Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Механизмы воздействия магнитных полей на биологические объекты в норме и при опухолевом процессе 10
1.2 Молекулярные механизмы окислительного стресса, характеристика ферментативного звена антиоксидантной системы 17
1.3 Оксид азота и его роль в неопластическом процессе 22
1.4 Апоптоз и некроз в опухолевой ткани 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1 Экспериментальная модель 37
2.2 Определение активности ферментов антиоксидантной системы и выраженности процессов ПОЛ у животных - опухоленосителей 39
2.3 Измерение суммарной концентрации нитратов и нитритов в асцитической жидкости 43
2.4 Исследование блеббинга плазматической мембраны клеток АКЭ, анализ проницаемости цитоплазматической мембраны и экспрессии фос-фатидилсерина на ее наружной поверхности 44
2.5 Определение микровязкости и трансмембранного потенциала ци-топлазматической и митохондриальной мембран клеток АКЭ 44
2.6 Методы статистического анализа 46
Глава 3. Результаты собственных исследований 47
3.1 Влияние комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на активность ферментов антиоксидантной системы и выраженность процессов ПОЛ у животных - опухоленосителей 47
3.2 Влияние комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на концентрацию быстрых и медленных SH-групп в клетках АКЭ и асцитической жидкости 56
3.3 Влияние комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на микровязкость плазматических и митохондриальных мембран клеток АКЭ 58
3.4 Изменение продукции оксида азота клетками АКЭ в процессе развития опухоли и при действии магнитного поля 59
3.5 Влияние комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на процессы экстернализации фосфатидилсерина и блеббинг плазматической мембраны клеток АКЭ 66
3.6 Влияние комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на величину трансмембранного потенциала и функцию мито-хондрий клеток АКЭ 74
3.7 Влияние комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на выживаемость животных - опухоленосителеи, скорость
накопления асцитической жидкости и величину опухолевого узла 77
Глава 4. Обсуждение 82
Выводы 93
Список цитируемой литературы 95
- Механизмы воздействия магнитных полей на биологические объекты в норме и при опухолевом процессе
- Молекулярные механизмы окислительного стресса, характеристика ферментативного звена антиоксидантной системы
- Экспериментальная модель
- Влияние комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на активность ферментов антиоксидантной системы и выраженность процессов ПОЛ у животных - опухоленосителей
Введение к работе
Актуальность проблемы: В последние десятилетия интенсивно развивается перспективная область медицины - электромагнитотерапия, основанная на использовании биологического и лечебного действия электромагнитных полей. Накоплен большой объем фактического материала, вместе с тем природа биологических эффектов слабых электромагнитных полей остается окончательно не выясненной (A.M. Сташков, 1998; З.А. Овечкина, 2001; В.Н. Бинги и др., 2006; А.Л. Бучаченко, 2006).
Несмотря на неполную разрешенность теоретических и практических задач терапии при локальном воздействии, интенсивно развивается магнитотера-пия, основанная на влиянии полей на весь организм, обеспечивающая более высокий биологический и лечебный эффект (A.M. Беркутов, 2000). При этом представления о действии поля только в виде физико-химического свойства оказываются недостаточны, поскольку воздействию подвергаются все клетки, органы, системы, механизмы их взаимосвязей и взаиморегулирования, что делает целесообразным углубленное изучение различий в системном и локальном влиянии физического фактора.
В течение ряда лет в работах по экспериментальной онкологии исследуется феномен противоопухолевого действия слабого сверхнизкочастотного магнитного поля (В.В. Новиков, 1997; Е.Г. Новоселова, 2001; О.В. Глушакова, 2002; Е.М. Франциянц, 2002). Вопреки малой напряженности, эффекты, вызываемые этим фактором, показывают, что низкочастотному магнитному полю доступно управление важнейшими механизмами опухолевого роста, скрытыми от многих других, более сильных физических воздействий (Н.И. Музалевская, 1997; Е.Б. Бурлакова, 2004).
Было показано, что слабое переменное низкочастотное магнитное поле в присутствии параллельного ему постоянного приобретает биологическую активность (A.R. Liboff, 1985). В ряде работ сообщается о том, что сочетанное действие постоянного и переменного низкочастотного магнитных полей, настроенных на циклотронный резонанс некоторых аминокислот, ингибирует
развитие новообразования на ранних стадиях опухолевого процесса (В.В. Новиков, 1996; Н.И.Новикова, 1998).
Оптимальной моделью для исследования влияния магнитного поля на новообразование и организм опухоленосителя является перевиваемая мышиная асцитная карцинома Эрлиха, характеризующаяся высокой степенью неопластической трансформации (А.Ш. Гвичия, 1983; Е.Ю. Фоменко, 2006).
