Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Заместительная почечная терапия гемодиализом при хронической болезни почек 5 стадии 14
1.2. Состояние иммунной системы у пациентов на гемодиализе 22
1.3. Состояние свертывающей системы крови пациентов на гемодиализе 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Дизайн исследования и клиническая характеристика обследованных пациентов 40
2.1.1. Характеристика больных с ХБП на ПГД без тромбозов АВФ в анамнезе 41
2.1.2. Характеристика больных с ХБП на ПГД с тромбозами АВФ в анамнезе 42
2.2. Методы исследования 44
2.2.1. Гематологические исследования 44
2.2.2. Биохимические методы исследования 44
2.2.3. Исследование электролитного состава крови 44
2.2.4. Исследование системы гемостаза 44
2.2.5. Определение концентрации высоко чувствительного С-реактивного белка 46
2.2.6. Иммунофенотипирование лимфоцитов 46
2.2.7. Определение иммуноглобулинов A, M, G методом ТИФА 48
2.2.8. Определение уровней цитокинов методом ТИФА 50
2.2.9. Генотипирование SNP полиморфизмов 52
2.3. Статистический анализ 57
Глава 3. Результаты исследования 58
3.1 Клинико-лабораторные показатели пациентов с ХБП, получающих лечение программным гемодиализом 58
3.1.1. Оценка показателей общего анализа крови 58
3.1.2. Изучение биохимических показателей сыворотки крови 63
3.2. Исследование показателей состояния свертывающей системы крови 67
3.2.1. Оценка показателей коагулограммы 67
3.3. Исследование показателей состояния иммунной системы 70
3.3.1. Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов в крови 70
3.3.2. Оценка гуморального звена иммунитета 72
3.3.3. Оценка уровня цитокинов в сыворотке крови 75
3.4. Молекулярно-генетический анализ распределения аллельных вариантов мутаций генов 78
3.4.1. Исследование полиморфизма промоторных участков генов ключевых цитокинов 78
3.4.2. Исследование полиморфизма промоторных участков генов свертывающей системы 83
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 90
Заключение 102
Выводы 104
Практические рекомендации 106
Список литературы 1088
- Состояние иммунной системы у пациентов на гемодиализе
- Состояние свертывающей системы крови пациентов на гемодиализе
- Исследование электролитного состава крови
- Оценка показателей общего анализа крови
Введение к работе
Актуальность темы и степень ее разработанности
Хроническая болезнь почек (ХБП) является распространенным заболеванием среди хронических неинфекционных болезней и в терминальной стадии приводит к необходимости применения дорогостоящих методов заместительной почечной терапии – диализа и пересадки почки (Смирнов А.В., Шилов Е.М., 2012). В настоящее время сотни тысяч больных, страдающих хронической болезнью почек, находятся на лечении различными видами заместительной почечной терапии (Беляев А. Ю., Кудрявцева Е.С., 2007). Программный гемодиализ (ПГД) (четырехчасовые процедуры 3-4 раза в неделю) остается основным видом заместительной почечной терапии не только в России, но и во всем мире (Михеева Ю.С., Румянцев А.Ш., 2003; Chazot C., Ok E., 2013).
Терапия гемодиализом требует особого внимания к формированию сосудистого доступа (Letachowicz K., Weyde W., 2010; Gilpin V., Nichols W.K., 2010). Обеспечение оптимального функционирования сосудистого доступа для гемодиализа является серьезной проблемой для нефрологов, сосудистых хирургов и самих пациентов (Chuang Y.C., Chen J.B., 2003; Diskin C.J., Stokes T.J., 2008).
Наиболее частым осложнением со стороны сосудистого доступа, являются тромбозы артериовенозной фистулы (АВФ) (Kapun S., Zibar L., 2008; Chou C.Y., Chen J.Y., 2010). Для больных ХБП, находящихся на лечении программным гемодиализом, большую опасность представляют рецидивы тромбозов сосудистого доступа, которые в конечном итоге могут приводить к невозможности дальнейшего проведения процедуры гемодиализа и являются важнейшей причиной госпитализации и, в конечном счете, высокой летальности данного контингента больных (Козлова Т.В., 2006; Шерегова Е.Н., 2008).
Причиной развития тромбозов сосудистого доступа могут быть нарушения в свертывающей системе крови, расположение АВФ, наличие стенозов и аневризм. Однако нередко тромбоз сосудистого доступа возникает без очевидных причин, что предполагает актуальность исследований, направленных на выявление дополнительных факторов внутрисосудистого тромбообразования в сосудистом доступе (Шило В. Ю., Денисов А.Ю., 2005).
