Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1. Современные теории старения кожи 12
2. Патоморфологические изменения кожи при старении 16
3. Современные методы лечения возрастных изменений 21
4. Научные аспекты и результаты клинического применения і культивированных
мезенхимальных» клеток в лечении дефектов тканей различной этиологии 23-
5. Модели исследования кожи 33
6. Происхождение миофиобробластов при раневом заживлении Контракция 38»
ГЛАВА II. Материалы и методы 41
1. Материалы, оборудование ирсактивы, используемые в работе 41
2. Культуры клеток 42
3. Определение фенотипического профиля мезенхимальных клеток с помощью
проточной флуориметрии 44
4. Создание живого эквивалента дермы» для определения, способности мезенхимальных клеток к индукции контракции 45
5. Разработка клеточной конструкции дермального эквивалента 46
6. Оценка реакции кожи на клеточный трансплантатов организме 49
7. Гистологические и иммуногистохимические методы 50
8. Оценка возможности коррекции инволюционных изменений кожи с помощью
мезенхимальных клеток 51
9. Инструментальные методы оценки 52
10.Статистический анализ результатов 53
ГЛАВА III. Результаты 55
1. Определение фенотипического профиля мезенхимальных клеток 55
2. Оценка контракции коллагенового геля мезенхимальными клетками» из различных источников 60
3. Разработка клеточной конструкции дермального эквивалента 64
4. Миграционная активность мезенхимальных клеток и реакция ткани кожи на внутридермальное введение дермального эквивалента 69
5. Оценка возможности коррекции, инволюционных изменений кожи с помощью
мезенхимальных клеток 73
ГЛАВА IV. Обсуждение 83
1. Общность иммунофенотипического профиля мезенхимальных клеток ...83
2. Трансформация мезенхимальных клеток в миофибробласты. Факторы влияющие на контракцию 90
3. Оценка реакции кожи на клеточный трансплантат в организме 95
4.Оценка возможности коррекции инволюционных изменений кожи с помощью
мезенхимальных клеток 97
Выводы 99
Список литературы 102
- Патоморфологические изменения кожи при старении
- Разработка клеточной конструкции дермального эквивалента
- Определение фенотипического профиля мезенхимальных клеток
- Общность иммунофенотипического профиля мезенхимальных клеток
Введение к работе
Актуальность проблемы. Возрастные изменения кожи как часть общебиологического старения развиваются в соответствии с изменениями, происходящими во всех тканях организма. До настоящего времени остаются малоизученными причины и механизмы их возникновения. Известно, что все причины, запускающие механизмы старения, можно разделить на две большие группы — внешние и внутренние. К внешним относятся УФ излучение, аллергены, механические повреждения; среди внутренних причин называют генетические, нейрогенные, иммунные, гормональные и другие факторы (Е1-Domiaty et al., 2002). Ряд авторов .указывает на ряд молекулярных механизмов развития возрастных изменений^ кожи, однако наиболее значимыми считают активацию процессов свободнорадикального окисления и активацию процессов гликации коллагена и эластина (Должникова Э.М., 2003; Ахтямов С.Н. и др., 2004; -Dyer D.G. et al., 1993; Harman D., 2003).
Показано, что с возрастом большие изменения претерпевают фибробласты кожи, теряющие активность, особенно на участках, подвергшихся инсоляции. Они приобретают шаровидную форму, нарушается их синтетическая функция: снижается синтез фибриллярных белков, таких как коллаген, фибронектин, эластин и повышается продукция протеаз, что приводит к деградации структуры внеклеточного матрикса, и, как следствие, к снижению эластичности кожи. (Шехтер А.Б, Милованова З.П., 1975; Gogly В. et al., 1997). Особое значение придается снижению синтеза сигнальных молекул, что приводит к нарушению эпидермально-дермальных взаимодействий, уменьшению пролиферации кератиноцитов базального слоя и, в результате, к снижению самообновления кожи и ее регенераторных возможностей.
В настоящее время существует большое количество методов коррекции возрастных изменений кожи (Holland R.L., Brown М.С., 1981; Tennstedt D., Lachapelle J.M., 1997; Heme K.B., Zachary C.B., 2000). К ним относятся массажи, применение питательных и увлажняющих кремов, масок, мезотерапия, пилинги, дермабразия, введение имплантатов, ботулотоксина, пластическая
хирургия. Все эти методы направлены, в конечном счете, на борьбу с уже существующими изменениями и напрямую зависят от состояния клеток кожи, и прежде всего фибробластов. По данным клинических наблюдений известно, что с возрастом успех от проведенной антивозрастной терапии снижается, так как снижаетсяуровень обменных процессов в клетках кожи и их способность к активации в ответ на стимулирующее действие процедур (Makeux R. et al., 1994).
