Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1.Общая характеристика макрофагов 13
1.1.1. Происхождение и созревание макрофагов 14
1.1.2. Фагоцитарная функция макрофагов 20
1.1.3. Секреторная функция макрофагов 25
1.2. Механизмы активации макрофагов 29
1.2.1. Классическая активация макрофагов 29
1.2.2. Альтернативная активация макрофагов 33
1.3. Паттерн-распознающие структуры макрофагов 35
1.3.1. Toll-like рецепторы 36
1.3.2. NOD рецепторы 38
1.4. Полисахариды как регуляторы функционального состояния макрофага 40
Заключение 48
Глава 2. Материал и методы исследований 51
Глава 3. Результаты собственных исследований 64
3.1. Активность NO-синтазы и аргиназы перитонеальных макрофагов при развитии ТЫ и Th2 типа иммунного ответа 64
3.1.1. Активность NO-синтазы и аргиназы перитонеальных макрофагов при развитии ТЫ типа иммунного ответа, индуцированного БЦЖ 65
3.1.2. Активность NO-синтазы и аргиназы перитонеальных макрофагов при развитии ТЫ типа иммунного ответа, индуцированного эритроцитами барана 70
3.1.2.1. Влияние ПС мать-и-мачехи на активность NO-синтазы и аргиназы перитонеальных макрофагов при развитии Thl типа иммунного ответа, индуцированного эритроцитами барана 70
3.1.3. Активность NO-синтазы и аргиназы перитонеальных макрофагов при развитии Th2 типа иммунного ответа 72
3.2. Влияние in vitro водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на баланс NO-синтазы/аргиназы и продукцию воспалительных и противовоспалительных цитокинов 75
3.2.1. Продукция оксида азота перитонеальными макрофагами при культивировании с различными концентрациями ПС календулы, аира и девясила 75
3.2.2. Продукция оксида азота перитонеальными макрофагами в присутствии растительных полисахаридов и полимиксина В 82
3.2.3. Сравнение действия липополисахарида и растительных полисахаридов на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами 84
3.2.4. Влияние различных концентраций ПС на индуцированную липополисахаридом продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами 87
3.2.5. Влияние различных концентраций ПС на индуцированную липополисахаридом активность аргиназы перитонеальных макрофагов. 89
3.2.6. Влияние ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на баланс NO-синтазы/аргиназы перитонеальных макрофагов 91
3.2.7. Влияние ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на продукцию ИЛ-12 и ИЛ-10 перитонеальными макрофагами 95
3.2.8. Влияние ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на продукцию TNF-a и ИЛ-10 мононуклеарами человека 96
3.3. Некоторые механизмы действия ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на функциональное состояние перитонеальных макрофагов 99
3.3.1. Роль р38 в механизмах действия ПС календулы и девясила на продукцию оксида азота и активность аргиназы перитонеальными макрофагами 99
3.3.2. Роль PI3K в механизмах действия ПС календулы и девясила на продукцию оксида азота и активность аргиназы перитонеальными макрофагами 101
3.4. Действие ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на ТЫ зависимый иммунный ответ, индуцированный эритроцитами барана 104
3.4.1. Состояние гуморального звена иммунитета у мышей, получавших курс ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила 104
3.4.2. Состояние клеточного звена иммунитета у мышей, получавших курс ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила 108.
3.5. Действие ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на Th2 зависимый иммунный ответ, индуцированный овальбумином 111
3.5.1. Влияние курсового введения ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на общую анафилаксию 111
3.5.2. Влияние курсового введения ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на уровень иммуноглобулинов классов Е и G1 в сыворотке крови 112
3.5.3. Влияние курсового введения ПС мать-и-мачехи на продукцию аллерген-специфических антител 115
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 119
Выводы 132
Список л 134
- Происхождение и созревание макрофагов
- Полисахариды как регуляторы функционального состояния макрофага
- Продукция оксида азота перитонеальными макрофагами при культивировании с различными концентрациями ПС календулы, аира и девясила
- Влияние курсового введения ПС мать-и-мачехи на продукцию аллерген-специфических антител
Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что недостаточная либо избыточная поляризация Т-хелперов (Th) лежит в основе патогенеза аутоиммунных, аллергических, хронических инфекционных и онкологических заболеваний. Поиск веществ, способных регулировать баланс Thl/Th2, является одной из ключевых задач современной иммунофармакологии.
