Содержание к диссертации
Список использованных сокращений 6
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17
1 История создания бифункциональных антител и области
их применения 17
Способы получения бифункциональных моноклональных антител 21
Тестирование бифункциональных моноклональных антител 24
Рекомбинация легких и тяжелых цепей антител в гибридных гибридомах 25
Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител 29
5.1 Теоретические основы анализа связывания антител с
антигеном 29
Анализ равновесного связывания антител с антигеном в растворе 31
Модель бивалентного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе 32
Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений наблюдаемой равновесной константы ассоциации (К^) в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном 35
Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений параметров кривых связывания в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном 36
.5 Определение соотношения антител связанных с антигеном
моновалентно и бивалентно 36
.6 Кинетический анализ связывания антител с антигеном,
иммобилизованным на твердой фазе 37
.7 Преобразование кинетических кривых, получаемых с
помощью оптического биосенсора 39
.8 Использование бивалентной модели для предсказания
теоретически ожидаемых изменений наблюдаемых
кинетических констант в зависимости от
преимущественного характера связывания антител с
иммобилизованным антигеном 39
Антигенсвязывающие свойства бифункциональных
моноклональных антител 40
Применение бифункциональных антител в
иммуногистохимии, иммуноблоттинге и твердофазном
иммуноферментном методе 44
Заключение 49
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 52
Получение клонов-продуцентов моноклональных антител. 52
Очистка моноклональных антител с помощью
ионообменной хроматографии 53
Определение антипероксидазной активности антител 53
Определение антигенсвязывающей активности антител 55
Определение активности бифункциональных антител
иммуноферментным методом с двумя антигенами (doubl
antigen ELISA-test) 55
Приготовление аффинных носителей 55
Аффинная очистка моноспецифических антител 56
Аффинная очистка бифункциональных антител 56
Определение концентрации белка 56
Фракционирование продуктов секреции тетрадомы для
количественного определения антител 57
Приготовление антигенов и антител, меченых 1251 57
Определение концентрации меченых ,251 антител после аффинной очистки 59
Определение концентрации антител в культуральных супернатантах радиоиммунологическим методом 59
Анализ связывания меченых Ч антител с антигеном, адсорбированным на твердой фазе 60
Определение равновесной константы ассоциации при связывании антител с антигенами 61
Определение равновесной константы ассоциации антипероксидазных антител 63
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствие додецилсульфата натрия 64
Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле 64
Анализ связывания антител с иммобилизованным антигеном с помощью оптического биосенсора IAsys 64
Иммобилизация антигенов (HRP и hlgGl) на поверхность кюветы биосенсора Iasys 67
Кинетика связывания антител с иммобилизованными HRP
и hlgGl 67
22 Преобразование кинетических кривых, получаемых с
помощью оптического биосенсора 68
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 70
Получение гибридомных клеточных линий 70
Получение гибридных гибридом 72
Очистка монофункциональных и бифункциональных антител 77
3.1 Очистка моноклональных (монофункциональных) антител
с помощью ионообменной хроматографии 77
Препаративная очистка бифункциональных моноклональных антител с помощью аффинной хроматографии 80
Фракционирование продуктов секреции тетрадомы для количественного определения антител 84
4 Ассоциация легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов в
гибридных гибри домах 85
Теория расчета субфракций антител, синтезируемых квадромами с различными типами ассоциации легких и тяжелых цепей 87
Экспериментальное определение субфракций антител, квадромы 40E9x36F9, секретирующей бифункциональные антитела со специфичностью антиэндорфин\антипероксидаза 95
Определение цепьевого состава продуктов секреции квадромы методом двумерного электрофореза 98
Относительная скорость секреции легких и тяжелых цепей антител родительскими гибридомами и квадромными клетками 101
5 Антигенсвязывающие свойства бифункциональных
моноклональных антител 102