Поиск новых методов эффективной коррекции инволюционных изменений кожи выделяется в перспективное направление современной дерматокосметологии (Виссарионов В.А. и др., 2003). В последние годы в литературе появились сообщения о применении культивированных мезенхимальных клеток для улучшения регенерации, что вполне соответствует современным представлениям о роли межклеточных взаимодействий в регенерационных процессах тканей и, в частности, о регуляторной функции фибробластов в поддержании тканевого гомеостаза (Хрупкий В.И. и др., 1998; Берк Г.С. и др, 2000; Келлер Г. и др, 2000). В литературе представлены данные о клиническом применении культуры фибробластов человека в лечении глубоких ожогов, которые были получены, Д.С. Саркисовым и. соавторами (Саркисов Д.С. и др., 1994). В настоящее время метод трансплантации аллогенных культивированных клеток (фибробластов и кератиноцитов) успешно применяется в комбустиологии, в лечении длительно незаживающих гранулирующих кожных ран, трофических язв и свищей, в лечении ран после операций пластической хирургии (Колокольчикова Е.Г. и др., 2001; Расулов М. Ф., 2007; Yonezawa М. et al., 2007; Nie X. et al., 2007). Также имеются отдельные сведения о том, что стволовые клетки, полученные из жировой ткани и мезенхимальные клетки костного мозга (МККМ) ускоряют заживление ран (Шумаков В.И. и др., 2003; Kim W.S. et al., 2007; Lee C.H. et al., 2007). Несмотря на большое количество работ, посвященных результатам применения мезенхимальных клеток при раневом заживлении, вопрос о процессах, происходящих при внутрикожном введении этих клеток при ее
7 инволюционных процессах, изучен недостаточно. Не проведено сравнительного изучения функциональных возможностей мезенхимальных клеток из разных источников (дермальных фибробластов, мезенхимальных клеток костного мозга, мезенхимальных клеток, полученных из жировой ткани) и сравнительного изучения профиля поверхностных маркеров этих клеток. Остался малоизученным вопрос о площади миграции введенных внутрикожно мезенхимальных клеток, также не изучалась тканевая реакция при их трансплантации. Особую практическую значимость могли бы иметь исследования, направленные на разработку клеточной конструкции, пригодной для использования в качестве трансплантата для оптимизации регенерации кожи. Не меньшую значимость при использовании мезенхимальных клеток для коррекции возрастных изменений кожи могли бы иметь исследования-отдельных функциональных параметров в модельных опытах in vitro и in vivo. Однако таких исследований мы в литературе не обнаружили. Между тем такие данные могли бы способствовать углублению наших представлений о патогенезе возрастных изменений кожи и поиску путей их устранения и профилактики.
Цель и задачи исследования: Целью данной работы являлось изучение механизмов влияния мезенхимальных клеток из разных источников на восстановление структурно-функциональных параметров кожи в моделях инволюционных процессов кожи in vitro и in vivo.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
Провести сравнительное исследование фенотипических характеристик различных типов мезенхимальных клеток и изучить их способность к индукции контракции коллагенового геля в модели живого эквивалента дермы.
Разработать клеточную конструкцию дермального эквивалента (аллогенные фибробласты на желатиновых микроносителях), пригодную для внутридермального введения и обеспечения
8 эффективной и безопасной коррекции структуры и функций кожи при ее инволюционных изменениях.
Обосновать безопасность внутридермального введения в организм дермального эквивалента с аллогенными фибробластами у свиней и показать возможность коррекции деструктивных изменений кожи при ее инволюционных изменениях или рубцовом повреждении.
Изучить механизмы коррекции структуры и функции деструктивно и инволюционно измененной кожи при внутридериальном введении клеточного дермального эквивалента.
Научная новизна исследования.
Впервые в опытах с моделированием инволюционных изменений кожи in vitro и in vivo изучен механизм коррекции структурно-функциональных изменений дермы под влияниемі инъецированных мезенхимальных клеток. Показано, что в трехмерной структуре дермы фибробласты приобретают фенотип миофибробластов, экспрессируют альфа-актин, контрастируют дерму.
Впервые проведена комплексная, оценка и анализ поверхностных маркеров мезенхимальных клеток, полученных из трех основных источников — дермы кожи человека, жировой ткани и костного мозга, для подтверждения их фенотипической принадлежности к мезенхимальным клеткам.
