Введение к работе
Актуальность проблемы.
Моноклональные антитела (мкАт) и их фрагменты широко используются как в качестве компонентов диагностических тест-систем, так и в виде лекарственных препаратов. Постоянному расширению их применения в значительной степени способствует всестороннее исследование структуры и свойств мкАт (Ed. A. Padlan, 1994), а также комплексов мкАт-антиген (R. М. MacCallum и соавт., 1996).
Накопление новых знаний о структуре мкАт требует соответствующего переосмысления и углубления биофизического и физико-химического понимания процессов взаимодействия мкАт с антигенами. В общем виде современное представление о процессе взаимодействия было изложено отечественной биофизической школой еще в 6СН-70-Х годах (М. В. Волькенштейн, 1981). Однако, кроме чисто теоретических аспектов, оно не нашло в то время применения и не получило в нашей стране дальнейшего развития. В настоящее время под взаимодействием, при общем его рассмотрении, понимают энергетически выгодное сближение стерически и электростатически комплементарных поверхностей, находящихся в строго определенном конформационном состоянии. Последнее, в свою очередь, определяется взаимодействием соответствующей физико-химической пространственной структуры с водной средой. При детальном рассмотрении процесса взаимодействия, его динамики, необходимо также учитывать и индуцирование стерическог о и электростатического соответствия, т.е. взаимное влияние при сближении взаимодействующих компонентов и прилегающих к ним молекул водной среды (молекул воды и ионов).
При взаимодействии комплементарные эпитоп антигена и паратоп антитела притягивают друг друга на расстоянии в несколько нанометров и вступают в первичное связывание. Первичное связывание эпитоп-паратоп переходит к окончательному, обычно более сильному, вторичному связыванию в результате многоэтапного процесса. Энергия первичного связывания антиген-антитело может быть измерена по изменению энергии системы, достаточном для того, чтобы предотвратить связывание антитела с антигеном. Энергию вторичного связывания антиген-антитело можно считать эквивалентной энергии, которая необходима для диссоциации комплекса аіггиген-антитело. Методически трудно
определить, где заканчивается первичное связывание антигена с антителом и начинается вторичное (van Oss С. J., 1995).
В значительной мере эти трудности преодолеваются с помощью метода изотермической титрационной микрокалориметрии. Этот метод позволяет в одном дшимическом эксперименте непосредственно измерить тепловые эффекты взаимодействия мкАт-антигеп, рассчитать вклад термодинамических компонент в свободную энергию взаимодействия, оценить роль тех или иных сил в этом взаимодействии и образующиеся связи между взаимодействующими молекулами (D. R. Bundle, В. W. Sigurskjold, 1994). Важность расчета свободной энергии связывания заключается в том, что она, как термодинамический параметр, определяет течение процессов в системах с постоянной температурой и постоянным давлением. Именно таким системам, в наибольшей степени, соответствуют биологические системы. Система с постоянными температурой и давлением моделируется в рабочей ячейке изотермического титрационного микрокалориметра. Следовательно, метод изотермической титрационной микрокалориметрии является одним из немногих методов прямого изучения тонких механизмов и детальной энергетики процесса взаимодействия (I. Jclesarov и соавт., 1996).
В последнее время сформулированы также теоретические концепции по общим принципам функционирования белковых молекул, как кибернетических элементов живых клеток. По современным представлениям для функционирования белковых контуров биологических систем необходимо два типа зависимостей "вход-выход": гиперболическая и сигмоидальная (D. Вгау, 1995). Для молекулы иммуноглобулина "сигналом на входе" можно считать общую молярную концентрацию конкретного антигена, а "сигналом на выходе" является, по своей сути, тепловой эффект при изотермическом титровании (G. Bains, Е. Ггеіге, 1991).
Гетерогенный иммуноферментный анализ (ИФА) связывания мкАт со специфическими антигенами и их структурными аналогами, в сочетании с точечным мутагенезом в антигенсвязывающем центре молекулы мкАт, позволяет качественно оценить влияние тех или иных групп атомов, как паратопа мкАт, так и эпитопа антигена, на связывание антиген-мкАт. В сочетании с изотермической титрационной микрокалориметрией можно оценить это влияние и количественно. Проведение точечного мутагенеза в антигенсвязывающем центре мкАт позволило повысить (в 1230 раз) константу
аффинности, за счет снижения константы скорости диссоциации (но не ассоциации), только в самое последнее время (R. Schier и соавт., 1996).