Получение антител и антигенов, меченых |251 103
Истинные антигенсвязывающие свойства бифункциональных антител (параметру связывания антител с антигенами в растворе) 104
Влияние избытка одного из антигенов на связывание бифункциональных антител со вторым антигеном 109
6 Антигенсвязывающие свойства бифункциональных
антител при связывании с антигенами, сорбированными на
твердой фазе 110
6.1 Анализ характера взаимодействия антител с
иммобилизованным антигеном классическими методами
(радиоиммунологическим и твердофазным ИФА) 111
6.2 Модель бивалентного связывания бифункциональных
антител при одновременной сорбции на твердую фазу
смеси двух антигенов ц^
63 Анализ взаимодействия антител с иммобилизованным
антигеном с помощью оптического биосенсора IAsys 118
7 Эффективность бифункциональных антител, как
детектирующих антител в твердофазном ИФА 126
V ОБСУЖДЕНИЕ 133
Истинные антигенсвязывающие свойства 133 бифункциональных антител
Связывание антител с иммобилизованным антигеном ^40
Эффективность бифункциональных антител, как 144 детектирующих антител в твердофазном иммуноферментном методе
Ассоциация легких и тяжелых цепей антител в квадромных 149 клетках
V ВЫВОДЫ 158
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 162
БЛАГОДАРНОСТИ 176
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ1
АГ - антиген;
Анти-Мб - моноклональные антитела к миоглобину человека;
Анти-ЭНД - моноклональные антитела к эндорфину человека;
Анти-Мб/ПХ - бифункциональные моноклональные антитела, несущие сайты связывания с миоглобином и пероксидазой хрена;
Анти-ЭНД/ПХ - бифункциональные моноклональные антитела, несущие сайты связывания с эндорфином и пероксидазой хрена;
Анти-hIgG - моноклональные антитела к IgG человека;
Анти-hIgG/nX - бифункциональные моноклональные антитела, несущие сайты связывания с IgG человека и пероксидазой хрена;
AT - антитела;
БИАТ - бифункциональные (биспецифические) моноклональные антитела;
ИФА - иммуноферментный метод;
Мб - миоглобин;
МКА - моноклональные антитела;
ОФД - ортофенилендиамин;
ПААГ - полиакриламидный гель;
ПХ - пероксидаза хрена;
РИА - радиоиммунологический метод;
ЭФ - электрофорез;
L цепь - легкая цепь молекулы антител;
Н цепь - тяжелая цепь молекулы антител;
hlgG - иммуноглобулин G человека;
SDS - додецилсульфат натрия.
1 В списке не приводятся сокращения введенные и употребленные 2-3 раза в пределах одной страницы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Наряду с обычными моноклональными антителами (МКА) гибридомная технология позволяет получать биспецифические антитела (БИАТ), несущие места связывания двух различных антигенов [Milstein and Cuello, 1983]. Для получения клонов-продуцентов БИАТ (квадром, тетрадом или триом) сливают две гибридомы (или, в другом варианте, гибридомы и иммунные лимфоциты), которые секретируют различные МКА. В гибридных гибридомах синтезируются легкие (L) и тяжелые (Н) цепи родительских AT и происходит их рекомбинация, в результате чего может образовываться до десяти видов AT, включая БИАТ (рис. 1, А). Несмотря на кажущуюся простоту описанного механизма, многие аспекты процесса образования AT в квадромах остаются неизученными. Прежде всего, это касается факторов, определяющих качественный и количественный состав AT, секретируемых гибридными гибридомами. Исследования по изучению связывания Н и L цепей in vitro [De Preval and Fougereau, 1976; Hamel et al., 1986; Hamel et al., 1987] свидетельствуют, что легкие цепи от двух разных антител могут конкурировать за связывание с одной тяжелой цепью, причем аффинности при связывании могут отличаться более чем на порядок. Таким образом, связывание легких цепей с тяжелыми может быть как случайным (при одинаковой аффинности легких цепей в отношении тяжелой), так и предпочтительным (если одна из легких цепей демонстрирует более высокую аффинность в отношении тяжелой цепи). Подобные механизмы ассоциации легких и тяжелых цепей могут иметь место и в гибридных гибридомах [Milstein and Cuello, 1984]. Важнейшим фактором, влияющим на состав AT (и долю БИАТ), является, по-видимому, способ ассоциации L и Н цепей в гибридных клетках. При