Впервые продемонстрировано, что все 3 типа мезенхимальных клеток из разных источников позитивны по большинству поверхностных маркеров, характерных для мезенхимальных стволовых клеток. Произведена оценка функциональной активности разных типов мезенхимальных клеток взорослого организма по способности трансформироваться в миофибробласты и индуцировать контракцию флотирующего Зх-мерного коллагенового геля в сравнении со способностью индуцировать контракцию геля фетальными фибробластами. Установлена способность фибробластов к миграции с поверхности микроносителей в матрикс, а также отсутствие тканевой воспалительной реакции в ответ на их введение в дерму свиней породы мини.
9 Установлено, что под действием трансплантированных мезенхимальных клеток улучшается эластичность кожи, восстанавливаются ее барьерные функции, а также нормализуется ее структура.
.Впервые был разработан дермальный эквивалент — клеточная
конструкция, состоящая из мезенхимальных клеток и биодеградируемых
желатиновых микроносителей, обеспечивающая адекватную
внутридермальную доставку клеток в физиологически активном состоянии, что позволяет использовать ее для оптимизации регенерации кожи.
Научно-практическая значимость работы. Получены новые факты о регулирующей роли мезенхимальных клеток, в частности фибробластов, в процессах восстановительной регенерации кожи. Установлена способность этих клеток индуцировать контракцию коллагенового геля - основного структурного компонента дермы, а также мигрировать в глубину дермы, обеспечивая непосредственный контакт этих клеток с собственными клетками дермы. Отражением этих регулирующих воздействий мезенхимальных клеток служит восстановление функций кожи (повышение эластичности кожи, восстановление ее барьерной функции) и нормализация ее структуры у пациентов с инволюционными и деструктивными (рубцовые деформации) изменениями кожи. Полученные результаты исследований на коже животных и человека, могут стать основой для разработки нового направления в использовании аллогенных и аутологичных мезенхимальных клеток для коррекции возрастных изменений кожи и при ее повреждении. Сходство фенотипического состава мезенхимальных клеток различного происхождения позволяет расширить источник получения донорских мезенхимальных клеток для осуществления клеточной терапии. Установленные в работе закономерности влияния мезенхимальных клеток на восстановление стурктурных компонентов кожи, могут быть использованы в лекционных курсах для преподавания физиологии, патофизиологии, клеточной биологии, а
10 так же служить основой для дальнейших разработок биомедицинских технологий.
Результаты работы; используются в лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии; развития им. Н.К. Кольцова РАН и в лаборатории по изучению репаративных процессов в< коже НИИ молекулярной' медицины ММА им: И.МІ Сеченова.
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки; по приоритетным направлениям развития .научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», шифр — «2007-2-1.2-06-02-177» в рамках темы: «Разработка тистотипических живых тканевых эквивалентов? на основе стволовых клеток для восстановления; структуры и функции тканей».
Положения, выносимые на защиту:
1. Мёзенхимальные клетки из различных источников (жировой ткани;
. 'костного; мозга, кожи) фенотипически идентичны по большинству* поверхностных маркеров, характерных для мезенхимальных стволовых:. клеток, а> также имеют сходную способность индуцировать контракцию коллагенового геля в модели живого эквивалента дермы in vitro;
2. Дермальный эквивалент в виде клеточной конструкции с использованием
желатиновых микроносителей позволяет увеличить конечную
концентрацию используемых клеток, защищает их от травматизации при
манипуляциях и позволяет доставлять клетки внутридермально в
физиологичном для них состояния.
3: Внутрикожная инъекция; аллогённых; мезенхимальных клеток на микроносителях не . препятствует миграции вводимых клеток с микроносителей в дерму, способствует их; трансформации > в миофибробласты, не индуцирует образование моноцитарно-макрофагальной реакции в дерме на их введение, что указывает на
безопасность применения и сохранение высокой функциональной активности мезенхимальных клеток на микроносителях. 4. Повышение биомеханических свойств кожи, восстановление ее барьерной функции, нормализация гистотипического строения при внутридермальном введении дермального эквивалента просиходит вследствие доставки жизнеспособных и функционально активных мезенхимальных клеток в зоны повреждения, их миграции с микроносителей в дерму, частичной дифференцировки этих клеток в миофибробласты, развития и стойкого сохранения эффекта контракции коллагеновых структур дермы, а также ремоделирования основных структурных компонентов кожи.