Установлено, что клетки АКЭ могут проявлять NO-зависимую иммуно-супрессорную активность, что позволяет им подавлять функцию наиболее активной части лимфоцитарного пула (Ю.П. Вельский и др., 2004). Известно, что оксид азота вследствие своих мультипотентных свойств, определяемых цито-токсичностью и коммуникативной активностью радикала, участвует на всех этапах патогенеза неоплазий, подразделяемого на инициацию, промоцию, прогрессию, инвазию и метастазирование (С.Я. Проскуряков и др., 2001; D.A. Wink et al., 1998; Н. Kato et al., 2001). Поэтому изучение влияния магнитных полей с различными биотропными параметрами на продукцию оксида азота опухолевыми клетками представляется достаточно актуальным.
Традиционно в качестве основной мишени противоопухолевой терапии рассматриваются процессы пролиферации. Однако в последние годы накапливается все больше данных о том, что многие химиотерапевтические агенты, а также ионизирующее излучение индуцируют апоптоз, и именно этому механизму инактивации опухолевых клеток принадлежит ведущая роль в терапии неоплазм (Е.Ф. Лушников, 2001; А.А. Новик, 2004; I.D. Bowen et al., 1990; P.L. Olive, 1999). Изучение особенностей спонтанной гибели опухолевых клеток, в частности, апоптоза открывает возможности для более глубокого раскрытия механизмов опухолевого роста. Подобное понимание проблемы предоставляет дополнительные возможности для обнаружения новых внутриклеточных мишеней терапевтического воздействия, а также стимулирует поиск более специфических противоопухолевых агентов, способных индуцировать программированную клеточную гибель в клетках опухоли.
Цель исследования: Установить закономерности процессов метаболизма клеток асцитной карциномы Эрлиха при локальном и системном действии комбинированных слабых постоянного и переменного низкочастотного магнитных полей.
Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:
Исследовать влияние комбинированного действия постоянного и переменного низкочастотного магнитных полей на активность ферментов антиокси-дантной системы у мышей - опухоленосителей.
Изучить влияние магнитных полей на интенсивность процессов перекисного окисления липидов в возрастном аспекте.
Исследовать секрецию оксида азота клетками АКЭ в динамике опухолевого процесса и оценить влияние магнитных полей на интенсивность NO - продукции.
Выявить мембранотоксические эффекты и закономерности процессов экс-тернализации фосфатидилсерина при комбинированном действии магнитных полей.
Оценить влияние комбинированного действия постоянного и переменного магнитных полей на темпы роста опухоли и продолжительность жизни животных - опухоленосителей.
Научная новизна:
Впервые исследовано комбинированное действие слабых постоянного и переменного магнитных полей с частотой переменной составляющей, соответствующей циклотронной частоте ионизированной формы молекулы цистеина.
Впервые показано увеличение продукции оксида азота клетками АКЭ в динамике опухолевого процесса и при комбинированном действии постоянного и переменного магнитных полей, влияние нитроксидергических процессов на интенсивность клеточной гибели в условиях воздействия физического фактора.
Приоритетными являются данные о том, что системное воздействие комбинированных слабых магнитных полей способствует увеличению количества
клеток АКЭ на ранней стадии апоптоза, клеток с морфологическими признаками начального и терминального блеббинга плазматической мембраны.
Теоретическая и практическая значимость:
Полученные результаты расширяют представления о механизмах локального и системного действия магнитного поля на клетки опухоли и организм животного - опухолепосителя. Работа носит экспериментальный характер и может послужить фундаментом для дальнейшего поиска новых методов воздействия на рост опухолевой ткани.
Основные положения диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии Красноярской государственной медицинской академии.
Положения, выносимые на защиту:
Комбинированные слабые постоянное и переменное низкочастотное магнитные поля вызывают повышение активности ферментов антиокси-дантной системы в клетках АКЭ и гепатоцитах мышей - опухолеиосителей, снижают интенсивность процессов ПОЛ in vitro и in vivo.
Под воздействием комбинированных слабых магнитных полей происходит усиление продукции оксида азота клетками АКЭ как в эксперименте in vitro, так и in vivo. Выраженность полученного эффекта зависит от режима облучения.
Системное воздействие комбинированного слабого магнитного поля способствует увеличению количества клеток АКЭ на ранней стадии апоптоза.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, написана по традиционному плану, включает 4 главы и список литературы из 230 научных работ, в том числе 112 иностранных. Работа иллюстрирована 1 схемой, 14 таблицами, 14 рисунками в виде графиков и диаграмм и 2 фотографиями микропрепаратов.
Апробация полученных результатов: Основные положения доложены и обсуждены на ежегодных итоговых научно-практических конференциях КГМА (2004, 2005), VIII Российско-Японском симпозиуме (Благовещенск, 2000), второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), XII межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2006), Сибирском пленуме Российского научного общества патофизиологов (Барнаул, 2006). По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Автор выражает благодарность к.м.н., доценту кафедры патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии Е.Ю. Сергеевой за помощь при выполнении диссертационного исследования.
Механизмы воздействия магнитных полей на биологические объекты в норме и при опухолевом процессе
Природа биологических эффектов слабых электромагнитных полей остается неясной, несмотря на большой объем фактического материала (Н.А. Агад-жанян и др., 1992).