Вместе с тем, известно, что у пациентов с ХБП наблюдаются иммунопатологические состояния, приводящие к нарушению иммунорезистентности и дисбалансу цитокиновой регуляции (Гумилевская О.П., 2009). Известно, что гемодиализ инициирует воспалительную реакцию за счет влияния на клетки крови и модификации белков диализными мембранами. Это приводит к поддержанию хронического воспаления (Cohen S.D., Phillips T.M., 2010; Кузник Б.И., 2013), что на фоне измененного состояния иммунной системы может привести к еще более выраженному изменению состояния цитокиновой сети и как следствие дестабилизации коагуляционного потенциала с развитием тромбозов сосудистого доступа (Ozkok A., Aktas E., 2013). Вероятность развития тромбоза сосудистого доступа при таких условиях во многом может определяться индивидуальными, генетически обусловленными особенностями продукции, как факторов свертывания, так и молекул, участвующих в активации всей свертывающей системы в целом.
Следует отметить, что взаимное влияние иммунной и свертывающей систем на фоне системного воспаления, обусловленного уремией, недостаточно изучено. Вместе с тем нет надежных иммуногенетических и лабораторных критериев, на основе которых можно было бы прогнозировать возможные осложнения (тромбозы артериовенозных фистул) у пациентов, находящихся на программном гемодиализе. Таким образом, представляется актуальным комплексное исследование возможных причин дисфункции артериовенозных фистул и факторов тромбообразования, которые позволят улучшить показатели выживаемости сосудистых доступов у пациентов на гемодиализе, и в целом повысят эффективность заместительной почечной терапии.
Цель исследования
Цель настоящей работы состояла в выявлении факторов риска тромбозов артериовенозной фистулы на основе комплексной оценки клинико-лабораторных, генетических и иммунологических параметров для оптимизации диагностики и лечения пациентов с хронической болезнью почек, получающих программный гемодиализ.
Задачи исследования
-
Определить особенности биохимических показателей крови и коагуляционного потенциала пациентов с ХБП, находящихся на гемодиализе.
-
Оценить состояние иммунной системы пациентов с ХБП, получающих программный гемодиализ в зависимости от развития тромбозов АВФ.
-
Определить вклад SNP мутаций промоторных участков генов цитокинов (IL-1, IL-6, IL-10, TNF-) в риск развития тромбоза фистул у пациентов с ХБП, получающих программный гемодиализ.
-
Изучить распределение аллельных вариантов SNP мутаций генов факторов свертываемости крови (протромбин, фактор Ляйдена, фибриноген, метилтетрагидрофолатредуктаза, ингибитор активатора плазминогена, интегрин бета-3) у пациентов с ХБП, получающих программный гемодиализ в зависимости от развития тромбоза сосудистого доступа.
-
Выявить предикторы риска тромбоза сосудистого доступа и разработать алгоритм клинико-диагностического обследования пациентов с ХБП для прогноза тромботических осложнений.
Научная новизна
Впервые выявлены факторы риска развития тромбозов артериовенозной фистулы у пациентов с ХБП, получающих программный гемодиализ, на основе комплексной оценки биохимических, коагулологических, иммунологических, генетических показателей.
Установлено, что предрасположенность к тромбозам сосудистого доступа у пациентов 5 стадией хронической болезни почек, получающих программный гемодиализ, обусловлена сопряженностью между сдвигом коагуляционного баланса и гиперцитокинемией на фоне хронического воспаления.
Показано влияние генетической детерминированности полиморфизмов генов ключевых цитокинов и генов свертывающей системы на состояние коагуляционного потенциала и на предрасположенность к тромбозам сосудистого доступа у пациентов с ХБП на программном гемодиализе.
Теоретическая и практическая значимость работы
На основании проведенного комплексного анализа общеклинических, иммунологических, генетических факторов, разработан клинико-диагностический алгоритм прогноза развития тромботических осложнений сосудистого доступа у больных ХБП, находящихся на лечении программным гемодиализом.
Диагностический алгоритм позволит оценить риск развития АВФ и индивидуализировать терапию, вследствие чего увеличится продолжительность и качество жизни пациентов с ХБП, находящихся на лечении программным гемодиализом.
Результаты исследования могут быть использованы в практической деятельности врачей клинической лабораторной диагностики, нефрологов, иммунологов и терапевтов при проведении программного гемодиализа у пациентов с ХПБ 5 стадии, а также при профилактике тромбоза артериовенозной фистулы.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Доказано, что осложнения в виде тромбоза сосудистого доступа у пациентов с ХБП, получающих программный гемодиализ, определяются нарушением коагуляционного баланса, возникающим под действием гиперцитокинемии (IL-6, IL-10, IFN-), высокого уровня белков острой фазы (СРБ, фибриноген) и сывороточных иммуноглобулинов (Ig A, Ig G), вследствие хронического воспаления на фоне применяемого лечения и иммунопатологического состояния из-за основного заболевания.
-
Установлено что, индивидуальные особенности синтеза цитокинов могут увеличивать активность воспаления и привести к гиперактивации системы свертывания крови с последующим развитием тромбоза сосудистого доступа. Генетические особенности функционирования факторов свертывания могут усиливать сдвиги коагуляционного баланса, возникшие под действием хронического воспаления у таких пациентов.