Патоморфологические изменения кожи при старении
Естественное или хронологическое старение включает изменения, представляющие собой проявления нормальной зрелости и характерны для всех людей (Фицпатрик Д.Е., Эллинг Д.А., 1999): Клинически оно выражается в небольшом истончении и сухости кожи, утолщении нормального кожного рисунка (Lapiere СМ., 1990; Фицпатрик Д.Е., Эллинг Д.А., 1999). С другой стороны, кожа, в отличие от других органов, существующих в сбалансированной внутренней среде организма, находится в особом положении, поскольку представляется собой «линию первого контакта» с внешней средой. Поэтому в коже, непосредственно подверженной многочисленным внешним влияниям, регрессивные изменения обнаруживаются раньше, чем в других органах (Benedetto A.V., 1998). Наиболее значимым экзогенным фактором является УФО. Большинство изменений кожи, ассоциируемых в нашем сознании со старением (морщины, пожелтение и истончение кожи, ксероз, лентиго и телеангиоэктазии), являются результатом кумулятивного действия УФО. В свою очередь, комплекс клинических изменений кожи, связанных с его воздействием, называют фотостарением (Тедеско Ф., 1998; El-Domiaty М. et al., 2002).
Наиболее часто постулируется связанное с хронологическим старением кожи снижение пролиферативной активности кератиноцитов (Фицпатрик Д.Е., Эллинг Д.А., 1999) вследствие уменьшения их чувствительности к факторам роста. В то же время отмечается, что кератиноцитьг участков кожи, подверженных хронической инсоляции, характеризуются высокой пролиферативной активностью и более чувствительны к действию некоторых биологических факторов (Фицпатрик Д.Е., Эллинг Д.А., 1999). Имеются данные о повышении с возрастом резистентности кератиноцитов к апоптозу (Gilargon F. et al., 1995). Это может являться результатом блокады wt р53 другими белками, в первую очередь, эндогенными bcl-2 и MDM-2, или мутаций гена и образования мутантного типа протеина - mt р53 (Bowen A.R. et al., 1998).
Многочисленные исследования показывают, что толщина дермы с возрастом уменьшается в результате нарушения баланса между процессами синтеза и деградации ее компонентов. Так, с одной стороны, происходит снижение активности фибробластов по синтезу белков внеклеточного матрикса — коллагена, эластина, фибриллина, и гликозаминогликанов, а с другой -повышается продукция разрушающих их протеолитических ферментов разными клетками дермы (Escoffier С. et al., 1989). Многие исследователи указывают на накопление в дерме с возрастом стареющих фибробластов, отличающихся устойчивостью по отношению, как к пролиферативным, так и к проапоптотическим сигналам. Резистентность фибробластов к апоптозу может являться одним из факторов, способствующих накоплению клеток с повреждениями ядерной и митохондриальных ДНК, являющихся маркерами хронологического и, особенно, фотостарения кожи (BalajeeA.S. etal.,1998).
Снижение количества коллагеновых волокон в дерме и образование ковалентных связей между ними наблюдается как при хронологическом;.так;и при индуцированном УФО старении кожи, однако: при последнем онт более выражены (Gniadeckl R. et al:, 2000); Морфометрические, исследования кожи живота пациентов разных возрастных групп (от 1.0 і до 75 лет) выявили прогрессивное уменьшение, доли соединительной ткани,. содержащей-коллагеновые; волокна (Gniadecki К. et al., 2000). Эти изменения: болеес выражены в; средней,части; дермы и достигают сущетвенных величин уже.к 50 годам. При этом происходит параллельное снижение коллагена I и III типов-и. изменение соотношения коллагена ІЇІ типа к коллагену Гтипа, коррелирующее с возрастом пациентов. По другим данным (De Backer СМ. et al., 1998), существенное уменьшение коллагеновых волокон на закрытых участках кожного покрова отмечается к 80 годам.
Более того, содержание интактного пропептидного остатка проколлагена III в фотоповрежденной коже снижается на 40%, что является: результатом частичной дегенерации1 коллагеновых волокон дермы (Тедеско Ф., 1998). Усиление деградации волокон происходит за счет повышения активности ММЩ индуцированного; средними и, длинными ультрафиолетовыми волнами,, (Escoffier Є. et al., 1989); Известно, что клетки кожи человека экспрессируют три типа металлопротеиназ- ММИ-Г, ММП-8 и ММП-13, а УФО усиливает экспрессию первых двух типов (Engelke М; et а!., 1997); При этом, ММП-1 синтезируются преимущественно фибробластами, а основной популяцией клеток, экспрессирующей ММП-8, являются нейтрофилы. Образование коллагеновых димеров, опосредуемое различными механизмами тоже вносит существенную роль в развитии возрастных изменений в дерме (Марголина А.А. и др., 1999). Свой вклад в ковалентное связывание коллагеновых фибрилл вносят свободные радикалы, продукция которых усиливается при УФО (Brounlee М. 1995; Kinouchi М. et al., 2002). При этом гликозилированные белки активно участвуют в свободнорадикальных реакциях, а свободные радикалы, в свою очередь, способствуют конформационным перестройкам белка, делая его молекулы более доступным для атаки Сахаров (Brounlee М. 1995; Kinouchi М. et al., 2002). Коллагеновые димеры недоступны для действия ММП и накапливаются в коже. «Сшитый» коллаген не только менее эластичен по сравнению с нормальным, но и плохо связывать воду, что способствует дегидратации дермы (Марголина А.А. и др., 1999).