Физические механизмы влияния МП связаны с вероятностью протекания элементарных химических актов, когда в результате химических превращений, вследствие распаривания электронов, появляются свободнорадикальные продукты реакции с некомпенсированными спинами. Радикальные пары могут существовать в состоянии с общим спином S=0 (синглетное состояние) и S=l (триплетное состояние) (A.M. Беркутов и др., 2000). Магнитное поле может индуцировать спиновые триплет-синглетные переходы в таких парах (спин-селективных нанореакторах), изменять их спиновое состояние и реакционную способность. Именно эта физически ясная и экспериментально обоснованная концепция лежит в основе микроволновой спиновой химии (A.L. Buchachenko et al., 1993). Она уже привела к открытию микроволнового изотопного эффекта (V.F. Tarasov et al., 1991), когда микроволновое поле обеспечивает фракционирование магнитных и немагнитных изотопов химическими реакциями, обусловила появление стимулированной поляризации ядер (N.A. Avdievich et al., 1989). Однако в биохимии и физиологии такие спин-чувствительные реакции (за исключением первичной стадии фотосинтеза) не обнаруживались, и это обстоятельство порождало скептическое отношение к магнито-спиновому происхождению биофизических эффектов магнитных полей (A.L. Buchachenko et al., 1993). Открытие магнитного изотопного эффекта магния в реакциях фосфори-лирования является прямым и надежным доказательством того, что ключевые биохимические процессы синтеза энергоносителей в организме происходят в спин-селективных нанореакторах. Эти реакции зависят от магнитного момента ядер, а также неизбежно должны зависеть и от магнитного поля (отсюда следует магнитобиология), и от резонансного микроволнового поля (отсюда происходят электромагнитные биологические эффекты). Магнитобиологические эффекты могут проявляться и в других АТФ-зависимых ферментах (например, ДНК-полимеразе). Установлено, что низкочастотные нерезонансные поля подавляют ферментативное фосфорилирование и создают недостаток АТФ в организме (А.Л. Бучаченко, 2006).
Магнитные поля с интенсивностью порядка геомагнитного поля и частотой от единиц до сотен герц не вызывают сколько-нибудь существенного индукционного нагрева, квант электромагнитного поля низкой частоты существенно меньше характерной энергии химических превращений порядка кТ. Вместе с тем, помимо молекулярных мишеней в организме могут присутствовать относительно крупные частицы с почти макроскопическим магнитным моментом. В отношении же молекулярных мишеней, их взаимодействие с низкочастотным МП имеет многоквантовый характер и может развиваться в отсутствие теплового равновесия (В.Н. Бинги и др., 2006).
Во многих живых объектах найдены наноразмерные частицы, преимущественно из кристаллического магнетита, обладающие магнитным моментом, который превышает элементарный на семь-девять порядков. Энергия их поворота в слабом магнитном поле существенно больше энергии тепловых флуктуации кТ (В.Н. Бинги и др., 2005). Особый интерес представляют частицы магнетита биогенного происхождения, обнаруженные в мозге животных и человека и названные магнитосомами (R.P. Blakemore, 1975). В настоящее время убедительно доказано, что безошибочная ориентация многих видов животных во время их сезонных миграций обусловлена взаимодействием геомагнитного поля с магнитными наночастицами (М.М. Walker, 2002).Содержание магнито-сом в мозге человека составляет около 5-Ю6, в мозговой оболочке более 108 кристаллов на грамм (J.L. Kirschvink et al., 1992), в среднем 50 нг/г ткани по порядку величины (J. Dobson, 2002). Недавно было показано, что магнитосомы могли бы образовываться и в ДНК-комплексах (Г.Б. Хомутов, 2004).
Микроскопическое устройство биологического рецептора и время жизни его состояний определяют уровень чувствительности в каждом конкретном случае. Важно, что время жизни может быть достаточно большим благодаря состоянию элементов биофизических структур, далекому от теплового равновесия (В.Н. Бинги, 2000). Вследствие конформационных перестроек, инициируемых метаболизмом, внутри некоторых белковых молекул возникают особым образом устроенные атомные группы, распадающиеся с переходом белка в активное или неактивное по отношению к другим биохимическим процессам состояние. Устройство молекулярной группы таково, что некоторые степени ее свободы, с одной стороны, чувствительны к МП. С другой стороны, такая мишень влияет на вероятности эволюции белка из промежуточного состояния в конечные, активное или неактивное. Затем белок возвращается в исходное состояние, и цикл повторяется. Поскольку количество белка в активном состоянии зависит от МП, МП управляет состоянием мишени, так как время ее жизни меньше времени термализации, и мишень находится в неравновесном состоянии (В.Н. Бинги и др., 2006).
