Введение к работе
Актуальность исследования
Нейтрофильные гранулоциты являются самыми многочисленными из лейкоцитов. Они имеют короткую продолжительность жизни, их количественный гомеостаз в периферической крови постоянно поддерживается притоком из костного мозга. Нейтрофилы играют очень важную роль в антимикробных реакциях врожденного иммунитета [Nathan C., 2006].
Нейтрофил оснащен богатым набором рецепторов, которые позволяют чутко и дифференцированно реагировать на малейшие изменения окружающей среды [Ковальчук Л.В. и др., 2005; Семенов Б.Ф., Зверев В.В., 2007; Hoffmann J.A. еt аl., 1999; Hoffmann J.A. еt аl., 2003]. Подготовленный нейтрофил может оказывать свое действие на объект, вызвавший его активацию, одним из двух способов: во-первых, фагоцитировать и уничтожать его в фаголизосомах, во-вторых, выделять наружу бактерицидные продукты, которые представляют собой содержимое гранул [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001].
Открытие V. Brinkmann и соавт. в 2004 г. нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) и установление их антимикробного эффекта, как важнейшего звена врожденного иммунитета, безусловно, является началом нового этапа в понимании жизненного цикла и функции нейтрофильных гранулоцитов.
Формирование внеклеточных ловушек может осуществляться только активными нейтрофилами. Эффект антимикробных веществ, входящих в состав НВЛ во внеклеточном пространстве усиливается в структурах НВЛ [Parseghian M.H., Luhrs K.A., 2006; Brinkmann V., Zychlinsky A., 2007].
Данные литературы свидетельствуют о том, что новому механизму защиты, осуществляемому нейтрофильными гранулоцитами, уделяется очень большое внимание [Brinkmann V. et al., 2004; Urban C.F. еt аl., 2006; Brinkmann V., Zychlinsky A., 2007; Fuchs, T.A. еt аl., 2007; Steinberg B.E., Grinstein S., 2007; Neeli I. еt аl., 2009; Florian H. Pilsczek еt аl., 2010]. Несмотря на многочисленные исследования в данной области, очень много вопросов остаются не раскрытыми. До конца не ясны механизмы формирования НВЛ, система внутриклеточных взаимодействий при формировании НВЛ, условия внешней и внутренней среды необходимые для образования нейтрофилами внеклеточных ловушек, их эффективность по отношению к различным патогенам, методы обнаружения НВЛ и их применение в клинической и диагностической практике.
Цель исследования
Изучить механизмы формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек, разработать методы их обнаружения в различных биологических жидкостях в норме и при патологии.
Задачи исследования
-
Сравнить различные способы окраски внеклеточных ловушек, образуемых нейтрофилами, выделенными из периферической крови.
-
Определить оптимальные условия инкубации in vitro для формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.
-
Изучить влияние различных экзогенных факторов микробной и немикробной природы на процесс образования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.
-
Оценить in vitro влияние различных эндогенных факторов (плазма, сыворотка крови, комплемент, специфические иммуноглобулины) на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.
-
Изучить участие цитоскелета, кальциевых каналов, энергетического обмена и мембраны нейтрофила в процессе образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.
-
Разработать метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах.
-
Провести сравнительный анализ захвата и киллинга микроорганизмов нейтрофилами в процессе фагоцитоза и образования внеклеточных ловушек, а также определить зависимость эффективности нейтрофильных внеклеточных ловушек от её морфологических характеристик.
-
Оценить информативность предлагаемых методов обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в различных биологических жидкостях в норме и при патологии.
Научная новизна
В работе определены оптимальные условия инкубирования нейтрофилов для их активации и формирования НВЛ in vitro. Установлено, что оптимальное время инкубации составляет 30 минут, а температура 37С. Показано, что факторы микробной и немикробной природы: Lactobacterium spp. и Bifidumbacterium spp., E. coli (штамм М-17), S. аureus, грибы рода Candida, форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), липополисахарид (ЛПС), пирогенал, вакцина «Солкотриховак», циклоферон, бестим индуцируют образование НВЛ.