Разработка клеточной конструкции дермального эквивалента
Для оценки цитотоксичности тестируемых микроносителей (Sigma; США) и их влияния на эффективность прикрепления и пролиферации клеток была взята культура постнатальных дермальных фибробластов.
Клетки культивировали на среде ДМЕМ (Sigma, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (фирма ПанЭко, РФ) в пластиковых одноразовых культуральных флаконах (Nunk, Дания) при 37С в условиях насыщающей влажности в атмосфере с 5% С02. Определение цитотоксичности изучаемых образцов микроносителей проводили согласно требованиям Методических рекомендаций 96/ 247 «Тестирование лекарственных препаратов наружного применения в культуре клеток кожи человека», утвержденных МЗ РФ путем подсчета жизнеспособных клеток после инкубации с исследуемым препаратом. Клеточную суспензию (50 тыс/мл) в среде ДМЕМ с 10% эмбриональной телячей сыворотки (фирма ПанЭко, РФ) вносили в объёме 1 мл в, лунки 24-луночного плата (Nunc, Дания). Через 2 часа инкубации (после прикрепления клеток к субстрату) среду в платах меняли на свежую, содержащую образцы микроносителей. Клетки инкубировали в указанных условиях 72 часа. После окончания инкубации лунки промывали раствором Версена и снимали с культурального пластика инкубацией в смеси трипсина с раствором Версена прии37Є. Из каждой лунки брали 200 мкл клеточной суспензии для оценки жизнеспособности. Контролем служили лунких клетками без образцов.
Эффективность прикрепления и пролиферации клеток на образцах микроносителей оценивались по количеству клеток, их морфологии и характеру распределения по поверхности образцов. Количество клеток, выращенных на тестируемых образцах, оценивалось прямым подсчетом в камере Горяева. Количество клеток оценивали в течение 7 суток культивирования на поверхности тестируемых образцов микроносителей. Для этого фибробласты переводили в суспензию с помощью последовательной обработки раствором трипсина и Версена и помещали в пенициллиновые флаконы, содержащие среду ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, куда предварительно были внесены микроносители в количестве 5 мг/мл. Посадочная концентрация фибробластов составляла 4 105 клеток/мл. Через 2 часа совместной инкубации при 37С, условиях насыщающей влажности в атмосфере с 5% С02 и перемешивании для более равномерного прикрепления клеток к поверхностности микроносителей, микроносители переносили в новые пенициллиновые флаконы, содержащие среду ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Каждые сутки производился подсчет в камере Горяева клеток, находящихся на поверхности микроносителей, по три измерения на каждую точку. Для оценки распределения клеток на поверхности микроносителей, а также проведения визуального контроля условий культивирования и роста клеток использовали окрашивание прикрепленных клеток зеленым мембранным трейссером DiO (Sigma, США) и ядерным красителем Hoechst 33342 (Sigma, США).
Оптимальный температурный режим для транспортировки и хранения клеточной конструкции определяли путем подсчета количества жизнеспособных клеток на поверхности микроносителей, помещенных в бессывороточную транспортную среду при различной постоянной температуре. Наиболее перспективными для оценки выживаемости клеток на микроносителях в транспортной среде были выбраны два температурных режима. Это + 37С - оптимальная температура для роста и жизни клеток, поддерживаемая в СОг инкубаторах и + 4С — рекомендуемая температура для хранения и перевозки вакцин, сывороток, тканевых и органных трансплантатов, сохранность которых обеспечивается за счет снижения интенсивности обменных процессов. В качестве контроля использовали простую суспензию фибробластов в бессывороточной транспортной среде на тех же температурных режимах. Через 1, 2, 4, 6 и 24 часа забирали пробу каждого образца суспензий и проводили подсчет жизнеспособных клеток с помощью окраски витальными красителями и дальнейшим прямым подсчетом в камере Горяева. Для этого фибробласты на микроносителях предварительно обрабатывали раствором Версена и трипсина.