Общее свойство сверхслабых воздействий - наличие так называемых амплитудных и частотных "окон". Существуют такие интервалы частот и амплитуд (и даже единичные частоты - резонансы), на которых эффекты регистрируются четко, в то время как вне этих "окон" эффект может отсутствовать. Частота как независимый параметр воздействия может в некотором смысле играть роль "дозы": при изменении частоты величина эффекта меняется и может даже сменить знак (В.И. Афромеев, 1999; А.А. Аловская, 2001; Е.Б. Бурлакова, 2004). При некоторых особых сочетаниях частот и амплитуд МП возникает специфический режим неоднородного вращения молекулы: в течение почти всего периода изменения МП она почти неподвижна, а затем сравнительно быстро поворачивается на полный угол. В этом режиме увеличена вероятность реакции боковых групп молекулы с окружением.
Другой пример молекулярной мишени - обобщенная координата реакции процессов с переносом протона или электрона в двуямном потенциале, управляемом магниточувствительной водной средой (В.Н. Бинги и др., 2006). В биологических процессах вода, являясь сложно организованной открытой системой, играет важную роль. В настоящее время известно 8 клатратных структур воды, элементами которых являются метастабильные образования, представляющие собой плоские пяти- или шестиугольники, состоящие из молекул воды (A.M. Беркутов и др., 2000). Для объяснения первичных механизмов действия МП на водную среду существует так называемая солитонная модель жидкости. Несколько молекул воды образуют сегмент ленточки, при этом водородные связи внутри сегментов имеют большую энергию, чем между краями лент. При разрушении любой водородной связи происходит трансформация лент структуры, и подкластеры, состоящие из молекул, меняют свою ориентацию. Происходит «перезавязывание» лент. Если система вносится во внешнее МП низкой интенсивности, в такой системе появляются дополнительные уединенные волны -солитоны и «дышащие» структуры - бризеры. Для солитонной модели в жидкости, после воздействия на нее внешнего магнитного поля, происходит поворачивание определенных сегментов ленты, что ведет к отклонению распределения направлений молекул и порождению солитонов (скруток). Магнитные поля влияют также на движение зарядов Н+, чем меняют их действие на кластеры и изменяют свойства воды. Кроме того, имеет место пороговый эффект, когда изменения накапливаются, не меняя структуры, а потом происходит раскол кластеров или объединение двух кластеров в один (И.П. Сусак и др., 2005). Во внутренних средах организма такие изменения происходят как фазовые переходы второго порядка. Процессы образования и распада метастабильных комплексов сопровождаются четкими биохимическими эффектами, возможно, вызывающими изменение проницаемости мембран (A.M. Беркутов и др., 2000). Таким образом, попытки объяснить магнитобиологические влияния на надмолекулярном уровне привели к появлению гипотез, основывающихся на магнитогидродинамических, ориентационных, концентрационных, жидкокристаллических, ферромагнитных эффектах.
Молекулярные механизмы окислительного стресса, характеристика ферментативного звена антиоксидантной системы
Окислительный стресс (состояние, сопровождающееся формированием в клетке большого количества свободных радикалов и накоплением признаков окислительного повреждения клеточных биомакромолекул) является патогенетической основой протекания ряда экстремальных состояний, индуцируемых факторами внешней среды.
До последнего времени патогенез окислительного повреждения клеток рассматривался преимущественно с позиций мембрано- и генотоксичности свободных радикалов (перекисное окисление липидов и нарушение структуры ДНК). Регуляция содержания перекисей и свободных радикалов тканей обеспечивается различными ферментными системами и природными антиоксидантами. На стадии инициирования регуляция ПОЛ в клетке осуществляется посредством генерации супероксидных радикалов, влияния на активность СОД и ка-талазы, а также на уровень свободного железа. На стадии продолжения цепи изменяется уровень кислорода, микровязкости и содержания полиненасыщенных жирных кислот. На этапе разветвления цепи контроль за уровнем ПОЛ осуществляется за счет влияния на количество свободного железа, активность глутатионпероксидазы и уровень свободных тиолов. На стадии обрыва цепи возникают липофильные антиоксиданты и наблюдаются высокие концентрации свободного железа (А. Б. Егорова, 2000).
Кроме того, важнейшим индикатором окислительно-восстановительного гомеостаза клетки является структурное и функциональное состояние клеточных белков, в том числе их термодинамическая и операционная стабильность. Большинство меж- и внутримолекулярных взаимодействий (связывание ионов, субстратов, кофакторов, лигандов, межбелковые и белок-липидные взаимодействия, конъюгация с углеводами, формирование всех видов связи и гидрофобные взаимодействия) напрямую зависят от редокс-статуса среды. В основе де-натурационно - ренатурационных превращений и субстрат-ферментных взаимодействий лежит прежде всего тиол-дисульфидный обмен (N.E. Creighton, 1986). Реакционная способность цистеиновых остатков белков зависит от присутствия окружающих их ароматических или электростатически заряженных молекул (преимущественно гистидина), а также общего редокс-потенциала системы - при преобладании окислительных валентностей формирование дисуль-фидных связей облегчено. Редокс-центры белковых молекул в физиологических условиях удалены от поверхности, поэтому белки могут рассматриваться в качестве своеобразного органического матрикса, движение электронов в котором осуществляется благодаря «скачкам» из одного центра в другой или по ко-валентным и водородным связям. При этом дисульфидные анионы выступают в роли центров переноса электронов (G.D.D. Jones el al., 1987).
