Введение к работе
Актуальность проблемы. Как известно, одним из важных патогенетических факторов опухолевого роста является дефектность иммунного ответа, что проявляется в неадекватной его инициации и, как следствие, развитии иммуносупрессии. Показано, что опухолевые клетки экспрессируют так называемые опухоль-ассоциированные антигены [Whiteside T.L. 2000], в случае адекватного распознавания которых иммунная система успешно предотвращает опухолевый рост или вызывает его регрессию [Cheever MA et al., 1995; Bocchia M. et al., 1996; Boon T. et al., 1996]. Механизмы ухода опухоли от иммунологического надзора многообразны. Опухолевые клетки, продуцируя иммуносупрессорные цитокины (ТФР-ft простагландины, оксид азота, ИЛ-10, альфа-2-макроглобулин, фактор роста эндотелиальных сосудов -VEGF), воздействуют как непосредственно на Т-лимфоциты, так и на клетки микроокружения [Black Р.Н. et al., 1980; Куртенков ОЛ. с соавт., 1983; Ladisch S. et al., 1983; Miescher S. et al., 1986; Cukrova V. etal, 1987; КлючареваТ.Е. с соавт., 1988; Miescher S. etal, 1988; EbertE.C. etal, 1990; Roszman T. et al., 1991; Tada T. et al, 1991; Gregoire M. et al, 1992; Yoshino I. etal., 1992; Alexander J.P. etal., 1993; LahmH. etal., 1993; AllevaD.G. etal., 1994; Chen Q. et al, 1994; Lieubeau B. et al, 1994; Hersh E.M. et al, 1995; Weller M. et al, 1995; Lagadec P. et al, 1996; Tsushima H. et al, 1996; Wojtowicz-Praga S. et al, 1997; Santin A.D. et al., 1999; Zou J.P. et al, 1999; Sharma S. et al, 1999; Shurin G.V. et al., 2001; Andreola G. et al, 2002; Abrahams V.M. et al, 2003; Kudo D., 2003; Mullins D.W. et al, 2003; Peguet-Navarro J. et al, 2003].
Инициация и развитие иммунного ответа в значительной степени зависят от микроокружения иммунокомпетентньж клеток, а ключевая роль в регуляции этого процесса принадлежит цитокинам. Одним из важных источников иммунорегуляторных веществ (NO, ТФР-|8, ИЛ-10 и др.) являются некоторые гемопоэтические клетки - естественные супрессорные клетки (ЕСК) [Moore S.C. et al., 1992; Belsky YP. et al., 1993; Angulo I. et al., 1995; Kusmartsev SA. et al., 1995; Sennikov S.V. et al, 1996; DeKoter R.P. et al, 1997; Seledtsova G.V. et al., 1997; Yanagie H. et al, 1997; Mori T. et al, 1998; Sennikov S.V. et al, 2001], которые представляют собой незрелые клетки различных ростков кроветворения. ЕСК — крайне неоднородная популяция клеток, обладающих естественной супрессорной активностью, т.е. способностью подавлять пролиферацию иммунокомпетентньж клеток неспецифически (без предварительного контакта с мишенями, не требуя рестрикции по антигенам комплекса гистосовместимости) [Michelson J.D. et al., 1988; Noga S.L et al, 1988; Saffian D.C et al, 1991; Hoskin D.W. et al, 1992; Sugiura K.etal., 1992].
іици
ЕСК могут принадлежать к гранулоцшхі«макрофагіазіьцимлгуритроидному, яимфоидному ростку [Чеглякова В.В. с соа^т.; ^^ а1-» і 992; Brooks-
Q0 Т"**"'/ '
Kaiser J.С. et al., 1993; Bronte V. et al., 2003; Kusmartsev SA. et al, 2003J, однако их объединяет, во-первьж, то, что они имеют нулевой фенотип, и во-вторьж, обладают выраженной иммуносупресорной активностью как in vitro, так и in vivo (подавляют реакцию Т- и В-лимфоцитов на антигены и митогены) [McGarry R.C. et al., 1982]. Кроме того, показано, что ЕСК обладают и противоопухолевой активностью, ингибируя пролиферацию некоторьж опухолевых клеток in vitro [Seledtsov V.I. et al., 1995]. Следует отметить, что если при опухолевом росте иммуносупрессорная роль ЕСК показана, то данных об их противоопухолевых свойствах в литературе нет. Пока вопрос о значении противоопухолевой активности ЕСК в развитии злокачественных новообразований остается открытым.