случайной рекомбинации должно образовываться много гетерологичных H-L пар, в которых L и Н цепи происходят от-разных родительских AT (см. рис. 1, А; варианты VIII-X). Как правило, плечо AT, образованное сочетанием гетерологичных H-L цепей не обладает АГ-связывающей активностью. В противоположность этому, предпочтительная ассоциация гомологичных L и Н цепей (то есть, цепей, происходящих от одного родительского МКА), теоретически должна способствовать более высокому выходу БИАТ. Изучение взаимодействия L и Н цепей в квадромных клетках и продуктов этого взаимодействия - квадромных AT, осложняется недостаточной разработкой методов анализа иммуноглобулинов, образуемых гибридными гибридомами. Секретируемые антитела представляют собой смесь близких по молекулярному весу и физико-химическим свойствам молекул, поэтому их анализ оказывается достаточно сложной задачей. В особенности это относится к количественным аспектам популяций квадромных AT, которые практически не анализировались. Вместе с тем, вопрос о том, какой тип ассоциации цепей превалирует в квадромах, и как это отражается на составе секретируемых AT, представляет большой теоретический и практический интерес. В теоретическом плане этот вопрос тесно связан с проблемой разнообразия AT. Известно, что одним из факторов, определяющих разнообразие антител, является характер ассоциации L и Н цепей. Сформулирована гипотеза о том, что предпочтительная ассоциация гомологичных L и Н цепей может быть следствием процессов, направленных на отбор высокоаффинных H-L пар во время созревания В-клеток "in vivo" [Preval and Fougereau, 1976]. Существование такого механизма предполагает значительное уменьшение числа потенциально возможных "природных" AT за счет ограничения H-L комбинирования в популяциях лимфоцитов. С практической точки зрения важно то, что предпочтительная ассоциация
А. СЛУЧАЙНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ ЛЕГКИХ И ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ
^
Бифункциональные антитела
V %\f '%// W Y
II III IV
Антитела к антигену 1
V VI VII
Антитела к антигену 2
(
\
% /' Ч. // \ч //
VIII IX X
Неактивные антитела
Б. ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ ГОМОЛОГИЧНЫХ L-H ЦЕПЕЙ
* *
«
* т
%
Y Y
Анти-АГі
БИАТ
Анти-АГ2
В. ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ H-L ЦЕПЕЙ У АНТИТЕЛ К АНТИГЕНУ 1
v sf sf -v v V"
Анти-АГ
БИАТ Неактивные AT Анти-АГ2
Рисунок 1. Изоформы антител, образуемых гибридными гибридомами при различных типах ассоциации легких и тяжелых цепей
повышает эффективность квадром как продуцентов БИАТ.
С типом взаимодействия L и Н цепей тесно связан и вопрос об антигенсвязывающих свойствах как обычных МКА, так и наиболее интересного (с точки зрения биотехнологии) продукта секреции гибридных гибридом - БИАТ. Высказывалось предположение, что предпочтительная ассоциация гомологичных H-L цепей приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов [Hamel et al., 1986, 1987]. Таким образом, если соотнести тип ассоциации Н и L цепей (случайный или предпочтительный) с аффинностью антигенсвязывающих сайтов антител, то можно подтвердить или опровергнуть высказанную гипотезу.
Теоретически, родительские МКА и соответствующее плечо БИАТ имеют одинаковую структуру АГ-связывающих центров (см. рис. 1) и, как следствие, должны проявлять одинаковые АГ-связывающие свойства. Вместе с тем, продемонстрирована возможность сохранения АГ-связывающей активности при сочетании гетерологичных H-L цепей. Образовавшийся при этом АГ-связывающий сайт сохраняет активность AT, от которых происходит Н цепь; правда, аффинность таких AT значительно уменьшается [Hudson et al., 1987]. Это может приводить к возникновению "аномальных" БИАТ с измененными АГ-связывающими центрами. Кроме того, в рекомбинантных AT могут наблюдаться нарушения гликозилирования иммуноглобулиновых цепей и конформационные изменения, влияющие на связывание с АГ. Таким образом, встает вопрос: в какой мере АГ-связывающие центры БИАТ, получаемых с помощью биологического метода, сохраняют аффинность родительских AT. Сведения об этом весьма ограничены: подробное исследование АГ-связывающих свойств БИАТ, полученных с помощью гибридизации клеток, было проведено в единственной работе [Allard et al., і992].
Антитело
Бифункциональное антитело
Аитиген
о q 9 с/сТ"о
N Твердая фаза\ N N N
а б в
Рисунок 2. Связывание моноклональных (монофункциональных) и бифункциональных антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе.
а - моновалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном;
б - бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном;
в - связывание бифункциональных антител с иммобилизованным антигеном (может быть только моновалентным).
