Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 9
1. Метаболизм липоевой кислоты и ее влияние на обмен веществ 9
2. Фармакологические эффекты препаратов липоевой кислоты (эспа-липона, берлитиона) 14
3. Механизмы повреждения печени и иммунологическая реактивность в условиях токсических гепатопатий 19
РАЗДЕЛ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 29
4. Материалы и методы исследования 29
5. Закономерности влияния эспа-липона на приобретенный и врожденный иммунитет 35
6. Иммуномодулирующие эффекты эспа-липона в условиях токсической гепатопатий 45
7. Влияние эспа-липона на репаративную регенерацию и функциональную активность гепатоцитов при экспериментальной патологии печени 54
8. Влияние эспа-липона на иммуномодулирующие, гепатопротектор-ные и регенеративные свойства спленоцитов и их фракций 65
9. Эффекты сочетанного введения эспа-липона и тиамина 78
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 80
ВЫВОДЫ. 89
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 91
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 92
- Метаболизм липоевой кислоты и ее влияние на обмен веществ
- Фармакологические эффекты препаратов липоевой кислоты (эспа-липона, берлитиона)
- Закономерности влияния эспа-липона на приобретенный и врожденный иммунитет
Введение к работе
Актуальность темы. В условиях патологии существенная роль в развитии и исходе заболевания принадлежит целостности клеточных мембран органов и тканей. Усиление свободно-радикальных процессов и пере-кисного окисления липидов (ПОЛ), ускорение образования гидроперекисных радикалов приводит к нарушению клеточных мембран и повышению их проницаемости. Вследствие этого усиливается выход в сосудистое русло компонентов цитоплазмы, клеточных органелл и продуктов нарушения метаболизма клеток. Некоторые из этих соединений (протеолитические ферменты, антипротеолитические белки, липопротеиды низкой и очень низкой плотности, глюкозаминогликаны, протеогликаны) обладают выраженной иммуномодулирующей активностью (Николаева И.Н., Яхонтов Ю.О.,1994,' Ласкова И.Л.,1995; Прокопенко Л.Г. и др.,1998; Brevini et al.,1993). Особенностью взаимосвязи патологии внутренних органов с функционированием иммунной системы является накопление в крови одновременно субстанций, обладающих как иммуносупрессорным, так и иммуностимулирующим воздействием (Конопля А.И.,1989; Барт Е.В.,1994; Иванова А.П.,1995).
Исходя из этого, возникает необходимость комплексного подхода в лечении различных патологических состояний, воздействуя как на патогенетическое звено развития заболевания - нарушение процессов перекисного окисления липидов и, как следствие, нарушение целостности клеточных мембран, так и устраняя последствия срыва иммунологического гомеостаза организма.
Принимая во внимание то, что нарушение иммунологических функций при многих видах патологии обусловлено дезорганизацией мембран клеток различных органов и тканей, иммуноцитов и клеток их микроокружения, есть основания ожидать, что выраженный иммуностимулирующий и репара-тивный эффект в этих условиях можно вызвать введением препаратов, регу- лирующих энергетический внутриклеточный обмен и обладающих антиокси-дантным эффектом. К числу таких соединений относится эспа-липон (альфа-липоевая кислота), применяющаяся в клинической практике исключительно для лечения диабетической полинейропатиии.
Цель работы: изучение иммунотропных и репаративных свойств эспа-липона в физиологических условиях и при экспериментальной патологии печени.
Задачи исследования:
Выявить влияние эспа-липона на выраженность гуморального иммунного ответа, гиперчувствительность замедленного типа и функциональную активность нейтрофилов в физиологических условиях.
Изучить иммуномодулирующие эффекты эспа-липона в условиях острой токсической гепатопатии различного генеза.
Установить роль спленоцитов в реализации иммуномодулирующих эффектов эспа-липона в физиологических условиях и при экспериментальной патологии печени.
