Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 19
1.1. Характеристика естественных супрессорных клеток 19
-
ЕСК гемопоэтической ткани интактного организма 22
-
ЕСК при модулированном гемопоэзе 25
-
ЕСК при иммунном ответе 29
-
ЕСК после аллогенной трансплантации, приРТПХ 29
-
ЕСК при опухолевом росте 31
-
ЕСК при иммунном ответе на микробные и гельминтные антигены 37
-
ЕСК при беременности 41
1.1.4. Механизм действюг ЕСК 43
1.2. ПОЛЯРИЗАЦИЯ ЛИМФОЦИТОВ И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ 55
1.2.1. Дифференцировка Т-хелперов и условия, влияющие на ее
направление 55
1.2.2. Механизмы поляризации Т-хелперов 60
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 75
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 81
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 93
3.1. АКТИВНОСТЬ ЕСТЕСТВЕННЫХ СУПРЕССОРНЫХ
КЛЕТОК МЫШЕЙ В РАЗНЫХ МОДЕЛЯХ ИММУННОГО
ОТВЕТА 93
-
Иммунизация лошадиной сывороткой 93
-
Отторжение кожного аллотрансплантата 100
-
Иммунизация эритроцитами барана 104
-
Реакция «трансплантат против хозяина» 106
-
Опухолевый рост ПО
-
Солидный рост карциномы Эрлиха ПО
-
Развитие спонтанной лимфомы тимуса 114
3.2. АКТИВНОСТЬ ЕСТЕСТВЕННЫХ СУПРЕССОРНЫХ
КЛЕТОК МЫШЕЙ ПРИ РАЗВИТИИ ИММУННОГО ОТВЕТА
ЇИ2 ТИПОВ 118
3.2.1. ІЬммунизация БЦЖ 118
-
Однократная иммунизация 118
-
Двукратная иммунизация без адъюванта Фрейнда 134
Зт27ІТ37Двукратная иммунизация с адъювантом Фрейнда , 142
3.2.1.4. Трехкратная иммунизация с адъювантом Фрейнда 150
3.2.2. Иммунюация овагсьбумином 158
-
Однократная иммунизация 158
-
Двукратная иммунизация 164
-
Трехкратная иммунизация 170
3.2.3. Полуаллогенная беременность 177
3.3. ВЛИЯНИЕ ЕСТЕСТВЕННЫХ СУПРЕССОРНЫХ КЛЕТОК
НА ПОЛЯРИЗОВАННЫЕ Т-ЛИМФОЦИТЫ 182
3.3.1. Действие естественных супрессорных клеток интактного
организма на пролиферацию поляризованных Т-лимфоцитов 182
3.3.2. Действие естественных супрессорных клеток костного мозга при
ТЫ- и Т1і2-зависимом иммунном ответе на поляризованные Т-
лимфоциты 187
3.3.3. Влияние естественных супрессорных клеток на продукцию
цитокинов Т-лимфоцитами 192
-
Влияние ЕСК на продукцию Т-лимфоцитами ИФ-у.. 192
-
Влияние естественных супрессорных клеток на продукцию ТЇЛ-2 Т-лимфоцитами 196
3.3.3.3. Влияние естественных супрессорных клеток на продукцию
ИЛ-4 Т-лимфоцитами 200
3.3.4. Сравнение действия естественных супрессорных клеток на
наивные и поляризованные Т-лимфоциты 202
3.3.4.1. Сравнение действия естественных супрессорных клеток
интактных мышей на наивные и поляризованные Т-
лимфоциты 202
-
Сравнение действия естественных супрессорных клеток мышей с 1 типом иммунного ответа на поляризованные Т-лимфоциты 206
-
Сравнение действия естественных супрессорных клеток мышей со 2 типом иммунного ответа (ГНТ) на поляризованные Т-лимфоциты ,„.., , 210
-
Сравнение действия естественных супрессорных клеток мышей со 2 типом иммунного ответа (толерантность) на поляризованные Т-лимфоциты 215
3.3.5. Действие естественных супрессорных клеток на ТЫ- и Th2-
зависимые иммунологические реакции in vivo .„,„.,219
-
Влияние естественных супрессорных клеток на Thl-зависимый отек 219
-
Влияние естественных супрессорных клеток на Th2-зависимый отек 225
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 230
ВЫВОДЫ: 280
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 283
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АОК -антителообразующая клетка
БОЕ-Э - эритроидные бурстобразующие единицы
ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа
ГКГ — главный комплекс гистосовместимости
ГНТ - гиперчувствительность немедленного типа
ДМБА — димегаггбенз[а]антрацен
