Введение к работе
Актуальность темы исследования
Проблема регуляции клеточной пролиферации в нормальных и трансформированных клетках — фундаментальная проблема биологии. Актуальность проблемы возрастает в связи широким распространением, особенно в последние годы, заболеваний, вызванных неконтролируемым делением клеток (доброкачественные и злокачественные опухоли и др.).
Механизмы, обеспечивающие пролиферацию клеток при прохождении клеточного цикла, мало доступны для изучения in vivo. Поэтому обычно в таких исследованиях используют культивируемые клетки (Варфоломеев С. Д., 1999). Очевидно, что такой подход не будет в полной мере отражать реальной динамики опухолевого роста в организме. Рост клеток в культуре определяется наличием эндогенных субстратов, продуктов жизнедеятельности и регуляторами, добавляемыми исследователем. В организме рост клеточной массы регулируется гораздо большим количеством эндогенных факторов. В частности, эндогенными ингибиторами пролиферации, которые не являются ни иммунными факторами, ни токсическими продуктами (Балаж А., 1982). Учесть влияние всех эндогенных факторов, определяющих рост опухоли в условиях организма, практически невозможно (Frame М.С., 2002). Тем не менее, можно проконтролировать их эффект на уровне клетки, поскольку они осуществляют свое воздействие через вторичные мессенджеры. Поэтому для решения проблемы оценки влияния эндогенных регуляторов на опухолевые клетки в разные фазы опухолевого роста достаточно определить уровень вторичных мессенджеров в клетке. При подсчете числа клеток, веса и объема опухоли выраженная S-образная форма кинетических кривых in vivo встречается довольно редко. Отклонения могут быть вызваны неоформленностью опухоли, наличием в ней неопухолевых клеток, ответными реакциями организма (Эммануэль Н.М., 1977). Однако при определенной схеме обработки кинетических исследований варианты опухолей обычно описывают с помощью S-образных кривых, поскольку при исследовании кинетики роста асцитной карциномы Эрлиха эффект организма на рост опухоли зачастую не учитывают. Другая проблема заключается в большом количестве факторов, повышение или понижение которых сопровождает активацию клеточного роста - это и катионы кальция, и уровень АФК, и рН„, а также
множество ростовых факторов и факторов транскрипции (Laurent А., 2005). Эти агенты необходимы в ходе клеточного деления, а влияния одного из них недостаточно. Тем не менее, для запуска каскада реакций пролиферации, скорее всего, требуются какой-то один фактор. Выяснить, который именно является пусковым, достаточно сложно. Работ, учитывающих одновременно большое количество факторов, необходимых для запуска роста клеточной массы, практически нет. Таким образом, оценить степень значимости каждого из них не представляется возможным. Хотя именно это важно для того, чтобы научиться управлять процессом клеточного роста при различных патологиях. Считается, что внутриклеточный кальций является наиболее важным мессенджером, регулирующим процессы пролиферации, дифференцировки, апоптоза и др. (Whitaker М., 2001, Laurent А., 2005, Luanna К.Р., 2003). С другой стороны, известно, что нейтрализация кислородных радикалов ингибирует пролиферацию (Benhar М, 2002). Более того, показано, что активные формы кислорода выступают в роли посредника между внеклеточным сигналом и внутриклеточными эффекторами. Именно они определяют уровень окислительно-восстановительного потенциала в клетке, регулирующего клеточный метаболизм, в том числе, уровень экспрессии генов (O'Loghlen А., 2005). С третьей стороны, величина рНш регулирует активность факторов, контролирующих экспрессию генов и клеточный цикл. Доказано, что снижение рН,„ тормозит G2/M переход клеточного цикла, а его повышение, наоборот, активирует. Очевидно, что эти 3 фактора - Са2+, активные формы кислорода и рН,„ - связаны между собой и влияют друг на друга (Luanna К.Р., 2003). Механизмы их взаимовлияния можно установить, только одновременно определив их уровень в клеточной популяции в момент подавления или стимуляции пролиферации.
Кроме того, определение корреляции между скоростью роста опухоли и физико-химическими параметрами, характеризующими функциональное состояние неопластической клетки - перспективный подход, как в изучении, так и в лечении рака.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - изучить механизмы влияния внутри- и внеклеточных факторов на регуляцию роста асцитной карциномы Эрлиха в условиях in vivo.
Цель исследования достигалась посредством решения следующих ЗАДАЧ:
Изучить качественный состав и функциональное состояние асцитных клеток в динамике роста опухоли.