Изучено формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной крови, лейкоцитарной взвеси и нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина. Показано, что нейтрофилы цельной крови и лейкоцитарной взвеси в норме не образуют НВЛ не зависимо от концентрации активатора. Определена роль сыворотки, плазмы, комплемента и специфических иммуноглобулинов в формировании внеклеточных ловушек нейтрофилами. Установлено, что аутологичные сыворотка и плазма крови, независимо от присутствия в них специфических иммуноглобулинов и комплемента, оказывают ингибирующее действие на внеклеточный выброс ДНК нейтрофилами, выделенными из периферической крови. Комплемент сыворотки морской свинки оказывает стимулирующее дозозависимое действие на секрецию нейтрофильной ДНК. Специфические иммуноглобулины не влияют на формирование НВЛ, в то же время, они усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов.
Определено участие цитоскелета, кальциевых каналов, энергетического обмена и мембраны нейтрофила в процессе формирования НВЛ. Показано, что перечисленные ультраструктуры нейтрофила задействованы в образовании НВЛ.
Разработан способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах. Используя данный способ впервые изучены морфология и эффективность НВЛ. Установлено, что эффективность НВЛ, зависит от ее морфологических характеристик.
Разработаны новые методы определения НВЛ в агарозном геле и на спектрофатометре.
Впервые проведен сравнительный анализ количества НВЛ в различных биологических жидкостях. Показано, что острый инфекционный процесс стимулирует повышенный выброс нейтрофильной ДНК во внеклеточное пространство.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты исследования расширяют знания о физиологии нейтрофильных гранулоцитов, их функциональных возможностях, механизмах формирования НВЛ. Разработанный метод изучения образования НВЛ в агарозном геле позволяет моделировать условия существования нейтрофилов в мукозальных секретах.
Полученные данные вносят существенный вклад в понимание роли НВЛ в антимикробных реакциях врожденного иммунитета.
Данные о стимуляции или блокаде образования нейтрофилами внеклеточных ловушек веществами, влияющими на элементы цитоскелета, мембрану нейтрофилов, кальциевые каналы и энергетический обмен, могут быть использованы для поиска новых подходов к фармакологической коррекции защитных реакций, связанных с формированием НВЛ.
Разработанные методы обнаружения НВЛ открывают новые возможности для диагностики различных заболеваний, оценки тяжести течения болезней и эффективности их лечения.
Положения, выносимые на защиту
-
Разработанные методы обнаружения НВЛ в периферической крови и мукозальных секретах, могут быть использованы для оценки функционального статуса нейтрофилов и диагностики дефектов врожденного иммунитета.
-
Элементы цитоскелета, кальциевые каналы, энергетический обмен и мембрана нейтрофилов вовлечены в процесс формирования НВЛ.
-
Нейтрофилы чистой фракции, цельной крови и лейкоцитарной взвеси по-разному отвечают образованием НВЛ на стимуляцию различными активаторами. Сыворотка и плазма крови подавляют образование нейтрофилами внеклеточных ловушек.
-
Внеклеточный захват и киллинг микроорганизмов, осуществляемый нейтрофильными гранулоцитами является, процессом более эффективным, чем фагоцитоз.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследований внедрены в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, в Институт экологии и генетики микроорганизмов УроРАН, г. Пермь и используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.
Апробация работы
Основные положения работы доложены и обсуждены на: IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии” (Москва, 2007); национальной конференции “Аллергология и клиническая иммунология – междисциплинарные проблемы” (Москва, 2008); объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); конференции, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН (Челябинск, 2008); VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009); X Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге: Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунокоррекции» (г. Санкт-Петербург, 2009); VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2009); II международной научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2011); IX Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011).
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 221 страницах текста, иллюстрирована 46 таблицами, 11 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, восьми глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 289 источников, в том числе 112 отечественных и 177 зарубежных.
Публикации