ЕСА — естественная супрессорная активность
ЕСК - естественные супрессорные клетки:
ИЛ - интерпейкин
ИФ-у - интерферон- у
КАС - супернатант лимфоцитов, активированных конканавалином А
КОЕ- колониеобразующие единицы
Кон А - конканавалин А
КСА — колониестимулирующая активность
КСФ - колониестимулирующие факторы
ЛС - лошадиная сыворотка
НК - натуральные киллеры
НЦ активность - натуральная цитосгатическая активность
ПГЕ - простагландины типа Е
рГМ-КСФ - рекомбитгантньга гранулоцито-макрофагальный
колониесггимулирующзай фактор
РТПХ - реакция «трансплантат-против-хозяина»
СКК- стволовые кроветворные клетки
СЮІ — смешанная культура лимфоцитов
СФ - супрессорный фактор
ТКР - Т-клеточный рецептор
ТФР-р* - трансформирующий фактор роста р*
ФГА - фитогемагглютинин
ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты
ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка
Ig - immunoglobulin (иммуноглобулин)
NO — nitric oxide (оксид азота)
SBA - soybean agglutinin (соевый агглютинин)
Th - T helper (Т-хелпер)
TNF - tumor necrosis factor (фактор некроза опухоли)
WGA - wheat germ agglutinin (агглютинин зародыша пшеницы)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Регуляция иммунного ответа представляет собой важную как с теоретической, так и с практической точки зрения проблему. Центральное место в регуляции иммуннологической реакции и определении ее исхода, как известно, принадлежит цитокинам, которые вырабатывают Т-хелперами.
Показано, что после дифференцировки и созревания в тимусе наивные Th прекурсоры мигрируют в периферические органы иммунной системы, где под действием антигена необратимо дифференцируются в два разных типа - ТЫ или ТЪ2 [Seder R.A. et al., 1993], которые различаются по набору секретируемых цитокинов JMosmann V.R. et al., 1986]. Для Thl характерны следующие черты: секреция ИФ-у, ИЛ-2, лимфотоксина (TNF-P), индукция продукции В-клетками антител IgG2a, участие в ГЗТ и защите от внутриклеточных патогенов. Th2 клетки вырабатывают ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, преобладают при гельминтозах и аллергиях, способствуют генерации IgE-синтезирующих В клеток, играют важную роль в гуморальном иммунном ответе [Le Gros G. et al., 1990; Sornasse T. et al., 1996]. В настоящее время не вызывает сомнений, что основным фенотипическим признаком Thl является высокая продукция ИФ-у, а характерным признаком ТЪ2 - повышенная продукция ИЛ-4 [Romagnani S., 1991; Abbas А.К. et al., 1996; O'Garra A., 1998].
Баланс между дифференцировкой Т-хелперов в ТЫ или Tli2 является определяющим для исхода иммунного ответа, связанного с инфекцией, аутоиммунитетом или аллергическими заболеваниями [Abbas А.К. et al., 1996]. Аутоиммунные заболевания обусловлены выраженным, но аномальным, Thl ответом, в то время как аллергические заболевания - чрезмерным Th2 ответом. Показана роль ТЫ в иммунопатологии заболеваний центральной нервной системы, множественного склероза, экспериментального аллергического энцефаломиелита [Tssazadeh S. et al., 1995; LafaiHe J.J. et al., 1997], колитов [Asseman C. et al., 2003], аутоиммунного диабета [Mason D. et al., 1998], ревматоидного артрита [Goldberg R. et al., 2004; Latham K.A. et al., 2005], псориаза [Uyemura K. et al., 1993; Nomura I. et al., 2003]. Известна роль Th2 в патогенезе бронхиальной астмы [Krug N. et al., 1997], идиопатического пневмофиброза [Smith R.S. et al., 1997], диабета и панкреатита [Pakala S.V. et al., 1997]. Выявлено, что дисбаланс цитокинов ТЫ и Tli2 является важнейшим механизмом атопического дерматита как у человека, так и в экспериментальных моделях [Tsicopoulos A. et al., 1994; Werfel Т. et al., 1996].