Формирование дисульфидных связей, катализируемое протеиндисульфи-дизомеразой, обусловливает самоорганизацию белков клетки, помимо изомеризации по пролину и ассоциации полипептидных цепей (P. Jaenicke, 1991). При этом дисульфидные связи стабилизируют исходное состояние, но не определяют пространственную перестройку белковой молекулы (А.Б. Егорова, 2000). Промежуточным на пути приобретения стабильной конформации при де- и ренатурационных процессах, сопровождающихся восстановлением дисульфидных связей, является этап формирования «расплавленной глобулы», имеющей объем, превышающий окончательный на 5-15%, со сниженной степенью ригидности вторичной и третичной структур (JJ. Ewbank et al., 1991). Такие структуры способны, будучи локализованными против гидрофобной поверхности, приобретать четвертичную структуру, соответствующую исходной (S. Lu etal., 1991).
При окислительном стрессе денатурация белковых молекул клетки приводит к уменьшению периода их функционирования в результате повышения чувствительности к протеолитическим реакциям и процессам посттрансляционной модификации (фосфорилированию и рибозилированию); поддержание же частично денатурированных полипептидов в форме «расплавленной глобулы» является обязательным событием при синтезе новых пептидных цепей и их транспорте через клеточные мембраны, что создает основу эффективной регуляции метаболизма через альтерацию редокс-буферных компонентов клетки.
В последние годы свободные радикалы стали рассматриваться и в качестве своеобразных «вторичных посредников», формирующихся в ответ на действие эндо - и экзогенных факторов физической, химической и биологической природы и регулирующих функционирование клеток (R. Gopalakrishna et al., 1989). Такими «вторичными токсическими посредниками» некоторые авторы (S. Gebicki et al., 1993) предлагают считать продукты окисления белков, что подтверждается обнаружением в их составе длительно сохраняющихся перок-сидных групп и связанных с полипептидом восстанавливающих остатков (потенциальных прооксидантов за счет способности восстанавливать металлы с переходной валентностью).
Функционирование клеток организма регулируется широким спектром меж- и внутриклеточных сигнальных каскадных процессов, активируемых, как правило, за счет связывания лигандов со специфическими рецепторами. В силу чувствительности основных сигнальных молекул клетки (рецепторы, ГТФ-связывающие белки, эффекторы (ионные каналы и ферменты)) к редокс-регуляции (протонный перенос между тиольными радикалами цистеинсодержащих белков), формирование свободных радикалов может приводить к активации транскрипционных факторов генов «раннего ответа» c-fos и c-jun, диме-ризации их белковых продуктов и вторичной модуляции экспрессии эффектов генов. Это параллельно активирует систему антиокислительной защиты и способствует накоплению восстановленного глутатиона, необходимого для активации клеток или пролиферации (J. Yodoni et al., 1992).
Эффекторные молекулы клеток, для которых общепризнан факт регуляции активности через фосфорилирование и дефосфорилирование, могут быть селективно активированы при окислительной модификации регуляторных доменов, что продемонстрировано для протеинкиназы С, тирозинкиназы, фосфо-липазы А, фосфотирозинфосфатаз. Ферменты, имеющие участки связывания лигандов с фосфатными группами, обладают близко расположенными тиолами в сайте взаимодействия, чувсвительными к окислительной активации с последующей инактивацией.
Митохондриям принадлежит особая роль в патогенезе альтерации и компенсации при повреждении клеток. Митохондрии являются основными продуцентами свободных радикалов в клетках в физиологических условиях, и такая активность многократно возрастает при индукции окислительного стресса, а также при гипоксии. Избыточное накопление кальция в митохондриях способствует активации так называемых митохондриальных мегаканалов (mitochondrial permeability transition роге), что может увеличить степень повреждения клетки в целом при индукции окислительного стресса (P. Bernardi, 1999). Открытие этих пор обеспечивает пассаж ионов и молекул с молекулярной массой 1500 Да, а это, в свою очередь, приводит к коллапсу трансмембранного митохондриального потенциала с последующим выходом значительного количества кальция в цитоплазму (А.Б. Егорова, 2000).
Экспериментальная модель
Система антиоксидантов защищает клетку от повреждающего действия свободных радикалов, в том числе активных форм кислорода. Большая часть способов борьбы со злокачественными новообразованиями направлена на сво-боднорадикальные процессы, активизирующиеся при онкозаболеваниях (С.Я. Проскуряков и др., 2002). Так как антиоксиданты являются регуляторами концентраций свободных радикалов, необходимо иметь информацию о механизме воздействия облучения на их активность, как в клетках АКЭ, так и в тканях жи-вотного-опухоленосителя.