Известно, что поляризация лимфоцитов зависит от функционального состояния антиген-презентирующих клеток, среди которых макрофаги занимают особое место, представляя собой важнейший элемент как системы естественной резистентности, так и приобретенного иммунитета. Они обеспечивают направление поляризации, продуцируя в раннюю фазу взаимодействия организма с антигеном цитокины и стимулируя развитие ТЫ (ИЛ-12) или Th2 типа иммунного ответа (ИЛ-10) [Alzona М. et al, 1995; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Mosser D.M., 2003; Gutcher I., Becher В, 2007].
Подобно Т-хелперам, клетки моноцитарно-макрофагального ряда также поляризуются в макрофаги 1 (Ml) или 2 (М2) типа [Mills CD. et al., 2000; Mantovani A. et al., 2004]. Ml клетки обладают воспалительными свойствами и способностью поддерживать Thl-зависимые иммунные реакции: продуцируют медиаторы воспаления (например, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, NO, TNF-a), проявляют повышенную способность фагоцитировать микроорганизмы, способствуют деструкции экстра-целлюлярного матрикса, стимулируют апоптоз инфицированных клеток [Goerdt S., Orfanos С.Е., 1999; Ehrt S. et al, 2001; Mosser D.M., 2003; Mantovani A., 2006]. Макрофаги M2 проявляют противовоспалительные характеристики, подавляют ТЫ ответ и способствуют протеканию Th2 ответа: секретируют вещества, противодействующие воспалению (ИЛ-10, антагонист рецептора ИЛ-1, трансформирующий фактор роста Р), экспрессируют аргиназу 1, продукты которой обеспечивают биосинтез белков, способствуют ангиогенезу, восстановлению поврежденной ткани, ремоделированию, очищают место воспаления от разрушенных тканей (в том числе от клеток, подвергшихся апоптозу), продуцируют хемоаттрактанты для привлечения Th2 [Goerdt S., Orfanos C.E., 1999; Ehrt S. et al., 2001; Mosser D.M, 2003; Mantovani A, 2006].
Одним из важнейших различий этих двух групп макрофагов, их маркерной чертой, является разные пути метаболизма аргинина: классически активированные макрофаги метаболизируют его с помощью индуцибельной NO-синтазы с образованием оксида азота и цитруллина; альтернативно активированные - с помощью аргиназы-1 (Arg), продуктами которой являются мочевина и орнитин [Munder М. et al., 1998; Kreider Т. et al., 2007].
Кроме цитокинового микроокружения тип активации макрофагов определяет и сам микроорганизм. Известно, что антиген-презентирующие клетки (АПК) несут на своей поверхности набор рецепторов (TLR, NLR, маннозный, скавенжер рецептор и др.), с помощью которых они взаимодействуют с патоген-ассоциированными структурами грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, грибов, вирусов [Gordon S. 2002; Medzhitov R., et al., 2000; Crocker P.R. 2005]. Среди компонентов, определяемых паттерн-распознающими структурами
макрофагальных клеток, находятся и полисахариды. Показано, что полисахариды микроорганизмов, грибов [Wasser S.P., 2002] и высших растений [Paulsen B.S., 2001; Kayser О. et al., 2003] обладают иммуномодулирующими свойствами благодаря способности изменять функциональное состояние антиген-презентирующих клеток (макрофаги и дендритные клетки) [Vecchiarelli А. 2000; Monari С. et al., 2002; Chiapello L. S. et al., 2003; Monari С et al., 2003; Vecchiarelli A. et al., 2003; Stingele F. et al, 2004]. Большинство полисахаридов из высших растений обладают низкой токсичностью и отсутствием нежелательных побочных эффектов, свойственных бактериальным и синтетическим полисахаридам, что делает их привлекательными для разработки фармакологических средств с иммуномодули-рующей, противоопухолевой и ранозаживляющей активностью [Schepetkin I.A., et al., 2006].
Известно, что различные полисахариды могут связываться с различными рецепторами антиген-презентирующих клеток [Schepetkin I.A.,Quinn М.Т., 2006], влиять на продукцию иммунорегуляторных цитокинов, на экспрессию различных молекул адгезии [Tzianabos А.О. 2000; Retini С, et al., 2001]. Так, например, полисахарид, выделенный из Acetobacter, распознавался рецептором макрофагов TLR-4 и индуцировал продукцию ИЛ-12, подавляя таким образом развившийся Th2 иммунный ответ [Saito К. et al., 2003] или стимулируя ТЫ иммунный ответ [Li W., et al., 2004]. Полисахариды, выделенные из другого источника (из Cryptococcus neoformans), напротив, индуцировали Th2 тип поляризации, вызывая активацию соответствующего типа макрофагов [Almeida G.M., et al., 2001].