Показано, что большое значение для направления поляризации имеет сам антиген, его структура и доза, а также способ его попадания в организм-tConstant-S.-etaL, 1997;Jao X. etal, 1997^Q'Garra А., 1998]. Некоторые патогены (Leishmania, Listeria, Mycobacteria) или гельминты вызывают развитие четкой поляризации ThO либо в ТЫ либо в Tli2 [Hoebe К. et al., 2004]; однако наблюдаются и ситуации, когда Т-лимфоциты в ответ на антиген продуцируют смешанный тип цитокинов [Kelso А., 1995]. Антиген-презентирующие клетки, прежде всего дендритные клетки, могут направлять дифференцировку ThO [Steinman R.M., 1983; Banchereau J. et al., 1998]. Продуцируя ИЛ-12 [Macatonia S.E. et al., 1995; Koch F. et al., 1996], дендритные клетки могут создавать условия для предпочтительного развития ТЫ in vitro и in vivo [Langenkamp A. et al., 2000; Tanaka H. et al., 2000]. В то же время другие антиген-презентирующие клетки (В-лимфоциты) [Stockinger В. et al., 1996; Macaulay А. Е. et al., 1997] и клетки NK-T [Bendelac A. et al., 1997] могут способствовать развитию Т1т2.
Если 1 тип поляризации обеспечивает протективный клеточный иммунитет, то клинические проявления Th2 ответа более разнородны: во-первых, реакции гиперчувствительности немедленного типа (анафилактические реакции, бронхиальная астма, гельминтозы) [Finkelman F.D. et al., 1988; Clutterbuck E.J. et al., 1989], во-вторых, ситуации толерантности иммунной системы (оральная толерантность, беременность, опухолевый рост), когда наряду с секрецией ИЛ-4 начинает преобладать выработка ТФР-|3 и ИЛ-10 [Klioury S. J. et al., 1992;MaedaH.etal., 1996].
К числу регуляторов иммунологических реакций относятся и естественные супрессорные клетки (ЕСК). Показано, что ЕСК, представляющие собой крайне не однородную популяцию гемопоэтических клеток разной степени зрелости, участвуют в негативном регулировании ряда иммунологических реакций,. неспецифически подавляя пролиферацию иммунокомпетентных клеток [Hoskin D.W. et al., 1989а; Subiza J.L. et al., 1989; Fu Y.X. et al., 1991; Brooks-Kaiser 1С. et al., 1992; Yamamoto H. et al., 1994].
Естественная супрессорная активность обнаруживается в местах нормального гемопоэза, например, в костном мозге взрослого организма [Sugiura К. et al., 1988], печени эмбриона [Чеглякова В.В., 1984], неонатальной селезенке [Schwadron R.B. et al., 1985]. Активность ЕСК возрастает в ситуациях усиленного кроветворения при беременности [Brooks-Kaiser J.C. et al., 1993а], опухолевом росте [Subiza J.L. et al., 1989; Young M.R.I, et al., 1992b], в результате воздействий, нарушающих гомеостаз в системе крови (гипоксия, кровопотеря [Чеглякова В.В., 1984]), а также под влиянием физических (облучение) и химических факторов, повреждающих гемопоэз (введение фенилгидразина [Кашлакова Н.В., 1987; Митасов А.В. с соавт., 1990], циклофосфана [Pela'ez В. et al., 2001]).