Весьма важным как с практической, так и с теоретической точки зрения является проблема взаимодействия БИАТ с антигенами, адсорбированными на твердой фазе. Молекула иммуноглобулина класса IgG, несет два АГ-связывающих сайта и может связываться с антигеном, адсорбированным на твердой фазе, как одним АГ-связывающим сайтом (моновалентно, см. рис. 2, а), так и двумя АГ-связывающими сайтами одновременно (бивалентно, см. рис 2, б). БИАТ несут два АГ-связывающих сайта к различным антигенам и, таким образом, могут связываться с адсорбированным АГ только моновалентно (см. рис. 2, в). Очевидно, что бивалентное связывание с антигенами существенно прочнее, чем моновалентное, таким образом, в любом варианте связывания с иммобилизованным антигеном обычные МКА должны быть результативнее БИАТ. Однако большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ в иммуногистохимии,
иммуноблоттинге и при взаимодействии со злокачественными клетками. Вместе с тем, отсутствуют теоретические работы, в которых бы корректно сравнивались свойства моновалентных (т.е. БИАТ) и бивалентных антител (обычных МКА) при связывании с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Следовательно, утверждения о высокой эффективности БИАТ в сравнении с обычными МКА представляются весьма спорными. На наш взгляд, для окончательного вывода требуется сравнительный анализ эффективности связывания МКА и БИАТ, несущих тождественные сайты связывания с АГ, с иммобилизованным антигеном. Кроме того, необходим сравнительный анализ эффективности детектирующих моноклональных AT (конъюгатов) и БИАТ, несущих сайт связывания с ферментом, в твердофазном ИФА.
Итак, актуальным является анализ механизмов образования AT в гибридных гибридомах и изучение АГ-связывающих свойств БИАТ как в растворе, так и при взаимодействии с иммобилизованными антигенами. В настоящей работе предпринята попытка исследовать некоторые из этих вопросов, используя панель тетрадом, продуцирующих антитела к антигенам, которые значительно отличаются по структуре и молекулярному весу. Анализируемые МКА и БИАТ несли сайты связывания со следующими АГ: эндорфином (М,л1600), миоглобином (Мги 18600), пероксидазой хрена (М^40000) и IgG человека (М^ 160000).
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы - анализ взаимодействия БИАТ с антигенами (как в растворе, так и при иммобилизации АГ на твердой фазе), а также разработка экспериментальных подходов, позволяющих проводить количественный и качественный анализ продуктов секреции гибридных гибридом и расшифровывать способ ассоциации L и Н цепей в гибридных клетках.
В задачи работы входило:
I, Проанализировать характер ассоциации легких и тяжелых цепей
антител (случайный или предпочтительный), синтезируемых
гибридными гибрид омами. Для определения типа ассоциации легких и
тяжелых цепей:
Разработать теоретические модели рекомбинации L и Н цепей в гибридных гибридомах, позволяющие предсказывать типы антител, образуемых квадромой, в зависимости от способа ассоциации (случайного или предпочтительного) легких и тяжелых цепей.
Количественно проанализировать продукты секреции квадромы, (бифункциональные антитела, антитела к каждому из антигенов и неактивные антитела (рис. 1, А)), разработав методы фракционирования антител и их количественного анализа.
Определить цепьевой состав антител, продуцируемых квадромами (легкие и тяжелые цепи антител), с помощью двумерного электрофореза.
Путем сопоставления экспериментальных и теоретических распределений антител и результатов электрофор етическо го анализа цепьевого состава антител определить способ ассоциации L и Н цепей в квадромных клонах.
II. Соотнести истинную аффинность родительских антител и
аффинность тождественных антигенсвязывающих сайтов
бифункциональных антител:
1) Определить истинную аффинность (равновесную константу ассоциации в растворе) при взаимодействие бифункциональных антител с антигенами различного молекулярного веса в растворе. Сравнить аффинность родительских антител с аффинностью тождественного антигенсвязывающего сайта биспецифических антител.
Определить, каким образом избыток одного из антигенов влияет на связывание бифункциональных антител со вторым антигеном в растворе и, таким образом, сделать вывод о наличии (или отсутствии) кооперативного эффекта при взаимодействии антител с антигенами.