С целью определения активности ферментов антиоксидантной системы облучение проводили в режиме 2.
В ходе эксперимента было показано, что активность СОД в гепатоцитах животных с АКЭ на этапе опухолевого процесса, соответствующем фазе экспоненциального роста - 7 день с момента инокуляции (А.Ш. Гвичия, 1983; Е.Ю. Фоменко, 2006), в 3,2 раза превышает показатели интактных мышей (Р 0,001). Полученные результаты согласуются с литературными данными (Н.М. Эмануэль, 1977), указывающими на повышение активности СОД в органах животно-гых-опухоленосителей по сравнению с нормой на некоторые сроки развития новообразования. Воздействие МП не вызвало статистически значимых изменений активности СОД, но было отмечено увеличение данного показателя на 17,1% (табл. 1; рис. 2 А).
При сравнении активности TST в гепатоцитах интактных животных и жи-вотных-опухоленосителей была выявлена тенденция, противоположная описанной при исследовании СОД. Так, у мышей с АКЭ отмечалось статистически значимое снижение активности TST в 1,4 раза (Р 0,02) по сравнению с показателями, выявленными у здоровых животных. После воздействия МП актив ность rST статистически значимо увеличилась на 42,1% (Р 0,02) по отношению к контролю и стала соответствовать данным, описанным у животных без опухоли (табл. 1; рис. 2 Б).
Развитие неопластического процесса привело к достоверному снижению активности ГПО в клетках печени мышей с АКЭ на 38,1% (Р 0,02) по сравнению показателями, отмеченными у интактных животных. После воздействия МП статистически значимых изменений активности ГПО выявлено не было, но, как и при исследовании СОД, отмечалось увеличение данного показателя на 26,6% (табл. 1; рис. 2 В).
Таким образом, на 7 день развития АКЭ в гепатоцитах мышей-опухоленосителей было выявлено статистически значимое снижение активности TST и ГПО, достоверное повышение активности СОД и тенденция к увеличению активности каталазы. Длительное фракционированное облучение в режиме 2 привело к статистически значимому повышению активности TST до уровня интактных животных и каталазы.
Действии комбинированных постоянного и переменного магнитных полей вызвало достоверное (Р 0,001) увеличение активности супероксиддисму-тазы в клетках АКЭ в 3,7 раз (табл. 2; рис. 2 А).
Известно, что при развитии опухолевого процесса существенно нарушаются ферментные системы защиты организма от токсического действия продуктов ПОЛ. Несмотря на повышение активности этих ферментов в органах животного-опухоленосителя на некоторые сроки развития неоплазмы, все же наблюдается существенное накопление перекисей, вносящих определенный вклад в состояние кахексии, наступающее в организме на поздних стадиях опухолевого процесса (Н.М. Эмануэль, 1977). Можно предположить, что стимуляция ферментативного звена антиоксидантной системы в клетках печени, АКЭ и в асцитической жидкости при комбинированном действии слабых постоянного и переменного низкочастотного магнитных полей является позитивным фактором, способствующим повышению антибластомной резистентности и продолжительности жизни мышей-опухоленосителей. Результаты получены совместно с аспирантом кафедры биохимии и физиологии человека и животных Красноярского государственного университета А.С. Щербининой.
Изменение концентрации малонового диальдегида в асцитической жидкости в процессе развития опухоли и при действии магнитного поля отражает интенсивность процессов ПОЛ, так как МДА является вторичным продуктом липидной пероксидации.
В эксперименте по исследованию динамики эндогенного образования МДА использовалась асцитическая жидкость, выделенная от молодых (возраст 10-12 недель) животных обоего пола. Статистически значимые отличия (Р 0,05) были выявлены при сравнении показателей, полученных на 7 и 15, 9 и 15, 12 и 15 дни с момента инокуляции опухолевых клеток (табл. 3). Общая же тенденция свидетельствовала об увеличении содержания МДА в асцитической жидкости в динамике неопластического процесса. Так, концентрация МДА, составлявшая на 7 день 4,20±0,74 мМ/л, к 9 дню возросла на 4,8%, к 12 дню - на 2,4% по сравнению с 9 днем, а к 15 дню - на 29,8% по сравнению с 12 днем, что, вероятно, вызвано усугублением гипоксии и активацией СПОЛ при увеличении объема опухоли. Важно отметить, что в терминальном периоде роста, несмотря на замедление или даже прекращение размножения опухолевых клеток, асцитическая жидкость продолжает накапливаться вплоть до гибели животного (А.Ш.Гвичия, 1983).
На 7, 9 и 12 день между показателями концентрации МДА в асцитической жидкости и количеством клеток АКЭ в 1 мл асцита была выявлена слабая отрицательная корреляция (г = - 0,440; - 0,644; - 0,448 соответственно). На 15 день развития опухоли отрицательная корреляция была сильной (г = - 0,717). Вероятно, тесная обратная взаимосвязь обусловлена выраженной ишемией и интенсивной гибелью клеток на этой стадии опухолевого процесса.