Работу проводили на свиньях породы мини — 12 шт., весом 35 — 40 кг (Центральный питомник лабораторных животных РАМН). Для получения фибробластов у свиней по местной анестезией 0,1 % раствором лидокаина (Биосинтез, Россия) забирали биоптаты с кожи спины, из которых по стандартной методике получали фибробласты. Биоптаты механически измельчали, ферментативно обрабатывали с использованием коллагеназы I типа. После ферментативной обработки фибробласты культивировали в среде Игла с глутамином (0,3мг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки в СОг инкубаторе при 37G. Смену среды проводили- через каждые 3-4 дня, культуры пассировали при достижении конфлуентного слоя. Для эксперимента использовали фибробласты 6-10 пассажа. Для идентификации трансплантированных клеток производили окраску дермальных фибробластов минисвиней ядерным красителем Hoechst 33342 (Sigma, США). Для этого клетки, прикрепленные к культуральному пластику, инкубировали в течение получаса в среде ДМЕМ без сыворотки с добавлением Hoechst 33342 в концентрации 5 мкг/мл при 37С. После чего фибробласты пассировали на биодеградируемые желатиновые пористые микроносители (микросферы размером 200 мкм) (Sigma, США), что позволяло сохранять их жизнеспособность и эффективность в процессе транспортировки и трансплантации, а также обеспечивало пролонгированное воздействие клеток после инъекций трансплантата в дерму. Фибробласты на микроносителях инъецировали свиньям внутрикожно в область спины. Реакция оценивалась на 5 и 28 сутки после трансплантации. На этих сроках у свиней бралась биопсия. Часть биоптатов фиксировалась в. формалине и последующая обработка проводилась по стандартной методике; часть биоптатов замораживали, после чего получали криостатные срезы толщиной 10 мкм для оценки миграции клеток после трансплантации.
Определение фенотипического профиля мезенхимальных клеток
При определении цитотоксичности микроносителей была использована культура ПФБ. В работе получены результаты трех независимых экспериментов (по три повтора на точку). Они позволяют заключить, что исследуемые микроносители в культуре не оказывают цитотоксического действия на ПФБ, об этом свидетельствует отсутствие статистически достоверных отличий между группами образцов и контролем.
В результате эксперимента по определению цитотоксичности обнаружено, что привнесение микроносителей не вызывает клеточной гибели (процент погибших клеток равен 0%). Клетки прилепляются к поверхности микроносителей и растут на них. Таким- образом, желатиновые микроносители не обладают цитотоксичностью, обладают хорошо выраженной адгезивной поверхностью, не тормозят клеточный рост. При оценке эффективности прикрепления к поверхности образцов микроносителей и пролиферации ПФБ суммировали результаты трех независимых экспериментов по подсчету клеток в камере Горяева. Оптимальную посадочную концентрацию определяли, сравнивая две концентрации 2 105 и 4 105 клеток/мл. Так, оптимальной посадочной концентрацией оказалась концентрация клеток 4 105клеток/мл при концентрации микроносителей 5 мг/мл. При таком соотношении, на 1-3 сутки количество ПФБ увеличивалось незначительно, а к 4 суткам наблюдалось резкое увеличение скорости роста клеток. На б сутки количество ПФБ достигло 1,6 106 клеток/мл, а на 7 сутки увеличение количества ПФБ не наблюдалось, что может быть объяснено эффектом контактного торможения клеток при достижении ими конфлюэнтности (рис. 9). При окраске ПФБ, прикрепленных к микроносителям с помощью зеленого мембранного трейсера DiO (Sigma) и Hoechst 33342 был выявлен равномерный характер распределения клеток по поверхности микроносителей (рис. 10). Причем, отмечали рост клеток не только на поверхности микроносителей, но и внутри — размеры и поверхность пор микроносителей оказались также удобными для роста клеток. Этот факт позволяет предполагать возможность выращивания клеток в еще большем количестве, используя внутреннюю поверхность микроносителей, а также позволяет избежать дополнительной травматизации клеток, при различных манипуляциях с микроносителями, например, при пипетировании.
Определение оптимальных условий для хранения и транспортировки клеточной конструкции.
При разработке клеточного трансплантата большое значение будет иметь не только разработка биосинтетических материалов для клеточной конструкциии, и выбор клеточной культуры, но и подбор оптимальных условий для транспортировки и хранения» клеточной конструкции. По данным литературы можно выделить два принципиальных способа хранения и транспортировки клеточного трансплантата: в виде простой суспензии клеток в питательной транспортной среде и в виде клеточных конструкций, то есть клеток помещенных на носители, погруженные в транспортную питательную среду. Также описано два температурных режима, пригодных для транспортировки и хранения клеточных трансплантатов: +4С и +37С. В данной работе мы исследовали в сравнительном аспекте жизнеспособность клеток на примере ИФБ при различных температурных режимах и различных формах, то есть в виде простой суспензии и клеточной конструкции «фибробласты на микроносителях».