Участие ЕСК в регуляции иммунного ответа на инфекционные агенты изучено мало. Так, показано, что при введении животным БЦЖ [Kato К. et al., 1985], вируса гриппа [Kusmartsev S.A. et al., 2003а], гельминтных олигосахаридов [Terrazas L.I. et al., 2001], заражении Trypanosoma African [Schleifer K.W. et al., 1993], Salmonella [al-Ramadi B.K. et al., 1991], Schistosoma mansoni [Marshall M.A. et al., 2001], при нематодной инфекции Brugia malayi [Loke P. et al., 2000], после введения суперантигена [Terabe M. et al., 2000] активность ЕСК значительно возрастала.
В основе механизма действия ЕСК лежит секреция ими супрессорных факторов. Оксид азота выступает в роли единственного шшяуносупрессорного—фактора—ЕСК—костного—мозга—интактных животных [Angnlo I. et al., 1995], а также животных, получивших циклофосфан [Angulo I. et al., 2000], у мышей с опухолью [Serafini P. et al., 2004] или с РТПХ [Billiau A.D. et al., 2003], при заражении Trypanosoma African [Schleifer K.W. et al., 1993], при введении гельминтных антигенов [Atochina О. et al., 2001] или суперантигена [Cauley L.S. et al., 2000]. Другими супрессорными факторами ЕСК многие авторы называют ТФР-р и ИЛ-10, который стимулирует продукцию ТФР-Р. ЕСК, секретирующие ТФР-Р и ИЛ-10, обнаружены в селезенке мышей во время беременности [Brooks-Kaiser J.С. et al., 1993а], при росте ряда опухолей [Terabe М. et al., 2003], после введения гельминтных олигосахаридов [Terrazas L.I. et al., 2001]. ECK могут частично осуществлять свое иммуносупрессорное действие, вырабатывая простагландины (простагландин Е2), что показано при РТПХ [Huchet R. et al., 1993], при канцерогенезе [Fu Y.X. et al., 1991], при заражении мышей Trypanosoma African [Schleifer K.W. et al., 1993]. Обнаружено, что ECK костного мозга и селезенки мышей-опухоленосителей могут оказывать иммуносупрессорное действие за счет усиленной выработки активных форм кислорода (супероксидрадикал и его производные) [Bronte V. et al., 2003; Kusmartsev S. et al., 2003b]. Однако в качестве супрессорных факторов ECK чаще других обнаруживают NO и ТФР-р.
Активность ЕСК регулируется различными цитокинами, такими как ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, ГМ-КСФ, ИФ-у, TNF-a [Holda J.H. et al., 1990; Fu Y.X. et al., 1991; Angulo I. et al., 1995; Billiau A.D. et al., 2003; Terabe M. et al., 2004; Serafini P. et al., 2004]. Вероятно, их набором и определяется, какие факторы будут продуцировать ЕСК в той или иной ситуации^
Имеющиеся в настоящий момент данные позволяют предположить, что активация NO- или ТФР-Р-продуцирующих ЕСК должна происходить в зависимости от типа поляризации лимфоцитов в конкретной ситуации. Такого типа взаимоотношения показаны между поляризованными Т-лимфоцитами и зрелыми макрофагами [Munder М. et al., 1998; Mills CD. et al., 2000]. Активировать макрофаги способны как Thl, так и Th2 лимфоциты, но функциональные свойства при этом будут различны. Макрофаги, индуцированные при ТЫ-зависимом иммунном ответе, называют «классически активированными» (М-1), а индуцированные Th2 цитокинами (ИЛ-4 и ИЛ-10) - «альтернативно активированные» (М-2). М-1 секретируют оксид азота и другие воспалительные медиаторы (такие как ШІ-1, ШІ-6, TNF-a) [Jorens P.G. et а!., 1995; MacMicking J. et al., 1997]. Напротив, М-2 не синтезируют оксид азота, а при помощи аргиназы 2 метаболизируют аргинин с образованием L-орнитина и мочевины [Corraliza I.M. et al., 1995; Modolell M. et al., 1995; Loke P. et al., 2002].
