Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИП — иодид пропидия;
МТТ — бромид (3,4-5 диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия;
ЧСС — частота сердечных сокращений;
AIF - фактор индукции апоптоза (apoptosis inducing factor);
ANT — транслокатор адениновых нуклеотидов;
CARDs - домены активации и рекрутирования каспаз (caspase activation
and recruitment domains);
CsA - циклоспорин A;
DDs — домены смерти (death domains);
DEDs — эффекторные домены смерти (death effector domains);
HSE — промотор генов HSP, heat shock element;
HSFs — факторы транскрипции (heat shock transcription factors);
HSPs — белки теплового шока;
L-NNA — №-нитро-Ь-аргинин;
mAv|/ — митохондриальный трансмембранный потенциал;
NO — оксид азота;
NOS — NO-синтаза;
PBST — Tween-20 в фосфатном буфере;
РТР - неспецифическая пора (permeability transition pore);
SHR — спонтанно-гипертензивные крысы;
TMRM — эфир тетраметилродамина;
VDAC - потенциал-зависимый анионный канал
Введение к работе
Развитие множества различных заболеваний сопровождается повышением интенсивности гибели клеток. Гибель клеток может происходить двумя основными путями - апоптотическим и некротическим. Некроз сопровождается разрушением плазматической мембраны и лизисом клеток; этот тип гибели наблюдается при остром повреждении, приводящем к быстрому истощению всех энергетических ресурсов клетки (Haslett, 1992). Апоптоз представляет собой более медленный, регулируемый процесс гибели. При этом клетка постепенно фрагментируется и поглощается соседними клетками (Kerr et al., 1972). К настоящему моменту признано, что митохондрии являются ключевыми органеллами, участвующими в процессе гибели клетки (Duchen, 1999).
При заболеваниях сердечно-сосудистой системы, например, артериальной гипертензии (Liu et al., 2000), сердечной недостаточности (Narula et al., 1999), атеросклерозе (Rossig et al., 2001) наблюдается повышение интенсивности апоптотической гибели клеток сердца и сосудов. Кроме того, при ишемическом и реперфузионном повреждении сердца часть кардиомиоцитов гибнет апоптотическим путем (Fliss, Gattinger, 1996), хотя в центре очага повреждения наблюдается некроз ткани сердца (Majno, Joris, 1995).
Адаптация организма к факторам среды значительно повышает его устойчивость к таким заболеваниям, как артериальная гипертензия (Машина и др., 2001; Manukhina et al., 2000) и атеросклероз (Meerson, 1994). Для защиты от ишемического и реперфузионного повреждения сердца широко используются модели ишемического и теплового прекондиционирования (Bolli, 2000); в экспериментах применяется также адаптация организма к стрессу (Meerson, Malyshev, 1989). Механизмы такой защиты до сих пор изучены недостаточно. К настоящему времени известно, что оксид азота (N0) принимает участие в развитии защитных эффектов как адаптации организма (Малышев, Манухина, 1998), так и прекондиционирования (ВоШ, 2000). На клеточном уровне действие NO связано с антиапоптотическими (Kim et al., 1999), антиоксидантними (Siow et al., 1999), противовоспалительными механизмами (Lamas S et al., 1998) и эффектами, опосредованными продукцией цГМФ (Du Toit et al., 1998). Кроме того, NO способен активировать синтез защитных стресс-белков группы белков теплового шока (HSPs) (Malyshev et al., 1995, 1996). Первоначально считали, что накопление HSPs приводит к повышению теплоустойчивости, но позднее были получены доказательства того, что HSPs повышают устойчивость клетки и организма к различным стрессам, таким как гипоксия, действие тяжелых металлов, оксидативный стресс, компоненты бактериальных клеток и вирусов и т.д. (Jaattela, Wissing, 1992 Lepore et al., 2001). Главные внутриклеточные механизмы защитного действия HSPs состоят в дезагрегации аномальных белковых комплексов, утилизации и репарации поврежденных белков, регуляции синтеза белка de novo (Mizzen, Welch, 1988; Hightower et al., 1994). Кроме того, HSPs могут ограничивать гиперпродукцию NO и обладают антиапоптотическим действием (Lang et al., 2002; Klein, Brune, 2002).