При определении количества жизнеспособных клеток в простой суспензии наблюдали следующую картину. На сроках в несколько часов больший процент жизнеспособных клеток был при температуре +37С, в то время как через 24 часа, процент жизнеспособных клеток оказался выше при температуре +40 С. В то же время, при определении жизнеспособных клеток в суспензии «фибробласты на микроносителях» при температурном режиме +37С количество жизнеспособных фибробластов составило 95% через 1 час. Такой же процент жизнеспособных клеток сохранялся практически во время всего наблюдения и лишь незначительно упал до 93% к 24 часам. При этом процент жизнеспособных клеток в суспензии «фибробласты на микроносители» при температурном режиме +40 С был значительно ниже и сравним с количеством жизнеспособных клеток в простой суспензии при этом же температурном режиме. По всей видимости, фибробласты как субстратзависимая культура испытывают стресс при переводе в суспензионное состояние, при значительно снижает их жизнеспособность при нормальной температуре культивирования +37С. Будучи прикрепленными к поверхности микроносителей, они оказываются в физиологичном для себя состоянии и практически не теряют процента жизнеспособных клеток при переводе на транспортную бессывороточную среду при температурном режиме +37С. При температурном режиме +40 С происходит замедление интенсивности обменных процессов в клетках и снижение их жизнеспособности, причем вне зависимости в прикрепленном состоянии фибробласты или прикреплены к субстрату. Полученные результаты позволяют рассматривать постоянный температурный режим +37С как наиболее физиологичный для суспензии «фибробласты на микроносителях», способствующий сохранению максимального количества жизнеспособных клеток (рис. 11).
Общность иммунофенотипического профиля мезенхимальных клеток
Бурное развитие клеточных технологий, исследование и использование стволовых клеток, тканевых эквивалентов, по мнению экспертов, в ближайшее время изменит характер медицины и приведет к появлению концептуально новой основы этой науки.
С другой стороны следует отметить, что зачастую результаты практического применения различных клеточных технологий были получены раньше раскрытия биологических механизмов, действующих при использовании клеток, включенных в данные технологии.
В настоящий момент существует достаточно большое количество работ, показывающих эффективность применения мезенхимальных клеток, полученных из костного мозга, жировой ткани, дермы кожи.
Фибробласты одними из первых стали использоваться для улучшения раневого заживления. В настоящий момент накоплен большой, практический опыт применения фибробластов в восстановлении различных структур, например, слизистых оболочек верхних дыхательных путей, кожных ран, морщин и кожных депрессий, восстановлении кожи при ожогах (Келлер Г. и др., 2000; Колокольчикова Е.Г. и др., 2001; Терских В.В. и др., 2003; Contard Р. et al., 1993; Watson D. et al., 1999; Limat A. et al., 2000; Nie X. et al., 2007).
Способность MCKKM давать соединительнотканную дифференцировку сразу открыла перспективу использования этих клеток в клеточной реконструкции тканей наравне с уже использовавшимися фибробластами. Было показано, что МСККМ оказывают благоприятное влияние на ранозаживление (Satoh Н. et аГ., 2004; Lee С.Н. et al., 2007). Сегодня МСККМ используются для восстановления различных дефектов кожи и соединительной- ткани (Marion N.W., 2006), терапии глубоких ожоговых ран. (Шумаков В.И. и др:, 2002; Rasulov M.F. et al., 2005), длительно незаживающих ран способствовали их хорошему заживлению (Badiavas E.V., Falanga V., 2003), для лечения пародонтита (Lekic Р.С. et al., 2005).
Впервые метод выделения клеток из жировой ткани был описан в Л 960-х годах (Rodbell М., 1966; Rodbell М., Jones А.В., 1966). Позднее в работе Zuk с соавторами было показано, что клетки, полученные из жировой ткани человека, обладают множественными потенциями дифференцировки и способны дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном, остеогенном и миогенном направлениях in vitro, что предполагает наличие в ССФ жировой ткани не только преадипоцитов, но и мультипотентных стволовых клеток (Zuk P.A. et al., 2001; Zuk Р.А. et al., 2002; Zuk P.A. et al., 2006). Показано, что стволовые клетки из жировой ткани улучшают заживление ран (Kim W.S. et al., 2007; Altman А.М . et al., 2008). Отмечено также, что СКЖТ защищают фибробласты от оксидативного стресса, тем самым улучшая репаративные возможности кожи (Kim W.S. et al., 2008). Рассматривается возможность использования СКЖТ в терапии синильных изменений фибробластов (Park B.S., 2008), а также возможность использования СКЖТ для приготовления живого эквивалента кожи для трансплантаций (Trottier V., 2008).