Учитывая огромную роль, которую играют макрофаги, представляется актуальным выявить вещества, обладающие способностью регулировать функциональное состояние этих клеток.
Целью исследования явилось изучение влияния водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственной, девясила высокого на функциональное состояние макрофагов и иммунный ответ ТЫ и ТЪ2 типов.
Задачи исследования:
Изучить состояние активности NO-синтазы и аргиназы перитонеальных макрофагов при развитии ТЫ и Th2 типа иммунного ответа.
Исследовать влияние in vitro водорастворимых полисахаридов на баланс NO-синтазы/аргиназы перитонеальных макрофагов и продукцию воспалительных и противовоспалительных цитокинов.
Вскрыть некоторые механизмы регуляторного действия водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на функциональное состояние перитонеальных макрофагов (роль внутриклеточных мессенджеров Р13Кир38МАРК).
Оценить действие водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на ТЫ-зависимый иммунный ответ, индуцированный эритроцитами барана.
Изучить влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на Тп2-зависимый иммунный ответ, индуцированный овальбумином.
Научная новизна. В работе впервые изучен баланс NO-синтазы/аргиназы перитонеальных макрофагов животных с ТЫ и Th2 иммунным ответом, а также влияние водорастворимых полисахаридов, полученных из мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила, на эти типы ответа. Впервые проведено сравнение действия in vitro растительных полисахаридов (мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственнолй, девясила высокого) и липополисахарида на баланс NO-синтазы/аргиназы перитонеальных макрофагов и обнаружена их способность как к синергичному, так и к антагонистическому действию. Впервые изучено действие полисахаридов (мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственнолй, девясила высокого) на цитокинпродуцирующую активность макрофагов и мононуклеаров периферической крови человека. Показано, что данные вещества по совокупности результатов влияния на продукцию ци-токинов (ИЛ-12, TNF-a и ИЛ-10) поддерживают воспалительные свойства макрофагов. При этом впервые была выявлена роль некоторых внутриклеточных мес-сенджеров (PI3K, МАРК) в наблюдаемых эффектах. Впервые показано, что курсовое введение ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила стимулирует ТЫ тип иммунного ответа. Впервые установлено, что исследуемые растительные полисахариды проявляют противоаллергическое действие, подавляя анафилаксию и продукцию аллерген-специфических иммуноглобулинов.
Практическое значение работы. Полученные данные дают возможность яснее понять механизмы, лежащие в основе регуляции иммунного ответа и роль в этом макрофагальных клеток. Установлено, что исследованные полисахариды (мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственной, девясила высокого) обладают иммуномодулирующей активностью. Результаты, полученные при выполнении данной работы, позволяют обосновать использование данных водорастворимых растительных полисахаридов для коррекции иммунного ответа ТЫ и ТЪ2 типа. Полученные результаты могут лечь в основу дальнейших исследований с целью получения новых иммуномодуляторов, стимулирующих ТЫ-зависимые иммунологические реакции, а также средств для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний.
Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008), на X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармако-логии» (Казань, 2009).
Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных статей, из них 5 в изданиях, рекомендуемых ВАК; по результатам проведенных исследований получено 2 патента на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 5 рисунками и 30 таблицами. Библиографический указатель включает 205 источника, в том числе 56 отечественных и 149 иностранных.
Происхождение и созревание макрофагов
Мононуклеарные фагоциты происходят от общей гемопоэтической стволовой клетки (полипотентная стволовая клетка) [Маянский Д.Н, 1981; Дыгай A.M., Шахов В.П.,1989]. Далее происходит ряд последовательных этапов преобразования монобласта в промоноцит и моноцит костного мозга, а затем моноцит периферической крови. Причем уже на этих стадиях формирования обнаруживается заметная гетерогенность внутри пула моноцитов. К числу наиболее значительных признаков такой гетерогенности следует отнести постепенное обогащение клетки лизосомами. Превращение моноцита в макрофаг сопровождается появлением дополнительных гетерофаголизосом. Данный процесс начинается с эндоцитоза мелких частиц и их проникновением в пиноцитозные вакуоли или с поглощения более крупных частиц, их накоплением в фагосомах. Затем следует конъюгация фагосом с первичными лизосомами, что ведет к образованию вторичных гетерофаготических вакуолей, в которых происходит деградация поглощенных частиц. В дальнейшем образованные пиноцитозные пузырьки и фагосомы сливаются с фаголизосомами, в итоге последние увеличиваются в размере и приобретают полиморфизм [Карр Ян, 1978; Маянский А.Н., Маянский Д.Н, 1989].