Антиапоптотическое действие NO и HSPs наводит на мысль о возможности антиапоптотического действия адаптации, так как оба эти вещества синтезируются в процессе адаптации к разным факторам (Меерсон и др., 1994; Манухина и др., 1996; Kuroshima, 1995; Meerson, Malyshev, 1993). Однако до настоящего момента исследований адаптационной защиты клеток от различных типов гибели не проводилось. До последнего времени существующая концепция адаптации также оставляла открытым важный вопрос: в какой мере формирование адаптационной клеточной линии защиты зависит от центральных механизмов, а в какой мере она детерминирована внутриклеточными механизмами, непосредственно реагирующими на фактор, к которому происходит адаптация. Для решения этого вопроса необходимо было выяснить, возможно ли формирование адаптационных защитных эффектов в условиях культуры клеток, когда действие нервных и гуморальных факторов на клетки отсутствует.
Если адаптация культуры клеток возможна, возникает другой важный вопрос: за счет каких клеточных механизмов это может происходить, и играет ли NO-зависимая активация синтеза Hsp70 в адаптации изолированных клеток такую же важную роль, как при адаптации целого организма? Такие исследования необходимы для понимания механизмов формирования адаптации, в частности, механизмов адаптационной защиты при различных патологических состояниях, связанных с усилением апоптотической гибели клеток организма.
В соответствии с вышеизложенным, цель настоящего исследования состояла в изучении возможности адаптационной зашиты организма и культуры клеток от различных типов клеточной гибели и исследовании возможных внутриклеточных механизмов, вовлеченных в развитие такой защиты.
В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:
1. Изучить влияние дозированной адаптации организма к теплу на развитие ишемического и реперфузионного повреждения сердца крыс на разных стадиях этого повреждения.
2. Разработать модель дозированной адаптации к теплу на культуре клеток, обладающую защитным эффектом.
Оценить возможность адаптационного предупреждения повреждения клеток при воздействиях разного типа.
Оценить селективность защитного эффекта предварительной адаптации культуры клеток к теплу в отношении некроза и апоптоза на модели повреждения ставроспорином.
Изучить влияние адаптации клеток к теплу на митохондриальный трансмембранный потенциал (mA\j/) в нормальных условиях и при индукции апоптоза в клетках.
Изучить роль NO в защитном эффекте адаптации культуры клеток к теплу путем оценки влияния адаптации на синтез NO и влияния ингибитора NO-синтазы (NOS) на развитие защитных эффектов адаптации при различных типах повреждения клеток.
Изучить роль HSPs в защитном эффекте адаптации культуры клеток к теплу путем оценки влияния адаптации на синтез Hsp70, Hsp27 и Hsp32 и влияния ингибитора синтеза HSPs на развитие защитных эффектов адаптации культуры клеток к теплу при различных типах повреждения клеток.
Изучить влияние ингибитора NOS на синтез HSPs в культуре клеток.
Оценить специфичность защитных механизмов адаптации к теплу путем их сравнения в клетках двух типов - кардиомиобластах и миобластах.
Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами.
Впервые показано, что дозированная адаптация крыс к теплу эффективно защищает сердце от ишемического и реперфузионного повреждения. Защитный эффект проявляется в ограничении сердечных аритмий на разных сроках ишемии и реперфузии и достоверной задержке появления этих нарушений после начала ишемического повреждения сердца.
Впервые разработана шестидневная модель дозированной адаптации к теплу культуры кардиомиобластов. На этой модели показано, что предварительная адаптация защищает культуру клеток от повреждающего действия ставроспорина и теплового шока, но не защищает от оксидативного повреждения, вызванного терт-бутил гидроперекисью. Таким образом, впервые установлено, что адаптация может формироваться в отсутствие нейрогуморальных факторов, и что защитный эффект такой адаптации специфичен в отношении вида повреждающего воздействия.