-
Доказана роль иммуногенетической детерминированности развития тромботических осложнений сосудистого доступа, связанная с набором аллельных вариантов генов IL-10 в позиции -1082 и IL-6 в позиции -174.
-
Выявлена роль мутаций в генах факторов системы гемостаза FGB в позиции -455, F2 в позиции -2021, способствующая развитию тромбозов АВФ.
Объекты исследования. Пациенты с хронической болезнью почек пятой стадии, получающие лечение программным гемодиализом, с рецидивирующими тромбозами артериовенозных фистул; пациенты с хронической болезнью почек пятой стадии, получающие лечение программным гемодиализом, без тромботических осложнений терапии.
Предмет исследования. Состояние системы гемостаза, иммунной системы и аллельный полиморфизм генов, определяющих функционирование этих систем у пациентов, получающих лечение программным гемодиализом, в зависимости от развития тромботических осложнений терапии.
Методология исследования. Планирование работы и полученные практические результаты согласуются с принципами доказательной медицины. Экспериментальная часть работы проводилась с соблюдением всех правил научных исследований и основывалась на принципах биоэтики.
Теоретическая и методологическая основа исследования состояла в поиске и анализе фундаментальных и прикладных исследований отечественных и зарубежных авторов по изучаемой проблеме, подтверждающих предположение о связи иммунных, генетических и коагулологических механизмов в развитии тромбозов АВФ. Экспериментальная часть была посвящена подтверждению этого предположения, основываясь на результатах собственных исследований. Выводы основаны на данных, полученных в результате лабораторных исследований и последующей обработки методами статистического анализа.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
В соответствии с формулой специальности 14.03.10 – «Клиническая лабораторная диагностика» (медицинские науки), представленная Вахания К.П. диссертационная работа является прикладным исследованием комплексной оценки риска развития тромбозов артериовенозных фистул пациентов с хронической болезнью почек, получающих гемодиализ. Доказана связь тромботического осложнения сосудистого доступа с сывороточными уровнями цитокинов (IL-6, IL-10, TNF-, IFN-), мутациями в генах системы гемостаза (FGB в позиции -455, F2 в позиции -20210) и цитокинов (IL-10 в позиции -1082 и IL-6 в позиции -174). Определен алгоритм ранней диагностики развития тромбозов сосудистого доступа для снижения частоты развития тромботических осложнений и улучшению качества жизни пациентов с ХБП, получающих терапию гемодиализом.
Соответствие диссертации области исследования
Область диссертационного исследования Вахания К.П. включает совершенствование диагностики факторов риска развития тромбозов сосудистого доступа на основе комплексной оценки лабораторных показателей для оптимизации терапии гемодиализом и повышения качества проводимой заместительной почечной терапии и соответствует п.п. 1, 3, 4 паспорта специальности – лабораторные исследования для диагностики и функциональной диагностики заболеваний, характеристики тяжести, периода и срока болезни, прогноза, контроля за лечением и его результатами; морфологические (цитологические) исследования биоматериала; иммунологические исследования) паспорта специальности 14.03.10 – Клиническая лабораторная диагностика.
Личный вклад автора
Автором проведен анализ большого количества отечественных и зарубежных источников литературы по теме исследования. При непосредственном участии автора проведено планирование экспериментальной части работы, выбор методов и проведение клинических и лабораторных исследований, выполненных на базе кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом КЛД ФУВ ВолгГМУ и Волгоградского областного уронефрологического центра. Автором лично проведено обследование 104 пациентов с ХБП, получающих программный гемодиализ. Автором выполнен анализ полученных результатов исследований, их статистическая обработка и описание. Личный вклад автора в проведенное исследование более 90%. Автором самостоятельно написан текст диссертации и автореферата.
Реализация результатов работы
Разработанный алгоритм прогноза риска развития тромбозов артериовенозной фистулы при проведении программного гемодиализа используется при лечении пациентов с хронической болезнью почек пятой стадии в ГБУЗ «Волгоградский областной уронефрологический центр». Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре клинической лабораторной диагностики с курсом КЛД ФУВ и кафедры урологии, нефрологии и трансплантологии ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета. По результатам исследования оформляется заявка на изобретение «Способ прогноза развития тромбозов артериовенозной фистулы при лечении программным гемодиализом» (2014 г.) в Федеральный Институт промышленной собственности Российского агентства по патентам и товарным знакам. Выпущены методические рекомендации для практических врачей «Оценка риска развития тромбозов артериовенозной фистулы у пациентов на программном гемодиализе».