Далее преобразование моноцита в макрофаг сопровождается увеличением разрыхленности цитоплазматической мембраны, адгезивных свойств и числа микроворсинок. За счет этого макрофаг легче фиксируется к чужеродной поверхности и распластывается на ней [Маянский А.Н., Маянский Д.Н, 1989].
По мере созревания макрофага меняется активность различных ферментов. Например, активность внутриклеточной пероксидазы, находящейся в гранулах, исчезает, в то время как содержание лизосомальных ферментов, напротив, увеличивается [Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981]. В процессе дифференцировки возрастает экспрессия Fc и СЗ рецепторов макрофагов, также увеличивается экспрессия рецепторов к цитокинам, инсулину, эстрогену и другим стимулам [Учитель И.Я., 1978; Маянский Д.Н., 1991].
Образование макрофагов в костном мозге находится под контролем целой группы ростовых факторов (ИЛ-3, GM-CSF, M-CSF), которые стимулируют митотическую активность предшественников моноцитов, а простагландин Е (PGE) и интерфероны (IFN-a, IFN-P) ингибируют деление этих клеток. Специфическим фактором роста для мононуклеарных фагоцитов считается M-CSF, продуцентами которого являются стромальные клетки костного мозга, фибробласты, эпителиальные клетки эндометрия. M-CSF стимулирует не только пролиферацию предшественников моноцитов, но и микробицидную активность зрелых клеток [Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000].
GM-CSF усиливает образование гранулоцитарных, макрофагальных и смешанных гранулоцито-макрофагальных колоний из клеток костного мозга, кроме того, GM-CSF стимулирует и функции макрофагов [Маянский Д.Н., 1981; Симбирцев А.С., 2004].
Мульти-КСФ (ИЛ-3) обладает широким спектром гемопоэтической активности, так как кроме гранулоцитов и макрофагов активирует образование колоний эозинофилов, мегакариоцитов, эритроидных и тучных клеток [Маянский Д.Н., 1981; Симбирцев А.С., 2004].
Известно, что образовавшиеся в костном мозге моноциты менее чем через сутки мигрируют в периферическую кровь. Показано, что закономерная миграция моноцитов из кровотока в ткани опосредована экспрессией на моноцитах и на эндотелиальных клетках специализированных адгезионных молекул. Экспрессия адгезионных молекул на эндотелиальных клетках и моноцитах стимулируется провоспалительными цитокинами: ИЛ-1, ИЛ-6, IFN-y, TNF-a. Те же цитокины, а также хемоаттрактанты С5а, IL-8, PAF, LTB4 модулируют экспрессию адгезионных молекул и на моноцитах. По мере дифференцировки моноцита в макрофаг повышается экспрессия CDllc/CD18 молекул. Последующая адгезия моноцитов опосредована следующими адгезионными молекулами: CDlla/CD18, VLA-4, ICAM-1 и VCAM-1. Дальнейшее взаимодействие LFA-1 с ICAM-1 и ICAM-2 или VLA-4 с VCAM-1 обеспечивает адгезию моноцитов на эндотелиальных клетках, после чего следует распластывание моноцитов по поверхности эндотелиальных клеток и их проникновение между двух соседних эндотелиальных клеток, преодоление моноцитами базальной мембраны и выход их в ткани. Этот процесс является обычной стадией их жизненного цикла [Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000].
Зрелый макрофаг - это крупная клетка диаметром 20-80 мкм, имеющая овальное или почковидное ядро, эксцентрически расположенное и окруженное цитосферой, содержащей лизосомы и эндоцитозные вакуоли [Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Гордиенко СМ., 1983]
Наружная плазматическая мембрана макрофагов является активно функционирующей структурой благодаря наличию в них единой системы мембран, связанной со всеми внутренними структурами клетки. Через наружную мембрану макрофаги получают не только необходимые им питательные вещества, но и определенные сигналы, воспринимаемые рецепторами. Кроме того, на поверхности мембраны макрофага расположено множество антигенных детерминант, по наличию или отсутствию которых можно судить о тканевой принадлежности макрофагов и о степени их зрелости [Болотников И.А., Иноземцева Л.И, 1990].