Впервые показана возможность избирательного защитного действия адаптации культуры клеток к теплу в отношении апоптотической, но не некротической клеточной гибели.
Впервые показано, что дозированная адаптация клеток к теплу приводит к небольшой, но стойкой деполяризации митохондриальной мембраны. Мощная деполяризация митохондрий, характерная для действия ставроспорина, сохранялась в адаптированных клетках, однако степень повреждения клеток при этом была меньше, чем в контроле.
Впервые показано увеличение продукции NO кардиомиобластами в ходе адаптации к теплу. При этом установлено, что NO-зависимые механизмы вовлечены в адаптационную защиту от теплового шока, но не от повреждения, вызванного ставроспорином.
Впервые показано увеличение синтеза Hsp70 и Hsp32 после адаптации кардиомиобластов к теплу и отсутствие действия адаптации на синтез Hsp27. Показано, что HSPs не играют роли в развитии адаптационной защиты культуры клеток.
Впервые показано избирательное участие NO в регуляции синтеза различных белков HSPs в клетках: так, ингибитор синтеза NO препятствовал накоплению Hsp70, однако потенцировал накопление Hsp32 при адаптации к теплу и Hsp27 при тепловом шоке.
Впервые сопоставлено развитие защитных эффектов адаптации к теплу в двух культурах клеток различного происхождения: кардиомиобластах и миобластах. Показано, что развитие адаптационной защиты характеризуется общими закономерностями при различных типах повреждения и избирательностью в отношении апоптоза, но не некроза. Также адаптация к теплу оказывала сходное действие на mAvj/ в обоих типах клеток. Однако наблюдались различия во вкладе N0 в развитие адаптационной защиты разных типов клеток: по-видимому, NO-зависимые механизмы защиты более специфичны для кардиомиобластов. Кроме того, показано различное действие адаптации на синтез HSPs в разных типах клеток.
Теоретическое значение работы состоит в том, что в ней продемонстрирована возможность формирования защитных эффектов адаптации в результате прямого действия фактора среды на клетки в отсутствии нейрогуморальных механизмов. Показано, что адаптация избирательно ограничивает апоптотическую, но не некротическую гибель клеток. Проанализирована роль митохондрий, NO и Hsp70 в антиапоптотическом эффекте адаптации клеток. При этом изучена клеточная специфичность адаптационной активации эндогенных защитных механизмов.
Практическое значение работы состоит в том, что данные об избирательности защитного действия адаптации при разных формах гибели клеток, позволят в дальнейшем использовать методы адаптационной медицины для лечения и профилактики заболеваний, обусловленных преимущественно апоптотической гибелью клеток. Положения, выносимые на защиту:
Адаптация организма к теплу эффективно защищает сердце от аритмических нарушений при ишемическом и реперфузионном повреждении.
Адаптация к теплу и адаптационная защита могут формироваться в культуре клеток в отсутствие нейрогуморальных влияний.
Адаптация к теплу культуры клеток избирательно ограничивает развитие апоптоза, но не некроза. NO играет важную роль в развитии адаптационной защиты кардиомиобластов от повреждения при тепловом шоке, но при этом механизм действия NO не опосредован индукцией синтеза HSPs.
Апробация работы. Основные результаты проведенных исследований были доложены на межлабораторном семинаре Отдела хирургических исследований Института Медицинских Исследований при клинике Нортвик-парк (Лондон, Великобритания, 2000), II международной научно- практической конференции «Дисфункции эндотелия» (Витебск, Россия, 2001), Национальной научно-практической конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, Россия, 2001), XVII Всемирном Конгрессе Международного общества по изучению сердца (Виннипег, Канада, 2001), семинаре кафедры Физиологии Университетского Колледжа Лондона (Лондон, Великобритания, 2001), межлабораторном семинаре Университетского * Колледжа Лондона, посвященном роли митохондрий в развитии апоптоза (Лондон, Великобритания, 2002).