Апробация диссертации
Результаты работы были представлены на 67-й научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Волгоград, 2009 (доклад); 70-й научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Волгоград, 2012; XVII Региональной конференции молодых исследователей волгоградской области, Волгоград, 2012 (доклад); 71-й научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Волгоград, 2012; VI съезд иммунологов России – Объединенный иммунологический форум, Нижний Новгород, 2013 (стендовый доклад). В рамках настоящей диссертационной работы, подготовлен проект «Создание и внедрение алгоритма лабораторной диагностики больных терминальной хронической почечной недостаточностью, находящихся на программном гемодиализе» на выполнение НИОКР, выигравший грант Фонда содействия малых форм предприятий в научно-технической сфере «У.М.Н.И.К.», договор № У-17, от 13.12.2010 года.
Апробация диссертации проведена на расширенном заседании кафедр молекулярной биологии и генетики; урологии, нефрологии и трансплантологии ФУВ; иммунологии и аллергологии; клинической лабораторной диагностики с курсом КЛД ФУВ ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ (протокол № 9 от 28 февраля 2014 года).
Диссертационное исследование одобрено Региональным независимым этическим комитетом 19.02.2011 г., протокол № 127-2011.
Публикации по теме диссертации: Опубликовано 11 печатных работ, из них 4 публикации в научных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК и 1 методическая рекомендация.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 рисунками и 15 таблицами, одной схемой. Список источников цитируемой литературы включает 208 работ, из которых 66 отечественных и 142 зарубежных публикации.
Состояние иммунной системы у пациентов на гемодиализе
Патогенез многих заболеваний, таких как ревматоидный артрит, бронхиальная астма и аллергический ринит, гепатиты, болезни почек связан с дисфункциями в иммунной системе организма (Горячкина Л.А, Кашкин К.П., 2009; Чемерис Н.А., 2005; Шпоть Е.В., 2005; Собчак Д.В., 2007).
Классически, гломерулонефрит, являющийся общей причиной ХБП 5 стадии, считается опосредованным иммунной системой, в то время как другие формы повреждения почек часто описывается как не иммунные. В обоих обстоятельствах иммунная система реагирует либо на родственный антиген (как в случае гломерулонефрита), либо на повреждение ткани, включая текущий воспалительный ответ (Lee V.W., Wang Y.M., 2008). Несмотря на многообразие этиологических причин, морфологические изменения в почках при выраженной ХБП однотипны. Они сводятся к преобладанию фибропластических процессов в интерстиции и замещением более 80% массы действующих нефронов соединительной тканью, гипертрофии оставшихся нефронов и утрате морфологического своеобразия исходного процесса. Это приводит к исчерпыванию компенсаторных возможностей организма и отсутствия должного эффекта консервативной терапии (Тарасов Е.О., 2005). В патогенезе ХБП 5 стадии имеют значение нарушения водно-электролитного, кислотно-основного, липидного, белкового, углеводного обменов, кроветворения, гемостаза, терморегуляции, гормональной регуляции, гемодинамики, развитие гипоксии, эндогенной интоксикации (Сигитова О.Н., 2008). У пациентов с ХБП отмечается нарушение иммунной функции, которая строго коррелирует с нарушением иммунной реактивности клетки и измененной экспрессией рецепторов клеточной поверхности. Эти нарушения вызваны нарушением выделительной функции почек и накоплением уремических токсинов (Rysz J., Banach M., 2006; Girndt M., 2012). Пациенты с ХБП имеют признаки нестабильности генома и, как следствие, многочисленные генетические повреждения, возможно, вследствие накопления уремический токсинов, окислительный стресса и других эндогенных веществ с генотоксическими свойствами (Rangel-Lpez A., Paniagua-Medina M.E., 2013). Отсутствие прогностических критериев не всегда позволяет в ранние сроки определить степень и характер угнетения иммунной системы и скорректировать проводимую медикаментозную терапию с включением методов экстракорпоральной детоксикации и патогенетической иммунотропной терапии (Тарасов Е.О., 2005). Для поддержания жизни таких пациентов используется перитонеальный диализ и гемодиализ, приводящий к вымыванию биологически активных веществ, в том числе и иммунного характера, сопровождается гемотрансфузиями, приводящими к изосенсибилизации. Это приводит к формированию иммунопатологических состояний, манифестирующих в виде хронических вирусных и бактериальных инфекций (Гумилевская О.