Важная роль ЕСК в регуляции иммунитета показано в работах in vivo при опухолевом росте [Young М. et al, 1994], РТПХ [Hertel-Wulff В. et al, 1987], иммунизации Salmonella typhimurium [Schleifer K.W. et al., 1993]. При некоторьж физиологических состояниях (беременность) [Brooks-Kaiser J.С. et al., 1993], при заболеваниях (опухолевый рост) [Kusmartsev SA et al., 1989; Young MR. et al.,
1996], а также определенных экспериментальных моделях (трансплантация клеток костного мозга [Imamura М. Е. et al., 1986], РТПХ [Holda J.H. et al., 1988], введение циклофосфана [Маіег Т. et al., 1989]) активность ЕСК значительно возрастает. В ситуациях стимулированного гемопоэза активность ЕСК также значительно увеличивается, при этом они мигрируют из костного мозга в очаги эктопического гемопоэза, в частности, в селезенку, где оказывают выраженное иммуносупрессорное действие.
В основе механизма иммуносупрессорного действия ЕСК лежит секреция ими растворимьж медиаторов - супрессорных факторов (СФ), в роли которьж могут выступать ТФР-Р, оксид азота, простагландины, некоторые нуклеозиды и другие, в том числе еще не идентифицированные вещества [Moore S.C., 1992; Angulo I. et al, 1995; Kusmartsev SA et al., 1995; DeKoter R.P. et al., 1997; Yanagie H. et al., 1997; Mori Т. E. et al., 1998]. Данные литературы относительно иммуносупрессорньж факторов ЕСК при опухолевом росте немногочисленны и противоречивы, в частности, в качестве СФ обнаружен ТФР-0 [Young MR. et al.,
1991] и NO. Однако не ясно, обусловлены ли эти разноречивые данные конкретными особенностями использованной модели опухолевого роста, продуцируют ли ЕСК только один СФ или в динамике роста опухоли происходит смена факторов. Известно, что иммуносупрессорная активность ЕСК костного мозга интактньж мышей обусловлена продукцией оксида азота [Angulo I. et al.,
1995]. Изменяется ли уровень его продукции ЕСК в процессе опухолевого роста, зависит ли это от вида канцерогенеза или от динамики опухолевой прогрессии - все эти вопросы остаются открытыми.
Известно, что сама опухоль вырабатывает стимулирующие гемопоэз факторы (ГМ-КСФ, ИЛ-3), активируя ЕСК [Young M.R., Newby М. et al., 1987; Young MR., Wright M.A. et al., 1992; Young MR. et al., 1996]. Представляется актуальным изучить прямое действие опухолевых факторов на активность ЕСК и синтез оксида азота, сопоставить свойства ЕСК опухоленосителей со свойствами ЕСК, полученных после воздействия факторов, вырабатываемых данной опухолью.
Показано, что важными регуляторами гемопоэза являются Т-лимфоциты [Гольдберг Е.Д. с соавт., 1982; Гольдберг ЕД с соавт., 1983; Гольдберг ЕД, Дыгай AM., 1985; Гольдберг ЕД с соавт., 1988; Дыгай A.M. с соавт., 1989; Бабаева А.Г., 1990], кроме того, индуктором одного из основных супрессорньж факторов ЕСК (N0) является Т-лимфоцитарный цитокин - интерферон-7- Несмотря на это, исследователями уделяется недостаточное внимание вопросам регуляции активности ЕСК Т-клетками. Представляется актуальным изучить действие Т-клеточньж факторов на ЕСК, а также сопоставить качественные и количественные характеристики ЕСК с функциональным состоянием Т-лимфоцитов при различных способах иммунизации.
Цель исследования: изучить механизмы регуляции иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей естественных супрессорньж клеток в норме и при опухолевом росте. Оценить роль оксида азота в реализации антипролиферативной активности естественньж супрессорньж клеток.