Однако, несмотря на огромный экспериментальный материал и оригинальные теоретические разработки, многие аспекты структурных и функциональных свойств молекулы мкАт остаются неясными.
Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы состоит в изучении иммунохимических и термодинамических свойств мышиных моноклональных антител к низкомолекулярным антигенам для оптимизации их использования в диагностических тест-системах и в качестве детоксицирутощих медицинских препаратов.
В соответствии с намеченной целью в процессе работы предполагалось решение следующих задач:
-
Разработать комплекс иммунохимических и термодинамических методов исследования тонких механизмов и детальной энергетики взаимодействия мышиных моноклональных антител с низкомолекулярными антигенами.
-
Исследовать процесс специфического взаимодействия антитеофиллиновых мышиных мкАт 2G3, изотип IgG2ot, с теофиллином, который широко применяется при лечении бронхиальной астмы (М. Weinberger, L. Hendeles, 1996).
-
Исследовать процесс специфического взаимодействия антидигоксиповых мышиных мкАт D18, изотип IgGl, и D22, изотип IgGl, с дигоксином, который широко применяется при лечении хронической сердечной недостаточности (The Digitalis Investigation Group, 1997).
-
Разработать подходы к оптимизации использования охарактеризованных термодинамически и иммунохимически мкАт при конструировании диагностических тест-систем и при создании детоксицирующих медицинских препаратов.
Научная новизна.
Проведены исследования всего комплекса тепловых процессов, сопровождающих взаимодействие мышиных мкАт с ннзкомолекулярными антигенами, для мышиных мкАт
двух изотипов, IgGl и IgG2cc, и для двух разных по химической структуре и физико-химическим свойствам низкомолекулярных антигенов, дигоксина и теофиллина.
Выявлены и представлены кинетическими моделями три различных механизма взаимодействия мышиных мкАт с низкомолекулярными антигенами: связывание по двум центрам (мкАт 2G3 с теофиллином), связывание по кривой Хилла с коэффициентом положительной кооперативное, равным 2.56 ± 0.16 (мкАт D18 с днгоксином); линейно регрессионное связывание с образованием слабодиссоциирующего комплекса (мкАт D22 с дигоксином).
Обнаружено, что взаимодействие мкАт с низкомолекулярными антигенами представляет собой два процесса: собственно связывание низкомолекулярного антигена с антигенсвязывающим центром мкАт и конформационные изменения молекулы мкАт, которые индуцированы связыванием одного из антигенсвязывающих центров с низкомолекулярным антигеном.
Показано, что наблюдаемая в гетерогенном ИФА температурная зависимость эффекта усиления связывания мкАт с иммобилизованным антигеном при повышении концентрации свободного антигена ("hook-эффект") определяется направлением теплового процесса, отражающего конформационные изменения молекулы мкАт, которые индуцированы связыванием одного из антигенсвязывающих центров молекулы мкАт с низкомолекулярным антигеном.
Впервые на экспериментальном материале выявлено возможное функциональное значение наличия у молекулы мышиного мкАт класса G двух одинаковых антигенсвязывающих центров.
Практическая значимость.
Проведенные исследования позволили дать конкретные рекомендации относительно того, какие из мкАт к низкомолекулярным антигенам являются более пригодными по своим термодинамическим и иммунохимическим особенностям для разработки диагностических тест-систем, а какие - для разработки детоксицирующих препаратов.
Выявленные термодинамические и иммунохимические особенности мышиных мкАт значительно облегчили разработку иммуноферментной тест-системы для определения концентрации дигоксина и способствовали проведению лабораторных испытаний
медицинского препарата для снятия токсических эффектов высоких концентраций дигоксина.
Положения, выносимые на защиту:
-
Современный комплекс иммунохимических и термодинамических методов исследования динамического процесса взаимодействия мкАт с низкомолекулярными антигенами.
-
Детальный механизм и тонкая энергетика процесса образования иммунного комплекса антиген-антитело.
-
Оптимальное использование иммунохимических и термодинамических особенностей мкАт при разработке диагностических тест-систем и при создании детоксицирующих препаратов.
Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы и 1 принята к печати. Материалы диссертации представлялись на 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических иммунологов, г.Москва, 1997 г.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, указатель цитируемой литературы. Содержит 8 таблиц и 28 рисунков. Библиография состоит из 198 наименований.