Исследовать роль внутриклеточных регуляторов клеточной пролиферации (Са2+, рН, NAD(P)H) в развитии асцитной карциномы Эрлиха.
Исследовать физико-химические свойства цитоплазматической мембраны асцитных клеток.
Установить чувствительность асцитных клеток к АТФ в разные фазы роста карциномы Эрлиха.
Определить количество мононуклеарных клеток в селезенке в процессе роста карциномы Эрлиха.
Научная новизна исследования
Впервые получена динамика роста асцитной карциномы Эрлиха in vivo, которая отличалась от описанных в литературе подавлением роста опухоли на 12-е сутки после трансплантации опухоли и его стимуляцией на 13-е, что является дополнением к существующим представлениям о динамике опухолевого роста. В работе впервые проведено комплексное исследование динамики роста карциномы, которое позволило выявить закономерность между такими параметрами внутриклеточной сигнализации как [Са2+], NAD(P)H и рН. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что содержание катионов кальция в асцитных клетках в динамике роста зависит от наличия активных форм кислорода и эта зависимость определяется фазой опухолевого роста. Впервые выявлено, что эффект АТФ на асцитные клетки определяется фазой опухолевого роста и зависит от активных форм кислорода. Впервые показано, что в зависимости от фазы опухолевого роста повышение содержания катионов кальция в асцитных клетках осуществляется из разных источников - из внутриклеточных депо или внеклеточного пространства.
Практическая значимость исследования
Полученные результаты расширяют представление о механизмах взаимного влияния опухолевых клеток и клеток иммунной системы. Выявленные закономерности метаболических изменений в асцитных
клетках при стимуляции и торможении роста опухоли создают основу для разработки методов оптимизации путей коррекции патологических состояний организма, вызванных развитием опухоли. Исследование влияния АТФ на опухолевые клетки имеет практическую ценность в связи с его применением в медицинской практике в качестве фармакологического препарата, использующегося для подавления развития патологических процессов. Нами показано, что разнонаправленность эффектов АТФ может зависеть от функционального состояния клеток, определяющего скорость опухолевого роста, поскольку чувствительность асцитных клеток к АТФ зависит от фазы опухолевого роста. Наши данные доказывают, что действие фармакологических препаратов, использующихся в клинической практике для повышения содержания катионов кальция в неопластических клетках, в зависимости от стадии роста опухоли могут вместо цитотоксического эффекта стимулировать развитие гиперпролиферации, обостряющей течение онкологического процесса.
Основные положения диссертации используются в учебном процессе на Кафедре биофизики и биохимии и физиологии человека и животных Сибирского федерального университета.
Апробация результатов исследования
Результаты исследования докладывались на следующих конференциях: 18 съезде физиологического общества имени И.П. Павлова, г. Казань (2001); международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г. Пущино (2003); 19 съезде физиологического общества имени И.П. Павлова, г. Екатеринбург (2004); международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г. Пущино (2005); Межрегиональной научно-практической конференции «Объединение субъектов Российской федерации и проблемы природопользования в Приенисейской Сибири», г. Красноярск (2005); I Съезде физиологов СНГ, г. Сочи (2005). Работа прошла апробацию на Кафедре биофизики Красноярского государственного университета; на семинаре, проходившем в КНЦ СО РАН (2005); на научно-образовательном семинаре "Избранные главы биофизики" в Институте Биофизики СО РАН, г. Красноярск (2005), на Кафедре биохимии и физиологии человека и животных Красноярского государственного университета.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Кривая роста асцитной карциномы Эрлиха, полученная
нами в экспериментах in vivo, отличается от классической S-образной
провалом на 12-е сутки после трансплантации опухоли. Снижение
числа клеток в области провала объясняется подавлением их
митотической активности и стимуляцией гибели клеток путем
апоптоза.
Повышение содержания внутриклеточного Са2+, уровня NAD(P)H и рН в асцитных клетках стимулирует рост опухоли. Содержание катионов кальция в асцитных клетках не зависит от вязкости мембран, но определяется уровнем активных форм кислорода.
Чувствительность асцитных клеток к АТФ определяется фазой роста карциномы Эрлиха и зависит от уровня активных форм кислорода.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и списка сокращений. Работа иллюстрирована 29 рисунками, 6 таблицами и одной схемой. В список литературы включено 63 отечественных и 174 зарубежных источника.
