Введение к работе
Актуальность проблемы Способность к саморегуляции числа клеток - основополагающее свойство многоклеточного организма Эффективным механизмом, обеспечивающим поддержание гомеостаза зрелых тканей и физиологический контроль роста при развитии систем в онтогенезе, является программируемая клеточная гибель, или апоптоз (Fischer, Schulze-Osthoff, 2005) Дизрегуляция апоптоза - существенный элемент развития ряда патологических синдромов Так, с одной стороны, острые коронарная недостаточность, цереброваскулярные заболевания, заболевания печени, почек ассоциированы с некротическими и некробиотическими процессами, массивно протекающими в функционально активных паренхиматозных структурах, в то время как нейродегенеративные синдромы являются следствием медленно прогрессирующей нейрональной гибели С другой стороны, уменьшение способности клеток к апоптозу и последующее их накопление может спровоцировать развитие онкологических и аутоиммунных заболеваний
Возможность модулировать индукцию апоптоза в тканях и управлять механизмом гибели клетки представляется весьма привлекательной целью Особую актуальность это приобретает для терапии онкологических заболеваний, которые по уровню социальной значимости стоят на первом месте в мире Можно сказать, что большинство методик химиотерапии опухолей основано на использовании механизма запрограммированной клеточной гибели (Waxman, Schwartz, 2003) путем активации различных триггеров, запускающих соответствующие природе триггеров и особенностям клетки-мишени каскады грансдукции и амплификации сигнала Воздействие химиотерапевтического агента на клетки является комплексным, и оно может оказаться недостаточно эффективным по отношению к малигнизированным клеткам по ряду причин Среди главных можно перечислить две недостаточность сигнала для индукции на уровне клеток-мишеней и дизрегуляция рецепторных и эффекторных каскадов апоптоза Клональная селекция при опухолевом росте может усилить эти два фактора Недостаточность индукции может быть обусловлена как внешними причинами, например, отсутствием необходимой специфичности действия агента (невысокая избирательность противоопухолевого действия), что приводит к значительной общей токсичности химиотерапии, так и внутренними, на уровне клетки, например, лекарственной устойчивостью Развивающиеся в последние годы методы генной терапии (Andersen, 1992), несмотря на очевидную сложность и проблемы роста этого направления, формируют новые подходы к терапии онкологических заболеваний (Баранов, 1999, Патрушев, 2000) Так, генно-инженерные системы активации нетоксичных соединений, к которым принадлежит исследуемая в работе тимидинкиназа вируса простого герпеса - ганцикловир (HSV-tk/GCV), позволяют воспроизводить триггер индукции клеточной гибели непосредственно в клетке-мишени и поддерживать его активность на высоком уровне с возможностью внешнего им управления Встраивание искусственного индуктора апоптоза происходит на уровне ДНК, реализация - посредством транскрипционного и трансляционного аппаратов клетки Это позволяет увеличить локальную концентрацию токсического индуктора в клетке и усилить сигнал Для успешного применения такого подхода необходимы эффективные системы транспорта генетического материала в клетки-мишени, обеспечивающие нативность доставленных нуклеиновых кислот как необходимое условие корректного включения их в клеточный контекст Существующие методы переноса генно-инженерных конструкций в клетки эукариот, такие, как порация мембран (электропорация, сонопорация, баллистические методы, магнитофекция), или вирусные вектора не всегда эффективны в условиях in vitro и ограничены в своей применимости in vivo либо из-за дополнительных барьеров организма, либо из-за побочных действий, связанных, например, с иммуногенностью вирусных векторов Перспективным альтернативным подходом стали невирусные вектора, лишенные ряда недостатков вышеперечисленных методов (Feigner et al, 1989, Duzgunes, 2003) Для транспорта генетического материала в этом случае используются различные соединения полимеры, липиды Липофекция - перенос генетического материала с помощью липидов -
рассматривается как один из многообещающих способов Однако, механизм липофекции недостаточно изучен, а ее системы не всегда эффективны Разработка новых эффективных in vitro и т vivo систем транспорта нуклеиновых кислот на основе неиммуногенных нетоксичных липидных векторных систем, в частности, катионных бисамфифилов, исследование их свойств и биологического действия представляется насущной задачей