О наличии связи между поляризацией Т-хелперов и функциональной активностью ЕСК, на наш взгляд, свидетельствуют и данные о генетической предрасположенности развивать определенный тип ответа и выраженностью иммуносупрессорной активности у мышей разных линий. Так, максимальная активность ЕСК отмечена у мышей B10.D2 и C57BI/6, а минимальная - у BAlb/c [Maier Т. et al., 1989]. Мыши линии B10.D2 и C57BL/6 склонны развивать Thl-зависимый клеточный ответ, в то время как ВА1Ь/с — Th2-зависимый [Heinzel F.P. et al., 1989; Locksley R.M. et al., 1991; Hsieh C.S. et al., 1995; Shibuya K. et al., 1998]. Именно у ТЫ линий (B10.D2 и C57BL/6) макрофаги склонны развивать-МЛ-ответ-и-усиленно продуцировать^ИФ-у по^сравнению^с^ макрофагами Th2 линии (BAlb/c) [Buchmuller-Rouiller Y. et al., 1986; Liew F.Y. et al., 1991; Oswald LP. et al., 1992a; Stenger S. et al., 1994; Dileepan K.N. et al., 1995].
Существующие к настоящему времени работы, в которых показано повышение активности ЕСК in vivo, можно разделить на две группы. Первая из них включает исследования ЕСК в условиях стимуляции кроветворения, а другая группа работ проведена с использованием иммунологических моделей, для большинства из которых характерно либо состояние толерантности (опухолевый рост, беременность) либо, вероятнее всего, дифференцировка лимфоцитов в ТЫ (иммунизация
БЦЖ или Salmonella typhimurium). Однако тип поляризации в этих работах не изучался. Совсем не исследованным остался еще один вид иммунных реакций, связанный с поляризацией Tli2 - реакции гиперчувствительности немедленного типа. В связи с изложенным выше представляется актуальным исследовать активность ЕСК при ТЫ- и ТЪ2-зависимом иммунном ответе, а также оценить влияние ЕСК на поляризованные Т-лимфоциты.
Цель исследования: изучить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга на поляризованные Т-лимфоциты, исследовать влияние поляризации Т хелперов 1 и 2 типов на естественные супрессорные клетки.
Задачи исследования:
Изучить изменение активности естественных супрессорных клеток костного мозга при развитии иммунного ответа, вызванного различными антигенными стимулами.
Исследовать активность естественных супрессорных клеток костного^мозга^при^развитии ТЫ-- &Тд2-зависимоп^имдіуїпюгссОтвеіа,
Оценить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга интактного организма на пролиферацию поляризованных Т-лимфоцитов.
4. Исследовать действие естественных супрессорных клеток костного мозга, полученных от животных с установившейся поляризацией 1 и 2 типа, на пролиферацию поляризованных Т- лимфоцитов.
5. Изучить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга на продукцию цитокинов Т-лимфоцитами.
Сравнить действие естественных супрессорных клеток костного мозга интактных животных на пролиферацию наивных и поляризованных Т-лимфоцитов.
Сравнить действие естественных супрессорных клеток костного мозга, полученных от животных с развившимся Thl-зависимым иммунным ответом на пролиферацию наивных и поляризованных Т-лимфоцитов.
8. Сравнить действие естественных супрессорных клеток, полученных от животных с развившимся Т1і2-зависимьім иммунным ответом (в моделях анафилаксии и толерантности) на пролиферацию наивных и поляризованных Т-лимфоцитов.
9. Оценить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга интактных животных на развитие Till- и Т1і2-зависимьіх иммунологических реакций in vivo.
10. Изучить влияние естественных супрессорных клеток животных с Thl- и Тп2-зависимым иммунным ответом на развитие ТЫ- и Th2- зависимых иммунологических реакций ш vivo.
11. Оценить участие оксида азота в активности естественных супрессорных клеток интактных и иммунизированных животных в отношении поляризованных Т-лимфоцитов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Иммуносупрессорная и NO-синтезирующая активности естественных супрессорных клеток костного мозга повьппаются при любом виде иммунного ответа, как протекающего с развитием поляризации 1 типа, так и сопровождающегося дифференцировкой Т-хелперов в ТЪ2 с развитием анафилаксии или толерантности.