Несмотря на то, что все перечисленные типы мезенхимальных клеток успешно используются фактически при одних и тех же показаниях, то есть улучшая регенерацию, отмечается явный недостаток информации относительно обоснования выбора тех или иных клеток, используемых при трансплантации. Более того, некоторые авторы говорят о преимуществах использования одних типов мезенхимальных клеток перед другими, основываясь только лишь на нескольких клинических наблюдениях, и аргументируя выбор данного типа клеток доступностью источника для их получения.
На наш взгляд, вопрос выбора источника мезенхимальных клеток является одним из наиболее актуальных вопросов современной тканевой инженерии, так как понимание биологических свойств различных типов мезенхимальных клеток дает возможность для четкого планирования и разработки тех или иных клеточных технологий. На данный момент вопрос, являются или мезенхимальные клетки, полученные из костного мозга, жировой ткани и дермы кожи взаимозаменяемыми при использовании их в целях улучшения регенерации, до сих пор остается неизученным.
Иммунофенотипическая характеристика является одной из основных характеристик клеток, позволяющая оценить их профиль, а также спрогнозировать свойства и поведение клеток in vivo и in vitro. Тем не менее, несмотря на большое количество публикаций на этот счет, вопрос об однозначности специфических маркеров мезенхимальных клеток продолжает оставаться дискутабельным.
Морфологически свежевыделенная фракция мезенхимальных клеток костного мозга (МККМ) гетерогенна и содержит фибробластоподобные клетки. МСККМ - это особая немногочисленная популяция клеток, выделенная среди клеток стромы костного мозга, играющая важную роль в гемопоэзе, а также в определенных условиях способная к дифференцировке в различные клеточные типы. Одним из нерешенных вопросов биологии МСККМ является их иммунофенотипическая характеристика, поскольку на сегодняшний день не определен маркер или набор маркеров, который бы наиболее полно и специфически характеризовал мезенхимальные стромальные клетки предшественники, в том числе костно-мозгового происхождения, и коррелировал бы с их способностью к длительной пролиферации и самоподдержанию, а также к определенной степени пластичности. Так, охарактеризованные по широкому списку маркеров, очищенные популяции МСККМ не отличались от культур клеток, полученных простой адгезией из более чем одной колонии, а мультипотентные линии МСККМ, каждая из которых была получена из одной клетки, тем не менее характеризовались неодинаковыми паттернами экспрессируемых маркеров, которые к тому же изменялись в течении времени культивирования МСККМ (Bianco P. et al., 2001; Fibbe W.F., 2002). Таким образом, в дополнение к неспецифичности фенотипических характеристик МСККМ, следует добавить, что клетки также могут изменяться в ответ на сигналы, получаемые от их микроокружения in vitro и in vivo (Bianco P. et al., 2001). В настоящее время, разными лабораториями проведен большой объем работы по определению спектра маркеров присутствующих на МСККМ.
В большинстве исследований показано, что для мезенхимальных стволовых клеток человека, мышей и крыс не характерна экспрессия маркеров, свойственных гемопоэтическим стволовым клеткам. Это относится к маркерам CD4 (экспрессируется на тимоцитах и Т-хелперах, корецептор Т-хелперов и лиганд МНС II) , CDllb (экспрессируется на моноцитах, макрофагах и естественных киллерах, лиганд ICAM-I и iC3b) , CD34 (ранний маркер гемопоэтических стволовых клеток, может обнаруживаться на эндотелии капилляров), CD43 (экспрессируется лейкоцитами, за исключением В-лимфоцитов, лиганд ICAM-I), CD45 (тирозинфосфатаза участвующая в передаче сигнала от Т-клеточного рецептора , панлейкоцитарный антиген), CD 117 (c-kit, рецептор фактора стволовых клеток является маркером кроветворных предшественников), CD31 (также называемый RECAM-1, обнаруживается на моноцитах, гранулоцитах, тромбоцитах и эндотелии) (Conget Р.А., Minguell J J., 1999; Pittenger M.F. et al., 1999; Javazon E.H. et al., 2001; Minguell JJ. et al., 2001; Fibbe W.F., 2002; Zuk P.A. et al., 2002; Lee C.H. et al., 2004; Wagner W. et al., 2005; Da Silva Meirelles L. et al., 2006; Kolf CM. et al., 2007).
