЛЛ, характеризуется умеренной интенсивностью экспрессии антигенов CD20, SmIgk и более высокой интенсивностью флюоресценции общелейкоцитарного антигена CD45.
Впервые обнаружено, что редкий иммунофенотипический вариант CD23-позитивного ЛКМЗ характеризуется более высокой степенью экспрессии антигена CD19, в отличие от типичного CD5+CD23-ЛКМЗ.
Получены новые данные, позволяющие использовать в качестве дифференцирующих признаков интенсивность флюоресценции антигенов CD45, CD19, CD20 для дискриминации опухолей из зрелых В-клеток.
Практическая значимость работы.
Предложенная панель трехцветных комбинаций антител и разработанный алгоритм предварительной дифференциальной диагностики для первого этапа иммунофенотипирования хронических В- и Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваний позволяют предположить вариант опухоли из зрелых Т- или В-клеток по характеру экспрессии антигенов и распределения клеток на гистограммах по сигналам SSC/FSC и SSC/CD45.
Модифицированные панель трехцветных комбинаций антител и алгоритм дифференциальной диагностики вариантов хронических В- и Т-лимфопролиферативных заболеваний на втором этапе иммунофенотипирования уточняют вариант опухоли из зрелых В- или Т-клеток.
Применение трехцветной панели МКА позволяет получить стабильную максимальную чувствительность анализа и достоверные результаты для исследований на однолазерных и двухлазерных проточных цитометрах и является наиболее надежным в диагностическом и выгодным в экономическом аспектах. Проведение иммунофенотипирования на начальных этапах обследования пациента, в соответствии с предложенными алгоритмами, позволяет поставить точный диагноз, что приводит к уменьшению времени пребывания пациентов в стационаре и своевременному назначению адекватного лечения.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Распределение клеток на гистограммах по сигналам светорассеяния SSC/FSC, SSC/CD45 и средняя интенсивность флюоресценции антигенов СD45, CD19, CD20 имеют диагностическое значение для дифференциации хронических В-клеточных ЛПЗ.
2. Основными дифференциально-диагностическими признаками классического (CD5+CD23+) и неклассических вариантов (CD5+CD23- и CD5-CD23+) В-ХЛЛ являются отсутствие экспрессии или слабая интенсивность экспрессии антигенов FMC7, CD79b, CD22. Иммунофенотипическими особенностями неклассических форм В-ХЛЛ и ЛКМЗ являются: более высокая интенсивность экспрессии антигенов CD20, SmIgk, CD45 для CD5+CD23-В-ХЛЛ, и более выраженная степень экспрессии антигена CD19 для CD5+CD23+ЛКМЗ.
3. Модифицированные панели трехцветных комбинаций диагностических антител, алгоритмы I и II этапов иммунофенотипирования с учетом интенсивности флюоресценции антигенов позволяют сократить время проведения анализа и количество используемых антител, не снижая точности диагностики варианта ЛПЗ.
Реализация и внедрение результатов исследования.
Материалы настоящей работы нашли практическое применение в учебном процессе и научно-практической деятельности кафедры факультетской терапии и НИО нанобиотехнологий НИЦ ВМедА им С.М. Кирова.
Апробация и публикация материалов исследования.
Основные положения работы обобщены и доложены на XVII Всероссийской научно-практической конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2009), на 1 Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010), на научной конференции с международным участием «Наследие Пирогова: прошлое, настоящее, будущее», посвященной 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова. Секция 11 «Клиническая лабораторная диагностика: настоящее и будущее».
По материалам исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 научные статьи, в журналах реферируемых ВАК.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации приведены 11 таблиц и 27 рисунков. Библиографический указатель содержит 18 отечественных, 119 зарубежных публикаций.