Дальнейшее превращение и дифференцировка в тканевые макрофаги происходит в тканях. Морфологически и функционально все тканевые макрофаги отличаются друг от друга, поскольку находятся на различной стадии дифференцировки [Карр Я., 1978; Фрейдлин И.С., 1984; Хаитов P.M., Земсков В.И., 1995]. Таким образом, популяция макрофагов, с одной стороны, является разнородной «по вертикали» благодаря присутствию в кровотоке моноцитов, а в тканях - макрофагов разной степени зрелости. С другой стороны, она гетерогенна «по горизонтали» благодаря одновременному присутствию в ее составе разных классов органо- и тканеспецифических макрофагов. Кроме этого, макрофаги одного и того же уровня дифференцировки могут находиться либо в состоянии покоя, либо в разной степени активности, что еще более расширяет морфофункциональную вариабельность популяции. В связи с этим, в литературе при описании действующих макрофагов в разное время употреблялись разные термины. Так, ранее макрофаги классифицировали как активированные, спровоцированные и специфически кондиционированные. К активированным относили клетки, зараженные микобактериями туберкулеза, грибами и различными паразитами. Спровоцированными макрофагами авторы называли такие клетки, которые скапливаются в месте введения пептона, гликогена, частиц латекса и т.д., а специфическими кондиционированными — макрофаги, стимулированные цитокинами [Маянский Д.Н., 1981]. Позже было предложено делить макрофаги на нестимулированные, примированные и полностью активированные [Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989]. Для примированных клеток характерным является чувствительность на повторные стимулы, в качестве которых могут выступать липополисахарид, форболовые смолы, Са -ионофоры. К полностью активированным клеткам данные исследователи относят макрофаги, для которых характерно максимальное проявление цитотоксического эффекта.
Наряду с этим, существует деление макрофагов на тканевые (резидентные) и свободные. Макрофаги-резиденты — это клетки постоянно присутствующие в органах и тканях. Такие клетки первыми реагируют на индукторы воспаления и начинают генерировать широкий набор биологически активных веществ (компоненты комплемента, простагландины, цитокины и др.). В связи с этим макрофаги-резиденты называют первой линией защиты организма. Однако сами по себе макрофаги-резиденты не могут обеспечить полную- картину воспаления, выступая» лишь в качестве пускового момента. Кроме того, макрофаги-резиденты выполняют функции, необходимые органу, где они находятся. Так, например, клетки Купфера кроме общей фагоцитарной функции (эти клетки могут захватывать отработавшие эритроциты, тромбоциты, продукты распада других клеток, митохондрии, микроорганизмы) обладают способностью активно участвовать в обмене липидов и желчных пигментов, а также в метаболизме инсулина и кортикостероидов. Клетки Купфера участвуют также в презентации антигенов и обладают выраженной секреторной активностью [Маянский Д.Н., 1981].
Резидентные макрофаги разных тканей отличаются от циркулирующих моноцитов тем, что имеют низкий уровень потребления кислорода, небольшую скорость синтеза белка и очень умеренную интенсивность продукции цитокинов [Grage-Griebenow Е. et al., 2001; Hume D.A. et all, 2002]. Возникающее при повреждении ткани или инфекции воспаление вызывает активацию резидентных- макрофагов, приводя- к увеличению продукции ими цитокинов, хемокинов и других медиаторов воспаления, а также к привлечению очаг воспаления моноцитов периферическойкрови.
Блуждающие, или свободные макрофаги - крупные клетки с большим количеством микроворсинок, которые постоянно перемещаются через различные ткани в поисках фагоцитируемого материала. Они быстро «расползаются» по организму в ответ на инфекцию, травму или поступление пищи [Хаитов P.M. и др. 1995].
Полисахариды как регуляторы функционального состояния макрофага
Известно, что полисахариды (ПС) являются классическими представителями Т-независимых антигенов, которые не влияют на клеточно-опосредованные иммунологические реакции. Такое мнение сложилось из многочисленных данных о том, что большинство бактериальных полисахаридов вызывает гуморальный ответ с преобладанием низкоаффинных иммуноглобулинов класса М и небольшого количества антител IgG [Tzianabos А.О., 2000]. Такой иммунный ответ длится недолго из-за отсутствия поддержки со стороны Т-лимфоцитов в развитии иммунологической памяти. Считалось, что антиген-презентирующие клетки не способны процессировать полисахаридные антигены [Tzianabos А.О., 2000].