П., 2009). У больных ХБП отмечается дисфункция клеточного и гуморального звеньев иммунной системы, являющаяся следствием уремии (Betjes M.G., 2013). Выявляемый иммунодефицит вызывает активацию большинства иммунокомпетентных клеток, и роль хронической уремии и диализа в этом процессе недостаточно ясна (Malaponte G., Bevelacqua V., 2002). Изменения иммунной системы при ХБП составляют сложный вопрос. С одной стороны, увеличенная продукция является характерной чертой уремии, вероятно, из-за накопления провоспалительных цитокинов, как следствие снижения почечной элиминации. С другой стороны, уремия связана с иммуносупрессией из-за воздействия на уремическую среду и влечет сопутствующие расстройства, происходящие на иммунокомпетентных клетках (Kato S., Chmielewski M., 2008). Показано неоднозначное влияние ХБП на клеточное и гуморальное звенья иммунной системы, а также на систему провоспалительных цитокинов (Alvarez-Lara M.A., Carracedo J., 2004). Количественное содержание иммуноглобулинов служит основным показателем состояния гуморального иммунитета, и знание этого параметра необходимо для оценки функциональной полноценности иммунной системы и диагностики патологических нарушений её работы (Майоров Р.В., Нусинов Е.В., 2012). У пациентов с ХБП показаны клинические признаки дефекта иммунной системы, характеризующиеся повышенной восприимчивости к инфекциям и снижением иммунного ответа Т-клеток (Ильин А.П., Богоявленский В.Ф., 2002; Vrabie C.D., Petrescu A., 2009). Точные механизмы, ответственные за этот дефект иммунной системы неизвестны, однако, изменения в субпопуляции Т-клеток и/или функций могут внести существенный вклад в нарушение клеточного иммунного ответа, потому что ХБП связана с лимфопенией, происходящих в отсеке Т и B лимфоцитов. Имеющиеся данные о функции B клеток у пациентов с ХБП, не указывают на нарушение функции. Функциональные данные о периферических Т-клетках у пациентов с ХБП являются противоречивыми и получены с использованием большей части нефракционированных циркулирующих Т-клеток (Litjens N.H., Huisman M., 2008). При уремии наблюдается уменьшение общего числа Т-лимфоцитов и дисбаланс в соотношении Th1/Th2 Т-лимфоцитов. При уремии наблюдается снижение в количественном соотношении Th1 лимфоцитов в результате высокого уровня апоптоза (Alvarez-Lara M.A., Carracedo J., 2004). Другими учеными отмечено, что увеличенный уровень IL-12 приводит к сдвигу в дифференцировке Т-лимфоцитов в сторону Th1, тогда как количество Th2 клеток не подвергается этому влиянию (Sester U., Sester M., 2000).
Состояние свертывающей системы крови пациентов на гемодиализе
У пациентов на гемодиализе происходят сложные нарушения коагуляции, начиная от кровотечения до тромбозов (Rios D.R., Carvalho M.d., 2010). С одной стороны тенденция к кровотечениям у этих пациентов, прежде всего, основана на функциональных отклонениях тромбоцитов и дефектном прилипании к стенке сосуда. С другой стороны множество отклонений коагуляции способствуют восприимчивости к тромбозам (M. Smits J.H., van der Linden J., 2000; Goluza E., Topalovi M.G., 2011). Изучение молекулярных механизмов тромбообразования и противосвертывающей системы позволяет с уверенностью говорить о том, что существуют наследуемые, а иногда и приобретенные в процессе жизни дефекты белков, которые и обуславливают предрасположенность того или иного человека к тромбообразованию (Додохова М.А., Долгов В.В., 2009).
Доказано, что тромбофилия играет важную роль в выживании сосудистых доступов и увеличивают риск развития тромботических осложнений у пациентов на гемодиализе (Klamroth R., Orlovic M., 2013). На фоне частых нарушений коагуляции, тромбофилии и женский пол предрасполагают пациентов с ХБП к недостаточности сосудистого доступа, в основном за счет тромбоза или стеноза (Salmela B., Hartman J., 2013). 5 летнее ретроспективное исследование опыта формирования АВФ и ССП у пациентов на постоянном гемодиализе показало, что частой причиной для хирургических вмешательств является тромбоз АВФ и составляет 40,1% (Вторенко Е.К., Кудрявцева Е.С., 2007). Характерными признаками хронической болезни почек являются геморрагический диатез и склонность к тромбообразованию. Патогенез кровоточивости при уремии связан с нарушением тромбоцитарного звена гемостаза. Количество тромбоцитов может быть несколько сниженным, при этом ускорен процесс возникновения и распада тромбоцитов. Снижение адгезии тромбоцитов к субэндотелию сосудистой стенки обусловлено редукцией GPIb и изменением пространственной структуры рецепторов GPIIb/IIIa. Нарушение адгезии и агрегации тромбоцитов вызвано уремическими токсинами, повышенной выработкой оксида азота тромбоцитами, простогландином I2, кальцием, а также почечной анемией (Hrl W.H., 2006). В России за 2009 г. частота тромбозов составила 9,6% (Бикбов Б.