Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время исследованию процессов развития и функционирования кровеносной и лимфатической сосудистых систем в норме и при патологии уделяется большое внимание Эндотелиальные клетки микроциркуляторного русла (ЭКМР) играют ключевую роль в развитии и функции кровеносных и лимфатических сосудов Избыточная пролиферация и трансформация, либо нарушение функции ЭКМР приводит к патологическому ангиогенезу/ лимфангиогенезу или дисфункции сосудистой системы - являющимся показателями злокачественных опухолей и многих других заболеваний [Carmehet, 2003 и 2005]
Существенный прогресс был достигнут за несколько последних лет в исследовании молекулярных механизмов развития и функционирования сосудистой системы, и в выявлении ключевых ангиогенных и лимфангиогенных факторов, а также в использовании данных знаний для ингибирования ангиогенеза и лимфангиогенеза при опухолевых процессах и неоплазмах/новообразованиях различной этиологии, а также для терапии сердечно-сосудистых заболеваний у экспериментальных животных [Alitalo et al, 2005, Ferrara and Kerbel, 2005]
Одной из современных задач в "транслировании" (применении в практике для терапии человека) данных открытий в области исследования механизмов ангиогенеза и лимфангиогенеза на животных является проверка роли известных и новых факторов в биологии эндотелиальных клеток человека и выявление механизмов, регулирующих экспрессию и функцию их рецепторов, а также определение их потенциальной роли в патогенезе опухолевых и сердечно-сосудистых заболеваний [Nikitenko et al, 2006]
В связи с этим разработка методов получения и культивирования эндотелиальных клеток кровеносного и лимфатического микроциркуляторного русла человека, а также исследование роли новых ангиогенных и лимфангиогенных факторов в биологии данного типа клеток, представляет собой актуальную задачу в области биомедицины
Несмотря на то, что эксперименты, проведенные на животных, указывали на роль нового ангиогенного фактора адреномедуллина (AM) при развитии сосудистой системы в эмбриогенезе и при опухолевых процессах, существовал ощутимый недостаток подобного рода исследований с использованием клеток человека Кроме того, информация о распределении и функционировании эндогенных адреномедуллиновых рецепторов, экспрессированных в клетках и тканях человека, также оставалась неизученной до настоящего времени В связи с этим неизвестными оставались как роль AM и его рецепторов в тканях человека, так и возможности их использования для лечения раковых и других заболеваний [Nikitenko et al, 2006] Данная проблема существует и для других ангиогенных факторов Так, несмотря на несомненную роль одной из ключевых ангиогенных молекул - фактора роста эндотелия (vascular endothelial growth factor, VEGF) в развитии раковых опухолей в экспериментальных исследованиях на животных, применение ингибиторов данного ангиогенного фактора не всегда приводит к положительным результатам [Ferrara and Kerbel, 2005]
Трудности в данной области обусловлены отсутствием системного подхода в анализе экспрессии и функции факторов ангиогенеза и их рецепторов т vitro и т vivo в клетках и тканях человека Под системным подходом подразумевается проведение исследований не только роли данных факторов на эндотелиальные клетки человека, но и исследование транскрипции и трансляции генов, кодирующих данные рецепторы в органах и клетках, изучение механизмов, регулирующих экспрессию рецептора на поверхности клетки, специфичности его взаимодействия с потенциальными лигандами (фармакология рецептора), а также механизмов десенситизации и ресенситизации
Данный подход позволяет рассматривать не только механизм действия определенного ангиогенного фактора на молекулярном и клеточном уровнях, но и потенциал использования данных знаний в теоретической биологии, а также при разработке методов диагностики, интервенции и терапий для прогнозирования эффективности применения ингибиторов и активаторов данных механизмов, выявления типов раковых опухолей (а также индивидуальных пациентов), в которых действие данных препаратов может быть наиболее
результативным, и потенциального использования в клинике для лечения широкого спектра сердечно-сосудистых, раковых, инфекционных и других заболеваний, связанных с патологическим (лимф)ангиогенезом или дисфункцей сосудистой системы
Исходя из этого, целью данного исследования являлось оценка роли пептида адреномедуллина (AM) в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека и механизмов, регулирующих экспрессию и функцию его рецепторов в норме и при некоторых патологиях на основе комплексного морфо-функционального и молекулярно-генетического исследования (Рисунок 1)