Однако в более поздних работах было показано, что некоторые полисахариды микробного происхождения действуют как мощные иммуномодуляторы, активируя Т-, В-лимфоциты и антиген-презентирующие клетки, такие как моноциты и макрофаги. Кроме того, к настоящему времени показано, что ПС обладают широким спектром иммуномодуляторных потенций, например, они способны изменять продукцию различных иммунорегуляторных цитокинов, экспрессию различных молекул адгезии [Tzianabos А.О., 2000; Retini С. et al., 2001]. Несмотря на то, что ПС влияют на широкий круг клеток (макрофаги, нейтрофильные лейкоциты, натуральные киллеры, Т-лимфоциты), однако основными клетками, непосредственно взаимодействующими с ПС (помимо В-клеток), являются АПК (макрофаги и дендритные клетки) [Vecchiarelli А. 2000; Monari С. et al., 2002; Chiapello L. S. et al., 2003; Monari C. et al., 2003; Vecchiarelli A. et al., 2003; Stingele F. et al., 2004].
Показано, что иммуномодулирующими свойствами обладают полисахариды микроорганизмов, грибов [Wasser S.P., 2002] и высших растений [Paulsen B.S., 2001; Kayser О. et al., 2003]. Полисахариды растительного происхождения могут проявлять противовоспалительные [Moreno L. et al., 1998], антигипогликемические [Sanchez de Medina F. et al., 1994], антибактериальные [Johnston W.H. et al., 2001] и противоопухолевые свойства [AH A.M. et al., 1996].
Несмотря на многочисленные работы по изучению действия полисахаридов на макрофаги, лишь в части литературы проводилось сопоставление химической структуры и биологических свойств. Наиболее хорошо охарактеризованы следующие химические группы полисахаридов: амфотерные полисахариды капсулярного полисахаридного комплекса микроорганизмов (например, полисахарид А), р-(1-3)-глюканы (например, выделенный из пекарских дрожжей), маннаны, связанные с протеинами полисахариды (ПС К и ПС Р), гиалуроновая кислота [Tzianabos А.О., 2000].
Полисахарид А (ПС А) выделен из капсулы грам-негативной анаэробной бактерии Bacteroides fragilis, содержит две противоположно заряженные группы. Известно, что ПС А состоит из повторяющихся субъединиц, которые являются трисахаридами с галактофуранозной боковой цепью. При внутрибрюшинном введении экспериментальным животным может вызывать развитие абсцесса. Если перед введением проиммунизировать животных подкожной инъекцией ПС А, то это предотвратит развитие абсцесса [Tzianabos А.О., 2000]. Способность как индуцировать, так и предотвращать развитие абсцесса переносилось адоптивно Т-лимфоцитами, при этом В-лимфоциты такой способностью не обладали. Кроме того, выявлено, что капсулярный полисахаридный комплекс стимулировал CD4+ клетки, увеличивая пролиферацию и повышая секрецию ими ИЛ-2, IFN-y и ИЛ-10, но не ИЛ-4. Такой набор цитокинов не характерен для классического Thl или Th2 профиля, а похож скорее на их комбинацию [Tzianabos А.О., 2000]. Такой набор цитокинов наблюдается и при ответе на суперантиген стафилококкового энтеротоксина В, при котором в раннюю фазу уровень ИЛ-2 и IFN-y повышается, а позже (через 48 ч) усиливается выработка ИЛ-10 [Assenmacher М. et al., 1998]. Было показано, что? капсулярные полисахаридные комплексы Bacteroides fragilis при действии in vitro стимулируют продукцию перитонеальными макрофагами-мыши TNF-a и ИЛ-la, активированные макрофаги затем взаимодействуют с мезотелиальными клетками, повышая экспрессию ими молекул адгезии ICAM-1 (лиганд для полиморфноядерных лейкоцитов). Кроме того, эти комплексы стимулируют выработку ИЛ-8 мононуклеарами периферической крови человека. Однако главная роль в индукции или предотвращении абсцесса с помощью капсулярного1 полисахаридного комплекса бактерий принадлежит не макрофагальным клеткам, а Т-лимфоцитам. Именно они являются основной мишенью действия данных полисахаридов [Tzianabos А.О., 2000].