Т., Томилина Н.А., 2011По данным зарубежных источников частым осложнением является аневризма аорты (51%), хотя другие авторы отмечают преимущество тромбозов АВФ (Derakhshanfar A., Gholyaf M., 2009). По литературным данным, частота тромбозов АВФ - от 4 до 16% и ССП - от 25 до 80% ежегодно. Проанализирован 11-летний опыт наложения артериовенозных фистул для проведения программного гемодиализа. Тромбоз АВФ был отмечен в 41,1 % случаях (Пашин С.В., Иванов А.В., 2007). Показано, что факторами риска тромбоза являются снижение кровотока (Eleftheriadis T., Antoniadi G., 2008) больше чем на 15% или ниже 300 мл/мин, предшествующие тромбозы, применение ССП по сравнению с нативными АВФ и петлевых ССП по сравнению с прямыми, гипотензия (Мойсюк Я.Г., Беляев А.Ю., 2002). Повышенная вязкость крови коррелирует с дисфункцией сосудистого доступа в виде стенозов или тромбозов (Dhar P., Eadon M., 2012). По данным польских исследователей однолетнее изучение типов сосудистого доступа у гемодиализных пациентов выявило, что самым частым осложнением со стороны артериовенозной фистулы является тромбоз артериовенозной фистулы и составляет 14,3% (Krzanowski M., Janda K., 2011). Десятилетний опыт формирования постоянного сосудистого доступа показал, что из 545 реконструктивных операций при необходимости восстановления, коррекции или прекращения функции ПСД, самым частым осложнением является тромбоз и составляет 48% (Беляев А.Ю., Кудрявцева Е.С., 2011). Тромбоз развивается с частотой 30% в случае анастомоза конец в конец, 2,31% - конец в бок, 5,56% - бок в бок артериовенозной фистулы (Gali G., Kvesi A., 2008). Исследования других авторов также свидетельствуют о том, что анастомоз конец в бок обеспечивают лучшие результаты в отношении развития осложнений и первичного выживания, чем анастомоз конец в конец (Stanziale R., Lodi M., 2011). Во многих случаях из-за необходимости удаления внутривенного двухпросветного катетера (чаще всего вследствие его инфицирования) может начинаться преждевременная эксплуатация недостаточно "созревшей" АВФ. Даже при наличии достаточного внутреннего диаметра такая фистульная вена имеет недостаточную толщину сосудистой стенки, что затрудняет обеспечение гемостаза в процессе и после окончания гемодиализа, а это может приводить к образованию постинъекционных компрессионных гематом и тромбозу АВФ (Беляев А. Ю., 2007). Поиск и идентификация потенциальных факторов риска, чтобы уменьшить заболеваемость тромбозом сосудистого доступа у пациентов на гемодиализе может уменьшить значительную заболеваемость и затраты на их лечение (Chang T.I., Paik J., 2011). Повышение уровня Д-димера, тканевого активатора плазминогена и маркеров воспаления (СРБ, IL-2, IL-6, сывороточный альбумин) у больных с ХПН при использовании центрального венозного катетера, привело к возможности предполагать взаимосвязь между типом сосудистого доступа для ГД и риском тромбогенеза (Costa E., Rocha S., 2008). Другими учеными показано, что концентрация Д-димера является значимым предиктором развития тромбоза артериовенозной фистулы (Stolic R.V., Trajkovic G.Z., 2008). Сывороточный уровень СРБ не только прогнозирует риск сердечнососудистых осложнений и смертности у пациентов на гемодиализе, но и является маркером развития тромбоза сосудов доступа у больных хроническим гемодиализом (Chou C.Y., Kuo H.L., 2006; Elzen W.P., Van Manen J.G., 2006).
Исследование электролитного состава крови
Оборудование: автоматический многопараметрический анализатор клеток крови Sysmex KX-21N (Япония). Реагенты: рабочий изотонический разбавитель (дилюент) CellPack, лизирующий раствор Stromatolyser-WH, очищающий раствор (депротеинизатор) CellClean. Ход определения. Для выполнения общего анализа крови использовали кровь, взятую с добавлением К2ЭДТА, и проводили анализ согласно инструкции к прибору. Оборудование: биохимический анализатор Cobas INTEGRA 400 plus (Roche, Германия). Реагенты: Total protein Gen.2, Albumin Gen.2, Total Bilirubin Special, Bilirubin Direct, ASTL, ALTL, Creatinine Jaffe, Urea/Bun (Roche, Германия). Ход определения. Для проведения биохимического анализа крови использовали кровь, взятую в сухую чистую пробирку, и исследование проводили согласно инструкциям к реагентам и прибору.
Оборудование: ионоселективный анализатор электролитов ABL 9180 (Roche, Германия). Реагенты: контейнер с реагентами «Снеп Пак» (Roche, Германия). Ход определения. Кровь, взятую с добавлением гепарина, исследовали в анализаторе электролитов в режиме цельной крови согласно инструкции к прибору.
Оборудование: коагулометр Start4 (DiagnosticaStago, Франция), биохимический анализатор Cobas INTEGRA 400 plus (Roche, Германия).