Выяснить влияние эспа-липона на репаративную регенерацию и функциональную активность гепатоцитов в условиях экспериментального токсического поражения печени.
Изучить иммунокорригирующую и гепатопротекторную эффективность сочетанного введения эспа-липона с тиамином при патологии печени.
Основные положения, выносимые на защиту.
Эспа-липон (5 и 50 мг/кг) стимулирует развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцированных эритроцитами барана, повышает функциональную активность нейтрофилов периферической крови в физиологических условиях.
Эспа-липон (50 мг/кг) в условиях острого токсического поражения печени, вызванного различными по природе и механизму действия токсикантами, оказывает выраженный иммунокорригирующий эффект.
Введение эспа-липона (50 мг/кг) снижает выраженность биохимических синдромов поражения печени, процессов перекисного окисления ли-пидов и активирует репаративную регенерацию гепатоцитов в условиях острой тетрахлорметановой гепатопатии.
Эспа-липон стимулирует выделение прилипающими к стеклу спленоцитами гуморальных факторов, корригирующих иммунотропные и ге-патотропные эффекты токсикантов, а также стимулирующих процессы физиологической и репаративной регенерации гепатоцитов.
В условиях отравления индометацином комбинация эспа-липона с тиамином по иммунокорригирующей и гепатопротекторной активностям более эффективна, чем каждый из препаратов по отдельности.
Научная новизна. Показана высокая иммунокорригирующая активность эспа-липона в условиях нарушенной иммунной реактивности, индуцированной введением гепатотропных токсикантов. Экспериментально обоснована возможность коррекции эспа-липоном нарушений оксидантного и антиоксидантного статусов, функциональной активности гепатоцитов и стимуляции их репаративной регенерации при острой патологии печени.
Показана существенная роль изменений проницаемости клеточных мембран гепатоцитов в иммунокорригирующих и гепатопротекторных эффектах эспа-липона при патологии печени.
Получены данные о взаимодействии иммунокомпетентных клеток и гепатоцитов, углубляющие существующие представления о механизмах сохранения иммунного гомеостаза в условиях токсического поражения печени. Выявлена роль прилипающих к стеклу клеток селезенки и спленоцитарных цитокинов животных, получавших эспа-липон, в коррекции иммунных нарушений в условиях токсического поражения печени. Показана возможность усиления иммунокорригирующих и гепатопротекторных эффектов при использовании эспа-липона в комбинации с тиамином.
Практическая значимость. Установлены дозы, способы и схемы введения эспа-липона, приводящие к устойчивым иммуномодулирующим эффектам в условиях патологии, характеризующейся нарушением иммунной реактивности, что может быть использовано для профилактических и лечебных целей. Экспериментально выявлена перспектива использования эспа-липона для иммунокоррекции при токсических поражениях печени, вызванных различными по химической природе токсикантами.
Экспериментально доказана возможность применения эспа-липона в качестве иммуномодулятора, антиоксиданта и средства, активирующего ре-паративные процессы в печени в условиях токсической гепатопатии. Показана высокая эффективность сочетанного введения эспа-липона и тиамина при патологии печени.
Результаты работы используются в учебном процессе медицинских вузов (Воронеж, Самара, Иваново, Санкт-Петербург) и расширяют современные представления о закономерностях иммуномодулирующего, антиоксидантного и гепатопротекторного действия эспа-липона и его комбинации с тиамином в условиях патологии печени.
Материалы диссертации вошли в рабочие учебные программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях кафедр фармакологии, биохимии, клинической иммунологии и пропедевтики внутренних болезней КГМУ.
Апробация результатов работы. Основные положения диссертации обсуждены на научных конференциях Курского государственного медицинского университета (2002, 2004), Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2001, 2002), V Конгрессе аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) (Москва, 2002), IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002), совместном заседании кафедр фармакологии, биологической химии, микробиологии, пропедевтики внутренних болезней Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский го- сударственныи медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» (2003).