Принимая во внимание, что между концентрацией МДА в асцитической жидкости и количеством клеток АКЭ в 1 мл асцита существует корреляция, с целью устранения флюктуации, связанных с изменением клеточности в процессе накопления асцита, произвели пересчет концентрации МДА на 106 клеток. Таблица 3 Изменение концентрации малонового диальдегида в асцитической жидкости в процессе развития опухоли (М±т) Серия 7 дней 9 дней 12 день 15 день мМ/л 4,20±0,74 Pi5 0,05 4,47±0,82 Pi5 0,05 4,51+0,97 Різ 0,05 5,85±0,50P7,9.12 0,05 оКлеточность, х 10 2,40±0,70 3,04±0,62 1,96±0,50 1,36±0,43 мМУл/106 клеток, хЮ-2 1,94±0,79 Р15 0,05 1,57±0,58 Pi5 0,05 2,44±0,85 Pi5 0,05 4,88±2,19Р7,9,12 0,05
Примечание: Р5 - статистически достоверные отличия от показателей, выявленных на 5 день развития опухоли; Р7 - статистически значимые отличия от показателей, полученных на 7 день развития опухоли; Р9 - статистически достоверные отличия от показателей, выявленных на 9 день развития опухоли; Pi2 - статистически значимые отличия от показателей, выявленных на 12 день развития опухоли; Pis - статистически значимые отличия от показателей, выявленных на 15 день развития опухоли В эксперименте in vitro использовалась асцитическая жидкость, полученная от животных обоего пола в возрасте от 2,5 до 12 месяцев на 8 - 9 день с момента инокуляции.
Воздействие магнитным полем in vitro сопровождалось статистически значимым изменением продукции МДА (табл. 4; рис. 3). Так, при использовании непараметрического критерия Уилкоксона уже после 30 минутного облучения были обнаружены статистически достоверные отличия от соответствующих по времени показателей контроля (W=36,0; Р 0,024). При этом средняя концентрация МДА в асцитической жидкости снизилась на 15,9% (при пересчете на 106 клеток - на 15,4%), что свидетельствует о подавлении свободнора-дикального перекисного окисления липидов при действии магнитного поля с указанными параметрами. После более продолжительного воздействия данная тенденция сохранялась и становилась отчетливее. Так, после облучения в течение 60 минут концентрация МДА снизилась на 23,4%о (при пересчете на 106 клеток - на 22,0%о) по сравнению с соответствующим по времени контролем (W=36,0; Р 0,024) и была ниже, чем в образце, облученном в течение 30 минут, в то время как в контрольных пробах образование МДА увеличивалось.
Влияние комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на активность ферментов антиоксидантной системы и выраженность процессов ПОЛ у животных - опухоленосителей
Учитывая, что концентрация метаболитов N0 в асцитической жидкости на каждом из исследуемых нами этапов неопластического процесса имела сильную положительную корреляцию с количеством клеток АКЭ в 1 мл асцита (г = 0,739; 0,823; 0,819; 0,862; 0,818 на 5, 7, 9, 12 и 15 сутки соответственно), для стандартизации показателя мы произвели пересчет на 10 клеток (рис. 5 Б). Это позволило устранить флюктуации, связанные с особенностями пролифератив-ной активности клеток АКЭ в течение 3 основных периодов роста опухоли: лаг-фазы, периода нарастания числа клеток в асцитической жидкости и терминаль-ного периода.
Установлено, что при достаточно большом количестве инокулируемых клеток (4x10 ) лаг-фаза не определяется (А.Ш. Гвичия, 1983). В нашем эксперименте при величине инокулята 107 клеток можно предположить наличие короткого (не более 4-5 суток) адаптационного периода. Выбор 5 дня для первого определения концентрации оксида азота обусловлен окончанием: лаг-фазы, трудностью выделения асцита на более ранней стадии и необходимостью получения не менее 1 мл супернатанта для применения избранной нами методики.
Известно, что до момента достижения максимального числа клеток в асците рост опухоли последовательно проходит две фазы: экспоненциальную (до 6 суток с момента инокуляции) и фазу замедленного темпа роста (A.TT..I. Гвичия, 1983). На основании этих данных для последующего определения концентрации метаболитов NO были выбраны 7 сутки - окончание экспоненциальной фазы, и 9 - достижение максимального числа клеток (табл. 8).
Митотический индекс начинает снижаться рано и к началу терминальной фазы бывает весьма низким, в этот период нарастает процент аномальных митозов и дегенерирующих клеток. Наступает равновесие между ослабленным процессом пролиферации и усиленной гибелью клеток АКЭ, что в нагнем эксперименте соответствовало 12 суткам.
Минимальная продолжительность жизни, зафиксированная при исследовании выживаемости животных-опухоленосителей, составила 16 суток, что объясняет выбор 15 дня для проведения завершающего эксперимента. Пересчет полученных результатов с учетом клеточности позволил также устранить колебания концентрации метаболитов NO, связанные с непрерывным увеличением объема асцитической жидкости. На самых ранних стадиях накопление жидкой части асцитной опухоли обусловлено повышением осмотического давления вследствие накопления в брюшной полости низкомолекулярных метаболитов (в частности, лактата), а на поздних - воспалительными изменениями брюшины и механическим блокированием лимфооттока размножающимися клетками.