Дальнейшее изучение путей индукции, амплификации и экзекуции, приводящих клетку к гибели в результате действия противоопухолевых препаратов, является актуальной проблемой Принято выделять две категории апоптоз-индуцирующих путей - внешние, связанные с активацией ряда так называемых рецепторов смерти, и внутренние, ассоциированные с рецепцией разнообразных повреждений клеточных структур (Achanta et al, 2001) В основе действия системы HSV-tk/GCV лежит экспрессия трансфицированными клетками фермента тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа, способного фосфорилировать ганцикловир до соответствующего монофосфата Последний, фосфорилированный эндогенными киназами до GCV-трифосфата, начинает конкурировать с эндогенным пулом дезоксирибогуаниловой кислоты в процессах синтеза ДНК Встраивание аномального нуклеотида вызывает остановку синтеза ДНК, одноцепочечные разрывы и запускает каскад клеточных реакций, одним из исходов которых может быть гибель клетки (Beltinger et al, 1999) Подробные механизмы индукции апоптоза системой HSV-tk/GCV, как и гомологичные им механизмы активности противоопухолевых препаратов - аналогов нуклеотидов, остаются не до конца изученными Цель исследования
Разработка, оценка эффективности и исследование механизмов действия невирусной генно-инженерной системы активации нетоксичных соединений «ген тимидинкиназы вируса простого герпеса - ганцикловир» на основе новых катионных бисамфифилов Задачи исследования
Изучить ключевые для целей транспорта нуклеиновых кислот в клетку физико-химические свойства дисперсных систем новых катионных бисамфифилов ДЭГА стабильность, размеры, агрегатную морфологию липидных частиц Оценить цитотоксичность и мембранотропность в культурах опухолевых клеток
Охарактеризовать морфологию и размеры липоплексов - супрамолекулярных ансамблей катионных бисамфифилов ДЭГА и плазмидных ДНК
Исследовать эффективность трансфекции липоплексами на основе ДЭГА культур клеток MCF7, 293 и Jurkat разными репортерными системами
Оценить эффективность индукции гибели клеток MCF7 и 293 системой ДЭГА-HSVtk-GCV
Изучить детали механизма цитотоксического действия системы ДЭГА-HSVtk-GCV, связанные с возможным вовлечением митохондрий и фактора транскрипции NF-kB
Научная новизна исследования Предложены новые катионные бисамфифилы ДЭГА в качестве невирусных медиаторов трансфекции в составе генно-инженерной системы активации нетоксичных соединений ДЭГА-HSV-tk/GCV Использованные в работе катионные бисамфифилы, принадлежащие к новому классу поверхностно активных соединений gemini surfactants, представляют собой оригинальный ряд веществ для изучения соотношения структура-активность Впервые обнаружена пониженная цитотоксичность соединений ДЭГА в группе germni surfactants по сравнению с альтернативной липидной системой DOTMA-DOPE Впервые для данной группы веществ показана зависимость морфологии липоплексов и трансфицирующей активности от длины спейсера в структуре молекулы ДЭГА Показана вовлеченность деполяризации митохондриальной мембраны и активации фактора транскрипции NF-kB в комплексный ответ клетки на действие системы HSV-tk/GCV
Теоретическая и практическая значимость работы Полученные в работе данные представляют теоретический интерес для понимания закономерностей и механизмов невирусного генного переноса и индукции апоптоза генно-инженерными системами
активации нетоксичных соединений Результаты работы имеют практическое значение для обеспечения дальнейшего прогресса в терапии онкологических заболеваний, а также оптимизации применения клинических протоколов генной терапии Основные положения, выносимые на защиту
1 Новые катионные бисамфифилы ДЭГА характеризуются низким значением критической
концентрации мицеллообразования, преимущественно ламеллярной морфологией агрегатов
в воде для ДЭГАЗ, смешанной для ДЭГА7 и мицеллярной для ДЭГА11, ДЭГА22
Температура фазового перехода ДЭГА близка к физиологической Катионные бисамфифилы
ДЭГА образуют устойчивые дисперсные системы в воде
2 Структура и активность супрамолекулярных ансамблей катионных бисамфифнлов с
плазмидной ДНК зависят от длины алифатического спейсера
3 Среди катионных бисамфифнлов ДЭГА при более низкой цитотоксичности максимальной
трансфицирующей способностью, сравнимой с коммерческим препаратом Lipofectm,
обладает ДЭГАЗ Эффективность трансфекции зависит от типа клеточной культуры,
физико-химических особенностей липоплексов, определяемых химической структурой
катионного липида
4 Система ДЭГА-HSV-tk/GCV индуцирует клеточную гибель в культурах эффективно
трансфицируемых клеток
5 Обнаружена деполяризация митохондриальной мембраны и активация транскрипционного
фактора NF-kB в экспрессирующих тимидинкиназу вируса простого герпеса клетках в ответ
на ганцикловир
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на конференциях и международных симпозиумах «Scanning probe Microscopy SPM-2002» (Нижний Новгород, 2002), International Workshop «Scanning Probe Microscopy in Life Sciences» (Берлин, 2003), 12th European Conference on Clinical Oncology, September 21-24, 2003,Copenhagen, Европейском Полимерном Конгрессе ( Москва, МГУ, 2005) Публикации По теме диссертации опубликовано 12 научных трудов, отражающих ее основное содержание
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 119 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов Работа иллюстрирована 32 рисунками Библиографический список содержит 212 источника, из них 17 отечественных и 195 зарубежных