Публикации. Результаты проведенных исследований полностью отражены в 7 научных работах в центральной и местной печати, в которых содержится полный объем информации, касающейся темы диссертации.
Структура и объем работы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 205 источников на русском, и 61 - на иностранном языках.
Метаболизм липоевой кислоты и ее влияние на обмен веществ
Липоевая кислота является одним из самых молодых витаминов, так как история ее открытия связана с 1948 годом. На основании метаболических эффектов этого соединения в различных лабораториях оно получило самостоятельные названия: ацетат-замещающий фактор, фактор окисления пиру-вата, протоген, BR-фактор (Anuradha В.Р., 1999; Arend A. et al., 2000; Balakirev M., 2000; Arivazhagan P., 2001; Bilska A.L., 2002). Основными характеристиками данного соединения являются: устойчивость к действию протеолитических ферментов, легкая экстрагируемость и диализу емость из кислых сред, хорошая растворимость в низкополярных органических растворителях, натриевая соль липоевой кислоты хорошо растворяется в воде (Aguirre N., 1999; Androne L., 2000). Впервые альфа-липоевая кислота (а-ЛК) была выделена в кристаллическом виде из экстракта говяжьей печени в 1951 году группой ученых во главе с американским биохимиком Л. Ридом. Были выделены два вещества, обладавших высокой биологической активностью и получивших названия альфа- и бета-липоевых кислот. Позже выяснилось, что альфа-липоевая кислота представляет главную форму соединения, присутствующего в тканях, бета-липоевая кислота — это сульфоксид альфа-липоевой кислоты. В 1952 году была расшифрована структура альфа-липоевой кислоты, которая представляет собой 1,2-дитиолан-3-валериановук кислоту. Молекула альфа-липоевой кислоты состоит из 8-атомной углеродной цепи с двумя атомами серы. Альфа-липоевую кислоту, из-за сходства с жирной кислотой, часто называют тиоктовой кислотой («тио-» - означает соединение серы, а «-октовая кислота» - кислота с 8 атомами углерода). В молекуле этой кислоты был обнаружен один хиральный атом углерода и поэтому существует две энантиомерные формы. В лечебных целях используют рацемат М- и S- формы. Структурная формула альфа-липоевой кислоты представлена 5-членным гетероциклическим кольцом. При разрушении дисуль-фидного мостика внутри кольца образуется дигидролипоевая кислота. При растворении это соединение под действием света и кислорода легко полиме-ризуется. Деформация в 5-членном дисульфидом кольце обуславливает тесную корреляцию между химическим строением альфа-липоевой кислоты и ее биологической активностью (Bilska A.L., 2002). Липоевая кислота широко распространена в природе (растения, микроорганизмы), в основном, в связанной форме. Биосинтез ЛК может осуществляться не только в бактериях и растениях, но и в высших организмах. До настоящего времени почти нет сведений о механизмах биосинтеза ЛК. В организме находится в разных органах, особенно много ее в печени, почках, сердце. В опытах на кроликах и крысах показано, что липоевая кислота и ее амид, введенные внутрь, легко всасываются из кишечника, что вызывает резкое увеличение концентрации вводимых соединений в крови уже через 30 минут после начала опыта (Мар-риР.идр., 1994).
Неспецифические метаболические эффекты липоевой кислоты и ее производных на самых различных биологических объектах или в отдельных реакциях обусловлены высокой реакционной активностью обоих атомов серы, входящих в ее молекулу (Мецлер Д., 1980).
В соответствии с современным уровнем знаний, альфа-липоевая кислота (а-ЛК) по классификации относится к витаминоидам. По характеру биохимического действия приближается к витаминам группы В. Ориентировочная потребность для человека составляет 1-2 мг липоевой кислоты в сутки. В настоящее время вопрос является ли ЛК незаменимой для человека, остается открытым (Мецлер Д., 1980).