Р-(1-3)-глюканы представляют собой гомополимеры глюкозы. Их получают из грибов и дрожжей в водонерастворимом или водорастворимом виде, что зависит от экспериментальных манипуляций. При введении мышам разных по молекулярной массе фракций наблюдали активацию перитонеальных макрофагов, повышение их фосфатазной активности и увеличение ЛПС-индуцированной продукции оксида азота [Cleary J.A. et al., 1999]. Наиболее хорошо изучены водорастворимые Р-(1-3)-глюканы, поскольку они представляют наибольший интерес в плане клинического применения [Tzianabos А.О., 2000].
Исследование биологических свойств Р-(1-3)-глюканов, проводимые с 60-х годов прошлого века, показало, что они обладают противоопухолевым» действием и способностью предотвращать инфекционные заболевания [Bleicher P., Mackin W., 1995]. Показано, что Р-(1-3)-глюканы неспецифически активируют клеточный и гуморальный компоненты иммунной системы, повышают противомикробную активность мононуклеаров и нейтрофилов, стимулируют функциональную активность макрофагов, а также обладают мощным гемопоэтическим действием [Tzianabos А.О., 2000]. Противоинфекционное действие р-(1-3)-глюканов было изучено на моделях бактериальных, грибковых, паразитарных и вирусных моделях, на многих из которых выявлена способность уменьшать смертность животных.
Показано, что нерастворимые Р (1-3)-глюканы стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, TNF-a, ИЛ-2) и эикозаноидов. В то же время растворимые Р-(1-3)-глюканы обладали способностью предотвращать бактериальный сепсис у животных. Показано, что введение этих веществ вызывает увеличение количества циркулирующих нейтрофилов и усиление пролиферации костномозговых клеток. Нейтрофилы животных, получавших Р-(1-3)-глюканы, проявляли повышенную способность фагоцитировать Е. coli in vitro [Tzianabos A.O., 2000]. Выделенные из общей фракции р-(1-3)-глюканов PGG-глюканы с Р 1,6 ответвлениями обладали подобными свойствами. Было обнаружено, что введение PGG-глюканов мышам или крысам перед бактериальным заражением защищало от летального перитонита, что зависело от вводимой дозы. Этот эффект можно было перенести с помощью спленоцитов, которые, как выяснилось позже, продуцировали повышенные количества простагландинов. Показано, что лимфоциты и макрофаги животных, получавших PGG-глюканы, при стимуляции их in vitro ЛПС или суперантигеном, вырабатывали значительно меньше TNF-a и других провоспалительных цитокинов. Кроме того, введение PGG-глюканов увеличивало уровень клеточного апоптоза, подтверждая предположение о том, что влияние PGG-глюканов на сепсис связано в том числе, и с уменьшением количества клеток, вырабатывающих воспалительные медиаторы. При культивировании in vitro мононуклеаров с PGG-глюканами наблюдалось усиление их бактерицидных свойств. Однако это не связано с прямым действием на фагоциты, поскольку не приводило к усилению продукции кислородных радикалов или провоспалительных цитокинов, но вызывало примирование полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов для последующей активации опсонизированными бактериями [Tzianabos А.О., 2000].
Известно, что в основе биологических эффектов (З-(І-З)-глюканов лежит их свойство непосредственно взаимодействовать с макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами [Tzianabos А.О., 2000]. Для некоторых глюканов, но не для PGG-глюканов, рецептором, связывающим их на поверхности макрофага, является рецептор к 3 компоненту комплемента (CR3). Связывание Р-(1-3)-глюканов с клеткой приводит к активации определенных сигнальных путей. Так, для PGG-глюканов показана активация NF-kB- и NF-IL-6-подобных траскрипционных факторов. Известно, что сигнальная трасдукция у ЛПС и р-(1-3)-глюканов различна [WakshullE. etal., 1999].
Основным источником Р-глюканов растительного происхождения являются грибы [Schepetkin LA., Quinn М.Т., 2006]. Макрофаги распознают данные полисахариды с использованием ряда паттерн-распознающих структур: TLR4, скавенжер рецептор, CD 14. В литературе также упоминается «Р-глюкановый» рецептор, однако пока не ясно, представляет ли он собой особый рецептор или принадлежит к известным паттерн-распознающим структурам [Schepetkin LA., Quinn М.Т., 2006].
Продукция оксида азота перитонеальными макрофагами при культивировании с различными концентрациями ПС календулы, аира и девясила
Для установления оптимальных концентраций исследуемых веществ в экспериментах in vitro был использован широкий диапазон доз ПС (2,5-1000 мкг/мл), а культивирование проводили также с добавлением факторов Т-лимфоцитов, в качестве которых использовали супернатант митоген-стимулированных спленоцитов интактных животных (30% от общего объёма). В этих экспериментах мы использовали общую фракцию клеток, полученных из перитонеальнои полости, не удаляя из суспензии неприлипающие клетки. Клетки культивировали 72 ч с различными концентрациями полисахаридов, затем в надосадке определяли концентрацию нитритов.