Таким образом, общая тенденция, выявленная при анализе стандартизированных показателей, свидетельствовала об увеличении выработки NO клетками АКЭ в процессе развития опухоли (рис. 6). Так, минимальная концентрация оксида азота, выявленная на 5 сутки, к 7 дню статистически значимо возросла на 36,4% (Р 0,05) и вплоть до 9 суток оставалась на том же уровне, без заметных колебаний. На 12 день содержание нитратов и нитритов вновь увеличилось на 16,9% (Р 0,05), а к 15 дню статистически значимо возросло на 32,5% по сравнению с предыдущим значением (Р 0,05).
Вероятно, усиление выработки оксида азота обусловлено накоплением в асцитической жидкости стимуляторов продукции N0, синтезируемых как самими клетками АКЭ, так и инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (В.К. Патрушев, 2004), что, возможно, приводит к активации индуцибельной фракции NOS. Помимо цитокинов иммуноцитов, стимулятором NOS является гипоксия (P. Lagadec et al., 1999).
При сравнении показателей концентрации NO и МДА у отдельных особей на каждом этапе опухолевого процесса (без учета клеточности) на 7, 9 и 12 сутки выявлялась слабая отрицательная корреляция (г = -0,458; -0,597; - 0,403 соответственно). На 15 день между содержанием метаболитов оксида азота и концентрацией МДА в асцитической жидкости отмечалась сильная обратная взаимосвязь (г = - 0,895).
Аналогичный характер корреляционных взаимоотношений был описан в литературных источниках при исследовании этих параметров в сыворотке кро ви здоровых по клиническим, биохимическим и иммунологическим параметрам доноров, а также в условиях окислительного стресса у лиц с ранением груди (П.П. Голиков, 2004).
При введении внутрибрюшинно блокатора NO-синтетазы N -метил-L-аргинина концентрация метаболитов NO на 7 день развития опухоли статистически значимо снизилась в 1,5 раза (Р 0,05). При этом стандартизированный показатель уменьшился в 2,2 раза (Р 0,02), т. к. отмечались более высокие показатели клеточности. Вероятно, снижение продукции оксида азота клетками АКЭ повлияло на проницаемость перитонеальных сосудов, что замедлило скорость накопления асцитическойжидкости в полости брюшины (табл. 9). Таблица 9 Изменение концентрации метаболитов оксида азота в асцитической жидкости при введении блокатора NO-синтетазы N -метил-Ъ-аргинина (М±т) Концентрация Контроль № -метил-Ь-аргинин мкМ/л 12,54±3,08 8,34±2,75 Клеточностцх 108 2,4±0,59 2,78±0,41 мкМ / л /106 клеток 0,075+0,013 0,034+0,009 Комбинированное воздействие слабых постоянного и переменного низкочастотного магнитных полей in vivo привело к статистически значимому увеличению продукции NO, более интенсивному при длительном ежедневном облучении (табл. 10; рис. 7). Так, при использовании режима 1 концентрация оксида азота в асцитической жидкости статистически достоверно (Р 0,02) возросла в 2,1 раза (при пересчете с учетом клеточности - в 2,4 раза). При воздействии в режиме 2 содержание метаболитов NO увеличилось в 2,5 раза (Р 0,02), при этом стандартизированный показатель возрос в 3,8 раз (табл. 10; рис. 7 А). При проведении однофакторного дисперсионного анализа было показано, что режим облучения влияет на интенсивность продукции оксида азота клетками АКЭ(Р 0,001).
Воздействие магнитным полем in vitro в течение 60 мин привело к статистически значимому увеличению концентрации метаболитов NO в супернатан-те на 31,4% по сравнению с исходным уровнем (Р 0,05) и в 1,8 раз по отношению к контролю (р 0,02), инкубирующемуся вне магнитного поля. Аналогичная закономерность была выявлена при пересчете полученных результатов с учетом клеточности (табл. 10; рис. 7 Б). Концентрация оксида азота возросла в 2,5 раз по отношению к исходному уровню (Р 0,05) и в 2,9 раз при сравнении с контрольным значением (Р 0,02). При этом в контрольных образцах отмечалась тенденция к снижению концентрации нитритов (на 12,5%), что может быть обусловлено, в частности, активацией нитритредуктазы в условиях нарастающей гипоксии (В.П. Реутов, 2003).
Таким образом, приведенные данные показывают принципиальную возможность регуляции продукции оксида азота клетками АКЭ с помощью комбинированного воздействия на организм слабых магнитных полей. Не исключено, что усиление выработки NO опухолью Эрлиха является неблагоприятным фактором, подавляющим активность внутриопухолевых Т-лимфоцитов.