Фармакологические эффекты препаратов липоевой кислоты (эспа-липона, берлитиона)
Альфа - липоевая кислота (а-ЛК) является действующим началом таких лекарственных препаратов как: Эспа-липон (производитель Esparma, Германия), Берлитион ЗООЕД (Берлин-Хеми АГ, Германия) , «Тиогамма» («Верваг» Германия). Механизмы некоторых аспектов действия перечисленных лекарственных препаратов известны и хорошо изучены. По данным литературы, основными показаниями для терапевтического назначения препаратов а-ЛК являются: комплексное лечение сахарного диабета, полиневропатии различного генеза (диабетическая, алкогольная и др.), в качестве гиполи-пидемического средства, с целью профилактики и лечения атеросклероза, хронических гепатитов и циррозов печени, острых и хронических интоксикаций (Cakatay U. et al., 2000; Carr A.C., 2001). а-ЛК играет достаточно важную роль в утилизации углеводов и осуществлении нормального энергетического обмена. а-ЛК является коэнзимом ферментов, которые ускоряют окислительное декарбоксилирование а-кетокислот (пирувата, а-кетоглутарата, разветвленных а-кетокислот). Препарат активирует пируватдегидрогеназу и подавляет пируваткарбоксилазу. Под действием а-ЛК происходит усиление как окислительного, так и неокислительного распада глюкозы. При его применении повышается усвоение глюкозы за счет стимуляции ее транспорта. Кроме того, а-ЛК является высокоактивным антиоксидантом и снижает количество свободных радикалов, восстанавливает уровень АТФ, уменьшая, таким образом, дефицит энергии в тканях (Britton R.S., 1994; Chan А.С. et al., 1999). При различных формах сахарного диабета (СД) было обнаружено снижение уровня ЛК, которое расценивалось как один из патогенных факторов ухудшения клинической картины заболевания (Coleman M.D., Walker C.L., 2000). В ходе исследований установлено, что введение а-ЛК при СД II типа сопровождается увеличением чувствительности к инсулину. Эти данные хорошо согласуются с результатами многих экспериментальных работ, в которых было показано, что а-ЛК улучшает захват глюкозы и ее утилизацию (Coleman M.D., Walker C.L., 2000). Исследования последних лет позволяют предположить, что а-ЛК модулирует каскад реакций, запускаемый инсулином и активирует транспорт глюкозы. В экспериментах на животных показано, что в скелетной мышце, после длительного введения а-ЛК, транспорт глюкозы, стимулируемый инсулином, увеличивается на 30%.
При диабете, вследствие снижения липонеогенеза и одновременного увеличения липолиза, возрастает концентрация свободных жирных кислот и глицерина в сыворотке крови. Печень реагирует на это повышенным кетоге-незом с увеличением образования свободных жирных кислот. Кетоновые те" ла тормозят ферментные комплексы в митохондриях и в еще большей степени снижают превращение пирувата. В экспериментальных исследованиях было показано, что увеличение количества а-ЛК приводит к улучшению утилизации глюкозы и снижению кетонемии (Coleman M.D., Walker C.L., 2000).
Введение а-ЛК приводит к улучшению метаболизма при сахарном диабете следующим образом:
1. активизируется работа митохондриальных ферментов, участвующих в углеводном обмене;
2. ингибируется глюконеогенез, что способствует лучшей утили зации пирувата в цитратном цикле;
3. снижается кетогенез.
Что касается действия, направленного на освобождение организма от кетоновых тел, то, с одной стороны, при синтезе жирных кислот ди-гидролипоевая кислота частично замещает кофермент А, а с другой -снижает липолиз (Марри Р., и др., 1993). Таким образом, в присутствии ди-гидролипоевой кислоты, высвобождение жирных кислот снижается приблизительно на 50% (Марри Р., и др., 1993). Кроме того, а-ЛК подавляет непосредственно процессы кетогенеза, то есть образование ацетона и других кетонов, и глюкогенеза. Это способствует превращению и окислению глюкозы, следовательно, улучшению" глюкозы, следовательно, улучшению энергетического обмена и аксональ-ного транспорта, и нормализует нарушенный поток глюкозы непосредственно в ткани нервных волокон у больных сахарным диабетом, осложненным полинейропатией.