Реагенты: Neoplastin plus, PTT Reagent, STA Fib, Fibrinogen reagent,STA Calcium chloride 0,025 M, STA Trombin, Tina-quant D-Dimer (Roche, Германия). Ход определения. Для исследования крови на показатели гемостаза использовали венозную кровь, взятую в пробирки с 3,8% раствором цитрата натрия. Исследования выполняли согласно инструкции к анализатору. Оборудование: биохимический анализатор Cobas INTEGRA 400 plus (Roche, Германия). Реагенты: C-reactive protein High sensitive (hsCRP) (Roche, Германия). Ход определения. Для определения С-реактивного белка использовали кровь, использовали кровь, взятую в сухую чистую пробирку, и исследование проводили согласно инструкциям к реагентам и прибору. Иммунофенотипирование циркулирующих в периферической крови лимфоцитов является необходимым исследованием в оценке иммунного статуса. Стандартная панель для иммунофенотипирования лимфоцитов, как правило, состоит из CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD25+. Принцип метода заключается в том, что определенные субпопуляции лимфоцитов содержат на своей поверхности специфические рецепторы. Добавляя моноклональные меченные флюорохромом антитела к взвеси лимфоцитов, можно пометить определенные субпопуляции. Подсчет меченых лимфоцитов осуществляется за счет того, что флюорохром при освещении светом определенной волны начинает флюоресцировать, что регистрируется прибором. Таким образом, определяются «молчащие» клетки и клетки, меченные флюорохромом. Оборудование: проточный цитофлюориметр Facscantoo II (Becton Dickinson, США), центрифуга GS-6R (Beckman, США), вортекс, лабораторная посуда, пробирки, автоматические пипетки и дозаторы. Реактивы: Моноклональные антитела к поверхностным рецепторам лимфоцитов (Caltag laboratories, Канада). Раствор фиколл-урографина (плотность 1,077). Раствор Cell WASH (Becton Dickinson, Бельгия). Ход определения.
Гепаринизированную кровь разводили равным объемом раствором Хенкса (или ФСБ pH - 7,4). Наслаивали 2 мл разведенной крови на 1мл раствора фиколл-урографина буфера и центрифугировали 15-20 мин при 1600 об/мин. Переносили «кольцо» лимфоцитов (клетки, располагающиеся на разделе фаз) в пробирку с 2 мл раствора Хенкса (или ФСБ pH - 7,4) и центрифугировали 5 мин при 1600 об/мин. Супернатант удалили, к осадку добавляли 2 мл раствора Хенкса и центрифугирвали 5 мин при 1600 об/мин.
Супернатант удаляли, осадок доводили раствором Хенкса до необходимого объема. Для одного определения CD-маркера достаточно 100 мкл клеточной взвеси. Ресуспендированную клеточную взвесь разносили по пробиркам (по 100 мкл). В пробирки добавляли по 5 мкл меченных флюорохромом моноклональных антител. Инкубировали при +30С при 15-20 мин в темноте. В пробирки добавляли по 1 мл раствора Cell WASH и центрифугировали 5 мин при 1600 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, в пробирки добавляли по 100 мкл раствора Cell WASH (или CellFix). Проводили анализ лимфоцитов на проточном цитометре. Нормальные показатели: CD3+, абсолютное количество - 1,1-1,9109/л или 60-85 %. CD4+, абсолютное количество - 0,7-1,4109/л или 29-59 %. CD8+, абсолютное количество - 0,5-1,1109/л или 19-46 %. CD16+, абсолютное количество - 0,2-0,65109/л или 6-29 %. CD19+, абсолютное количество - 0,2-0,6109/л или 7-23 %. CD25+, абсолютное количество - 0,1-0,55109/л или 2-20 %. Количественное определение основных классов иммуноглобулинов используется для оценки состояния гуморального звена иммунной системы. Принцип метода. Иммуноглобулины A, M, G, содержащиеся в пробе, специфически связываются с сорбированными на твердой фазе моноклональными антителами к IgA, M, G, а далее с моноклональными антителами антиIgA, M, G – пероксидазой хрена. После отмывания лунок планшетов от не связавшихся реагентов определяется активность пероксидазы коньюгата, связавшегося с определяемым иммуноглобулином. Интенсивность окраски хромогена пропорциональна концентрации IgA, M, G в анализируемой пробе. Оборудование: Спектрофотометр микропланшетный Humareader (Human, Германия), термостат с температурой 37С (Binder, Германия), автоматическое устройство для промывки стрипов (Human, Германия), дозаторы.
Реактивы: Наборы реагентов для количественного определения иммуноглобулинов A, M, G в сыворотке и плазме крови методом ИФА наборами реагентов фирмы «Вектор Бест» (Россия).
Оценка показателей общего анализа крови
Для достижения поставленных задач было обследовано 165 человек. Исследуемая группа состояла из 104 пациентов (возраст от 19 до 78 лет) с ХБП, находящихся на лечении ПГД. Первую группу составили 75 пациентов с ХБП, получающих лечение ПГД. Средний возраст пациентов составил 52±1,49 лет. Средняя продолжительность лечения ПГД – 51±1,72 месяца. У пациентов этой группы за весь период наблюдения не наблюдалось осложнений сосудистого доступа в виде тромбоза АВФ. Вторую группу составили 29 пациентов с ХБП, получающих лечение ПГД, в анамнезе которых были отмечены случаи тромбозов АВФ. Средний возраст пациентов составил 54±2,94 лет. Средняя продолжительность лечения ПГД - 40±1,86 месяцев. За время нахождения на ПГД 66% обследуемых перенесли одну операцию по ревизии тромботического осложнения АВФ, 17% - две операции, 3% - три операции и 14% - четыре. Контрольную группу составили 25 мужчин и 36 женщин без клинических и лабораторных признаков поражения почек. Возраст обследуемых от 25 до 55 лет, средний возраст 42,9±1,66 лет. Все обследуемые были сопоставимы по полу и возрасту.