ПС календулы в концентрации свыше 60 мкг/мл вызывают ингибирование продукции оксида азота как в отсутствии Т-клеточных факторов (рис. 1), так и в их присутствии (рис. 2). По изученному показателю оптимальной является концентрация ПС календулы до 20 мкг/мл. Исследование влияния полисахаридов аира показало (рис. 3 и 4), что диапазон оптимальных концентраций в данном случае более широк, чем у ПС календулы. Концентрации более 60 мкг/мл также подавляют выработку NO. Как видно из рисунка 5, полисахариды девясила также ингибировали продукцию оксида азота при концентрации более 20 мкг/мл.
Таким образом, концентрации различных полисахаридов свыше 60 мкг/мл являются ингибиторными для NO-синтазы, а оптимальным диапазоном следует считать концентрации до 20 мкг/мл. Кроме того, полученные результаты показали, что для получения более однородных данных следует использовать не перитонеальные клетки, а популяцию, обогащенную макрофагами, что достигается удалением не прилипающих клеток из суспензии перитонеальных клеток. Дальнейшие эксперименты были проведены с учётом этих выводов.
Влияние курсового введения ПС мать-и-мачехи на продукцию аллерген-специфических антител
Влияние полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, на продукцию IgE- и IgGl-аллерген-специфических антител в сыворотке иммунизированных мышей определяли методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА) с использованием беспородных крыс и мышей [Хаитов P.M. с соавт., 1999].
Титры IgGl и IgE антител, специфических к OVA, определяли на беспородных мышах и крысах соответственно. Сыворотку крови иммунизированных OVA мышей в различных разведениях вводили внутрикожно в область спины интактных мышей и крыс, после чего внутривенно вводили разрешающую дозу в растворе синего Эванса и затем оценивали интенсивность ПКА по площади окрашенных участков кожи.
Полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, вызывали снижение уровня специфических к OVA IgGl антител в сыворотке крови мышей (табл. 29). Площадь окрашенных участков кожи при введении сыворотки иммунизированных животных была значительно ниже, чем при введении сыворотки мышей контрольной группы, не получавшей полисахариды. При использовании максимального количества (разведение 1/4) сыворотки наблюдалось снижение окрашенной площади кожи на 60%, при введении сыворотки в разведении 1/8 - на 85%, а при введении сыворотки, разведенной 1/16, площадь окрашенного участка уменьшилась на 90%. Более того реакцию ПКА в разведении 1/16 не вызвала сыворотка 20% мышей опытной группы. Таким образом, курсовое введение полисахаридов мать-и-мачехи приводило к снижению концентрации антиген-специфических IgGl антител.
Введение полисахаридов вызывало также снижение уровня IgE антител, специфических к OVA, в сыворотке крови дважды иммунизированных мышей (табл. 30). Реакция ПКА, вызываемая разведенной 1/4 сывороткой мышей опытной группы, была на 73% ниже, чем реакция, индуцированная сывороткой животных контрольной группы. Сыворотка животных, получавших полисахариды, в разведении 1/8 и 1/16 также вызывала более слабую реакцию, чем сыворотка мышей контрольной группы - на 85% и 76% соответственно. Следовательно, введение полисахаридов травы мать-и-мачехи приводило к уменьшению продукции аллерген-специфических IgE антител.
Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют, что полисахариды, полученные из травы мать-и-мачехи, способны подавлять развитие Тп2-зависимого иммунного ответа, вызывая снижение синтеза аллерген-специфических иммуноглобулинов классов Е и G1, что приводит к торможению развития дальнейших событий, связанных с выработкой и высвобождением биологически активных веществ, оказывающих повреждающее действие на клетки и ткани.
![Диастолическая дисфункция левого желудочка и нарушения сосудистой регуляции при высоком нормальном артериальном давлении у лиц с различной физической активностью в условиях Севера [Электронный ресурс]](/i/i/4282/208982.png "Диастолическая дисфункция левого желудочка и нарушения сосудистой регуляции при высоком нормальном артериальном давлении у лиц с различной физической активностью в условиях Севера [Электронный ресурс] Петриченко Оксана Григорьевна")