Закономерности влияния эспа-липона на приобретенный и врожденный иммунитет
Прежде, чем была изучена эффективность эспа-липона в условиях нарушения иммунной реактивности, мы исследовали его иммуномодулирую-щее действие на здоровых животных, для чего исследовано влияние препарата на формирование ГИО, индуцированного ЭБ, в дозах 5, 50 и 500 мг/кг массы тела при внутрибрюшинном и внутривенном способах введения препарата.
Установлено, что внутрибрюшинное десятикратное введение эспа-липона в дозе 5 мг/кг до иммунизации приводит к незначительному, но статистически достоверному повышению иммунных АОК и РОК в селезенке опытных животных (таблица 1). Доза 50 мг/кг привела к резко выраженной стимуляции гуморального иммунного ответа на ЭБ (количество иммунных АОК и РОК в селезенке этой группы животных было существенно выше, чем в контроле). Применение препарата в дозе 500 мг/кг в наших экспериментах вызвало гибель 100% экспериментальных животных на 2-3-й день введения эспа-липона, что можно объяснить его токсическим эффектом в указанной дозе.
Эффекты эспа-липона в отношении ГИО при внутривенном способе введения практически не отличались от таковых при внутрибрюшинном способе (таблица 2), поэтому в дальнейших исследованиях нами был использован менее трудоемкий способ внутрибрюшинного введения препарата.
Далее нами было изучено влияние эспа-липона на формирование ГИО при десятидневном введении препарата до и после иммунизации ЭБ. Выявлено, что эспа-липон, введенный согласно данной схемы в дозе 5 мг/кг не влиял, а в дозе 50 мг/кг - стимулировал иммунологическую реактивность, индуцированную ЭБ (таблица 1). Большой интерес представлял вопрос о сравнительных иммуномодуч жирующих эффектах эспа-липона и препарата сравнения, в качестве которого нами был избран тиамин - соединение, иммуномодулирующие дозозависимые эффекты которого являются хорошо изученными, в том числе в нашей лаборатории (Конопля А.И., 1978; Прокопенко Л.Г. и др., 1999).
Установлено, что в дозе 50 мг/кг эспа-липон при любом использованном режиме введения не только не уступал в иммуностимулирующем эффекте препарату сравнения - тиамину, но даже превосходил его (таблица 1, рисунок 1).
Таким образом, нами было выявлено, что наиболее выраженное повышение развития гуморального иммунного ответа наблюдается при внутрибрюшинном пятикратном введении препарата в дозе 50 мг/кг до иммунизации или при десятикратном введении до и после антигена.
Для оценки влияния препарата на клеточный иммунный ответ обычно используют реакцию гиперчувствительности замедленного типа (Хаитов Р.М. и др., 2000), которая опосредована, в основном, Т-лимфоцитами, их продуктами - цитокинами и привлеченными в качестве эффекторных клеток макрофагами (Фрейдлин И.С. и др., 2001). Кроме того, ГЗТ представляет собой иммунное воспаление - эффекторную фазу специфического клеточного иммунного ответа (Фрейдлин И.С и др., 2001). При исследовании влияния эспа-липона на развитие ГЗТ было установлено, что при внутрибрюшинном введении препарата в дозе 5 мг/кг как до, так до и после сенсибилизации ЭБ, усиления формирования ГЗТ у животных не происходит, а его применение в дозе 50 мг/кг при тех же режимах вызывает выраженную стимуляцию развития ГЗТ, о чем свидетельствует увеличение РМ и РК регионального и кон-тралатерального лимфатических узлов по сравнению с контрольными группами животных, соответственно, в 2,0 и 1,6 раза по сравнению с контролем (рисунки 1 и 2).