Естественные супрессорные клетки костного мозга обладают способностью ингибировать как пролиферацию поляризованных лимфоцитов (1 типа и дифференцированных во 2 тип с развитием анафилаксии или толерантности), так и подавлять продукцию цитокинов наивными и поляризованными Т-клетками. При этом ингибируется продукция лимфоцитами цитокинов как ТЫ, так и Th2 типа.
Т-хелперы 1 типа являются предпочтительной мишенью для антипролиферативного действия естественных супрессорных клеток костного мозга как интактного организма, так и животных с Thl или Th2 иммунным ответом.
4. Естественные супрессорные клетки костного мозга способствуют протеканию Th2 иммунного ответа in vivo: подавляют Thl-зависимую реакцию (ГЗТ) и, напротив, стимулируют Tli2- зависимую (ГЗТ-подобную) реакцию.
Научная новизна. Впервые проведено системное исследование иммуносупрессорной и NO-синтезирующей активностей ЕСК костного мозга да большом наборе моделей иммуного ответа. При иммунном ответе, инициированном ксеноантигеном (лошадиная сыворотка, эритроциты барана), аллоантигеном (кожный аллотрансплантат, реакция «трансплантат против хозяина»), а также на фоне иммунологической толерантности, развившейся при опухолевом росте (перевивной солидный и спонтанный канцерогенез) и при полуаллогенной беременности, показано, что иммуносупрессорная и NO-синтезирующая активности ЕСК костного мозга повышаются при условия изменения (повышение или снижение) продукции цитокинов Т-лимфоцитами селезенки. Впервые показано, что развитие поляризации Т-хелперов сопровождается увеличением активности естественных супрессорных клеток костного мозга, а также усилением синтеза ими оксида азота вне зависимости от типа поляризации.
Впервые изучено влияние ЕСК костного мозга на пролиферацию поляризованных Т-клеток 1 и 2 типов (как с развитием анафилаксии, так и толерантности), и выявлено, что естественные супрессорные клетки ее ингибируют вне зависимости от функционального состояния лимфоцитов.
Впервые исследовано действие естественных супрессорных клеток костного мозга на продукцию цитокинов наивными и поляризованными Т-лимфоцитами. Обнаружено, что секреция цитокинов ТЫ и Th2 подавляется.
Впервые проведено сравнение действия ЕСК костного мозга на поляризованные лимфоциты. Выявлено, что их пролиферация подавляется избирательно. Данная селективность ингибиторного действия естественных супрессорных клеток костного мозга не зависит от того, получены ЛИ" они из интакгного организма или от животных с установившимся Till- и ТК2-зависимым иммунным ответом,
Впервые исследовано влияние ЕСК костного мозга на протекание иммунологических реакций in vivo. При этом было обнаружено, что естественные супрессорные клетки костного мозга практически полностью отменяют адоптивную реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Разработан уникальный метод оценки действия ЕСК на развитие локального отека, вызванного Th2 лимфоцитами в системе адоптивного переноса. С помощью данного метода показано, что естественные супрессорные клетки костного мозга не только не ингибируют, а, напротив, стимулируют данную реакцию.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты расширяют представление о физиологической роли естественных супрессорных клеток, в частности, их значение в поддержании гомеостаза иммунной системы, что позволяет глубже понять механизмы взаимодействия" иммунной системы и гемоггоэза и роль кроветворных клеток разной степени зрелости в регуляции иммунологических реакции. Вскрытые в работе закономерности создают теоретическую основу для разработки новых методов клеточной терапии иммунопатологических состояний.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были представлены на конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002), «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2004), на Конгрессе молодых ученых и спеїщалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004), на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития жсперттенталънои и клинической онкологии» (Томск, 2004), на конференции «Иммунология на рубеже веков» (Томск, 2005), на Российско-Американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005).
Публикации, По теме диссертации опубликовано 37 печатных-работ, из них 17 в центральных журналах.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 342 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, описание использованных- методов и материалов,-полученные результаты и их обсуждение); выводов и списка-^ использованной литературы. Работа иллюстрирована 99 таблицами и 24 рисунками. Библиографический указатель включает 468 источников, из которых 34 отечественных и 411 иностранных.