Задачи исследования:
1. Изучить роль оксида азота в иммуносупрессорной и противоопухолевой
активностях естественньж супрессорньж клеток основньж гемопоэтических тканей,
а также у мышей различных линий.
2. Сравнить вклад оксида азота в иммуносупрессорную и
противоопухолевую активности естественньж супрессорньж клеток в популяциях
миелокариоцитов с различным содержанием незрельж гемопоэтических клеток
(после удаления из костного мозга макрофагов, после длительного его
культивирования, в период восстановления гемопоэза после введения
циклофосфана, а также при фракционировании клеток костного мозга по
плотности).
3. Исследовать способность патологически измененньж
недифференцированных клеток (клеток ряда опухолевых линий) проявлять
естественную супрессорную активность.
4. Изучить механизмы индукции и реализации противоопухолевой
активности в зависимости от свойств опухолевых клеток-мишеней, а также роль
растворимьж факторов ЕСК и контактньж межклеточньж взаимодействий в этих
процессах.
5. Изучить иммуносупрессорную и противоопухолевую активности
естественных супрессорных клеток на различных моделях опухолевого роста (при
химически индуцированном и вирус-индуцированном канцерогенезе, при
перевивном и спонтанном опухолевом росте).
-
Оценить роль оксида азота как фактора естественньж супрессорньж клеток в механизме реализации их иммуносупрессорнои активности на различных моделях опухолевого роста (при химически индуцированном и вирус-индуцированном канцерогенезе, при перевивном и спонтанном опухолевом росте).
-
Изучить взаимосвязь между функциональным состоянием Т-лимфоцитов (по продукции ими интерферона-гамма и интерлейкина-2) и механизмом реализации иммуносупрессорнои активности естественньж супрессорньж клеток у животных с различным типом опухолевого роста.
-
Исследовать механизмы индукции и реализации иммуносупрессорнои и противоопухолевой активностей естественньж супрессорньж клеток костного мозга при прямом действии факторов, секретируемьж клетками опухолевых линий.
9. Изучить прямое влияние Т-лимфоцитов на индукцию и механизмы
реализации активности естественньж супрессорньж клеток in vitro. Сопоставить
активность естественньж супрессорньж клеток и механизмы ее реализации в
зависимости от функционального состояния Т-лимфоцитов в моделях in vivo
(реакция трансплантат против хозяина, аллогенная беременность, развитие
иммунного ответа на тимус-зависимые антигены).
Положения, выносимые на защиту.
-
Естественная супрессорная активность присуща бластным клеткам различного генеза, индуцируется самой клеткой-мишенью, способ индукции определяет и механизм ее реализации.
-
Иммуносупрессорная активность естественньж супрессорньж клеток, индуцируемая лимфоцитами, реализуется через продукцию оксида азота, а противоопухолевая их активность, индуцируемая опухолевыми клетками, реализуется через выработку факторов, отличных от оксида азота.
-
Закономерностями опухолевого роста, вне зависимости от вида канцерогенеза и гистологического типа опухоли, являются:
количественные и качественные изменения иммуносупрессорнои активности естественньж супрессорньж клеток (повышение ее уровня и появление иного фактора кроме оксида азота);
- увеличение противоопухолевой активности естественньж супрессорньж клеток в процессе роста опухоли, в основе которой лежит NO-независимый механизм.
-
Рост карциномы Эрлиха является нетипичной моделью канцерогенеза: особенности свойств клеток данной опухолевой линии определяют и особые свойства ЕСК.
-
Т-лимфоциты в зависимости от своего функционального состояния индуцируют альтернативные пути активации естественных супрессорных клеток: Т-лимфоциты с повышенной продукцией интерферона-гамма активируют естественные супрессорные клетки, механизм реализации иммуносупрессорного действия которьж определяется оксидом азота; Т-клетки со сниженной продукцией интерферона-гамма индуцируют естественные супрессорные клетки, вырабатывающие иные супрессорные факторы.