В результате исследования показателей общего анализа крови у пациентов без осложнений АВФ было выявлено значимое снижение относительного (26,35±1,01% против 34,54±0,98% в контроле; p 0,05) и абсолютного (1,61±0, 07 x109/л против 2,13±0,07 x109/л в контроле; p 0,05) количества циркулирующих лимфоцитов на фоне нормального содержания общего количества лейкоцитов в периферической крови (6,54±0,22 x109/л и 6,31±0,16 x109/л соответственно; p 0,05) (табл. 4). В данной группе выявилось значимое снижение относительного количества палочкоядерных гранулоцитов (1,97±0,19 %) и увеличение сегментоядерных гранулоцитов (62,63±1,22%) в сравнении со здоровыми (2,78±0,19% и 54,48±0,98% соответственно; p 0,05). Абсолютное значение палочкоядерных гранулоцитов было достоверно снижено (0,11±0,01 x109/л) в сравнении со здоровыми (0,18±0,02 x109/л; p 0,05). У пациентов без тромботических осложнений АВФ наблюдалось значимое снижение относительного и абсолютного количества моноцитов (4,27±0,32 % против 6,06±0,37 % в контроле; 0,24±0,02 x109/л против 0,38±0,02 x109/л в контроле; p 0,05) и увеличение количества относительного и абсолютного количества эозинофилов (4,22±0,35% против 2,12±0,16% в контроле; 0,27±0,02 x109/л против 0,01±0,01 x109/л; p 0,05) в сравнении со здоровыми. На фоне сниженного количества эритроцитов у пациентов на гемодиализе без тромбозов АВФ (3,20±0,10 x1012/л против 4,65±0,04 x 1012/л в контроле) отмечалось значимое уменьшение количество гемоглобина (99,68±3,42 г/л против 136,35±1,35 г/л в контроле соответственно; p 0,05). Это является свидетельством анемии, развивающейся у пациентов на гемодиализе.
Пациенты с тромбозами АВФ характеризовались значимым снижением относительного (30,61±2,27% против 34,54±0,98% в контроле; p 0,05) и абсолютного (1,87,10±0,16 x109/л против 2,13±0,07 x109/л в контроле; p 0,05) количества циркулирующих лимфоцитов на фоне нормального содержания общего количества лейкоцитов в периферической крови (6,61±0,35 x109/л и 6,31±0,16 x109/л соответственно; p 0,05). На фоне сниженного количества эритроцитов (3,24±0,13 x1012/л против 4,65±0,04 x1012/л в контроле) в группе пациентов на гемодиализе с тромбозами, отмечается значимое уменьшение количество гемоглобина (102,08±3,38 г/л против 136,35±1,35 г/л в контроле соответственно; p 0,05). У пациентов с осложнениями АВФ наблюдается значимое увеличение относительного и абсолютного количества эозинофилов (2,96±0,40% против 2,12±0,16%; 0,19±0,03 x109/л против 0,01±0,01 x109/л в контроле; p 0,05), по количеству моноцитов отличий не было выявлено (5,19±0,65% против 6,06±0,37% в контроле; p 0,05). Достоверных различий в содержании относительного и абсолютного количества палочкоядерных и сегментоядерных гранулоцитов отмечено не было. У пациентов на гемодиализе с наличием тромбозов АВФ было выявлено значимое повышение относительного количества циркулирующих лимфоцитов (30,61±2,27% против 26,35±1,01%; p 0,05) в сравнении с группой пациентов без тромбозов АВФ на фоне нормального содержания общего количества лейкоцитов в периферической крови у обеих групп обследуемых (6,61±0,35 x109/л и 6,54±0,22 x109/л соответственно; p 0,05). Выявилось значимое снижение относительного количества сегментоядерных гранулоцитов у пациентов с тромбозами АВФ в сравнении с группой пациентов без тромботических осложнений АВФ (57,19±2,47% против 62,63±1,22% соответственно; p 0,05). У пациентов с наличием тромбозов АВФ наблюдается значимое снижение относительного и абсолютного количества эозинофилов (2,96±0,40% против 4,22±0,35%; 0,19±0,03 x109/л против 0,27±0,02 x109/л соответственно;p 0,05), в сравнении с группой пациентов без тромбозов АВФ.
Похожие диссертации на Комплексная лабораторная оценка факторов риска тромбозов сосудистого доступа у пациентов на гемодиализе