Соотнести тип ассоциации Н и L цепей (случайный или предпочтительный) в антигенсвязывающих сайтах антител с аффинностью этих антигенсвязывающих сайтов и подтвердить (или опровергнуть) гипотезу о том, что предпочтительная ассоциация гомологичных Н и L цепей приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов.
Ш. Для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) апробировать новую модель: соотнести параметры связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающего сайта бифункциональных антител. Для анализа характера взаимодействия использовать антитела к антигенам различного молекулярного веса и структуры: миоглобину (Мг« 18600), пероксидазе хрена (N1^40000) и IgG человека (Mr» 160000). Для определения характера взаимодействия антител с сорбированным антигеном использовать как традиционные методы (радиоиммунологический и твердофазный ИФА), так и анализ с помощью оптического биосенсора lAsys. Соотнести результаты, полученные обоими методами.
IV. Проанализировать относительную эффективность
бифункциональных антител, несущих сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой в сравнении с традиционными конъюгатами антител с пероксидазой, как детектирующих молекул в твердофазных тестах (твердофазный иммуноферментный анализ и сэндвич-метод).
Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. В результате проведенного исследования были впервые
количественно проанализированы популяции антител, синтезируемых
квадромой. Также впервые проведен анализ H-L состава квадромных
антител с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном
геле. Для БИАТ со специфичностью анти-ЭНД/ПХ убедительно
доказано наличие гомологичного предпочтения в одной из H-L пар и
случайную рекомбинацию в другой. Разработанные в настоящей работе
оригинальные экспериментальные подходы и теоретические модели
расширяют возможности анализа квадромных антител и механизмов,
управляющих образованием этих антител в квадромных клетках. Кроме
того, анализ аффинности БИАТ, образованных квадромой, показал, что
истинная аффинность любого антигенсвязывающего сайта БИАТ нашей
панели тождественна истинной аффинности соответствующих
антигенсвязывающих сайтов родительских антител.
Продемонстрировано отсутствие кооперативного эффекта при связывании БИАТ с антигенами. На панели бифункциональных антител показано, что избыток одного из антигенов не влияет на связывание (аффинность) БИАТ со вторым антигеном. Впервые продемонстрировано in vivo (на уровне тетрадом, синтезирующих антитела), что предпочтительная ассоциация гомологичных H-L цепей AT не приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов.
Впервые для оценки характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном использована модель, которая предполагает сравнительный анализ параметров связывания родительских моноклональных антител (могут связываться с иммобилизованным антигеном моновалентно и бивалентно) и бифункциональных моноклональных антител, несущих тождественный сайт связывания с антигеном (могут связываться с иммобилизованным антигеном только моновалентно). Характер взаимодействия антител с
иммобилизованным антигеном проанализирован как классическими методами (радиоиммунологическим и твердофазным ИФА), так и с помощью оптического биосенсора IAsys. Показано, что оба метода дают идентичные результаты. Сделан вывод о перспективности биосенсорных систем для оценки взаимодействия антиген-антитело.
Впервые проведен сравнительный анализ эффективности двух типов меченых молекул антител: антител, конъюгированньгх с пероксидазой хрена (традиционного конъюгата) и бифункциональных антител, несущих тождественный сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой хрена (БИАТ, как меченые молекулы часто называют конъюгатами нового поколения). Сделан вывод об относительной неэффективности БИАТ, как меченых молекул в твердофазных тестах. Доказано, что наиболее корректной моделью для оценки наличия (или отсутствия) бивалентного связывания МКА с иммобилизованным антигеном является сравнительный анализ ассоциации родительских МКА и соответствующего АГ-связывающего сайта БИАТ. Сделан вывод об относительной неэффективности БИАТ, как меченых молекул в твердофазных тестах. Полученные результаты могут представлять интерес для возможного использования этого нового класса биомолекул.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В настоящем обзоре мы кратко опишем историю создания БИАТ и области их применения, отсылая, в основном, к обзорным статьям, опубликованным за последние 10 лет. Относительно полно будут освещены только проблемы, которые составляют предмет наших исследований. Акцент будет сделан на моноклональных бифункциональных антителах, получаемых с использованием гибридомной технологии. Мы опишем методы получения клонов-продуцентов БИАТ, механизмы ассоциации L и Н цепей в гибридных гибридомах, механизмы взаимодействия антител с антигенами (включая антигены, иммобилизованные на твердой фазе) и применение БИАТ в качестве меченых антител в твердофазном ИФА.