Научная новизна. В работе выявлены механизмы инициации иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей естественных супрессорных клеток. Впервые показано, что индукция этих активностей различна и зависит от клеток-мишеней, которые через вырабатываемые факторы определяют различные механизмы реализации естественной супрессорной активности. В работе также показано, что есть возможность селективно регулировать либо иммуносупрессорную, либо противоопухолевую активности естественных супрессорных клеток. Обнаружено, что иммуносупрессорная активность естественных супрессорных клеток в значительной степени обусловлена оксидом азота, синтез которого тем активней, чем больше содержание незрелых гемопоэтических клеток в популяции клеток-эффекторов. Противоопухолевая активность при таком обогащении также возрастает, однако оксид азота в ее формировании участия не принимает.
Впервые показано, что опухолевые клетки обладают иммуносупрессорной активностью, идентичной по механизмам индукции и реализации таковой у нетрансформированных низкодифференцированных кроветворных клеток.
Выявлено, что противоопухолевая активность гемопоэтических клеток проявляется в отношении различных по своим свойствам опухолевых клеток-мишеней и, только в некоторой степени, может реализовывается через оксид азота. Естественные супрессорные клетки оказывают противоопухолевое действие через растворимые медиаторы, секреция которых индуцируется опухолевой клеткой-мишенью, в том числе и в результате контакта клетка-клетка между эффектором и мишенью.
С использованием большого набора моделей опухолевого роста (химически и вирус-индуцированный канцерогенез, перевивной и спонтанный опухолевый рост) впервые показано, что повышение естественной супрессорной активности происходит у животных с опухолью вне зависимости от типа канцерогенеза и гистологического вида опухоли. При этом иммуносупрессорное действие
естественных супрессорных клеток в значительной степени обусловлено оксидом азота. В основе механизма наблюдаемого усиления активности естественных супрессорных клеток может лежать и непосредственное стимулирующее действие факторов, продуцируемых клетками опухоли. Впервые показано, что при разных типах канцерогенеза параллельно с повышением иммуносупрессорнои активности возрастает и противоопухолевая.
Впервые показано, что солидный рост карциномы Эрлиха представляет собой особую модель канцерогенеза, что обусловлено наличием у данной опухоли ряда свойств: ее клетки сами вырабатывают оксид азота без дополнительной стимуляции, секретируют индуктор его синтеза, стимулируют продукцию интерферона-7 Т-лимфоцитами, что, вероятно, и является причиной спонтанной (без дополнительной стимуляции) продукции оксида азота клетками костного мозга животных-опухоленосителей. Нетипичен также и патогенез роста данной опухоли -он сопровождается повышением продукции интерферона-гамма Т-клетками опухоленосителя. Иммуносупрессорная активность естественных супрессорных клеток в данной модели канцерогенеза также повышается, однако оксид азота в этом случае является основным и единственным их супрессорным фактором.
Впервые выявлена взаимосвязь между функциональным состоянием Т-лимфоцитов и количественными и качественными характеристиками естественных супрессорных клеток.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные позволяют яснее понять механизмы, лежащие в основе индукции активности естественных супрессорных клеток, их функциональной гетерогенности, что, в свою очередь, позволяет глубже понять механизмы иммунорегулирующего действия гемопоэтических клеток и расширить имеющееся представления о патогенезе опухолевого роста, а также о механизмах взаимодействия иммунной системы и гемопоэза. Вскрытые в данной работе аспекты патогенеза опухолевого роста позволят наметить новые точки приложения фармакологической коррекции приданном виде патологии.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были представлены на IX Европейской конференции по иммунологии (Рим, Италия, 1988); на 1-ом международном симпозиуме РАЛАН «Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологических исследованиях» (Москва, 1992); на 2-ом Международном Когрессе ISNIM (Салерно, Италия, 1993); на конференции «Экспериментальная и клиническая иммунология» (Томск, 1995); на конференциях: «Медико-биологические аспекты нейро-гуморальной регуляции» (Томск, 1997); «Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов» (Томск, 1999); «Проблемы экспериментальной и клинической фармакологии»
(Томск, 2000); «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологию) (Томск, 2001); «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002); «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2004); на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 печатных работ, из них 14 в центральных журналах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 413 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 92 рисунками и 49 таблицами. Библиографический указатель включает 699 источников, из них 81 отечественных и 618 иностранных.
Похожие диссертации на Механизмы регуляции активности естественных супрессорных клеток в норме и при опухолевом росте