Механизмы, регулирующие транскрипцию
Механизмы, регулирующие функцию рецептора
-Экспрессия на поверхности клетки - Фармакология рецептора
(специфичность взанмодейстыш с лнпидамн)
-Десенситизация и ресенснтизация
Адреномедуллин а его рецепторы
Трансляционные подходы
-Изучение экспрессии диганда и рецептора в клетках и тканях человека
в норме
при патологиях
Разработка ингибиторов и методов диагностики заболеваний
Комплексный систематический подход
Рисунок 1 Изучение роли адреномедуллина и его рецепторной системы путем комплексно-систематического подхода
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1 Разработать методы получения и культивирования эндотелиальных клеток
микроциркуляторного русла (ЭКМР) из тех тканей человека, в которых происходят
процессы физиологического ангиогенеза,
2 Исследовать роль AM в первичных культурах ЭКМР человека,
Исследовать экспрессию адреномедуллинового рецептора - рецептора подобного кальцитониновому рецептору (calcitonin receptor-like receptor, CL, кодируемого CALCRL геном) в клетках и тканях человека,
Исследовать механизмы, регулирующие экспрессию CALCRL гена человека в ЭКМР в норме и при патологии путем клонирования и описания промотора, изучения субхромосомной организации данного гена и влияния онкогенных вирусов (на примере вируса саркомы Капоши) на его транскрипцию,
5 Произвести и охарактеризовать антитела против CL рецептора,
Исследовать специфичность к различным лигандам, а также механизмы сенситизации и десенситизации, CL рецептора в эндотелии человека,
Исследовать роль адреномедуллина и его рецепторов в ангиогенезе при развитии раковых опухолей и патологических заболеваний органов репродукции, путем изучения экспрессии пептида и локализации функциональной формы CL рецептора в тканях человека в норме и при патологии (в опухолях почек и яичников и тканях саркомы
Капоши),
Исследовать возможность использования разработанных реактивов и методов для диагностики неоплазм, раковых опухолей и других заболеваний,
Исследовать возможность модулирования функционирования адреномедуллиновых рецепторов с целью коррекции их функции при патологиях развития и функции сосудистой системы
Основные положения выносимые на зашиту.
AM является новым ангиогенным фактором в тканях человека за счет своей способности активировать пролиферацию и миграцию, а также ингибировать апоптоз эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла
Экспрессия CALCRL гена человека зависит прежде всего от клеточно- и ткане-специфического фона При этом ключевым фактором в транскрипции CALCRL гена является его трехмерная субхромосомная структура, в то время как активность промотора играет вторичную роль
Десенситизация CL рецептора в эндотелиальных клетках человека при избыточной экспрессии лиганда отражается на его функции и может играть роль при развитии сердечнососудистых заболеваний различной этиологии
Разработанные реактивы и методы могут применяться для диагностики и коррекции патологий, связанных с функцией адреномедуллиновых рецепторов, например патологического ангиогенеза и гиперпроницаемости эндотелия
Разработана и применена концепция системного анализа механизмов комплексной многоуровнево-селективной регуляции экспрессии и функции адреномедуллиновых рецепторов, а также их роли в полноценном функционировании эндотелиальной клетки в норме и при патологии
Научная новизна работы.
Разработаны и усовершенствованы методы получения и культивирования эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) человека
Впервые продемонстрирована роль пептида AM в биологии ЭКМР и ангиогенезе в тканях человека.
Впервые описаны механизмы, регулирующие экспрессию CALCRL гена человека и функцию CL рецептора в тканях и эндотелии человека. Впервые продемонстрирована роль CL рецептора как рецептора для AM и пептида относящегося к гену кальцитонина (CGRP) в ЭКМР человека, а также выявлены механизмы его десенситизации
Впервые разработан метод определения трехмерной субхромосомной структуры генов Сконструированы плазмидные векторы, позволяющие эффективно оценивать экспрессию CALCRL гена человека, активность его промотора и осуществлять экспрессию CL рецептора в клетках млекопитающих Впервые клонированы новые, ранее неохарактеризованные транскрипты CALCRL гена человека и лентивирусная «библиотека», включающая 27 генов, кодирующих различные вирусные белки вируса саркомы Капоши
Впервые получены уникальные реактивы - поликлональные антитела против человеческого CL рецептора и блокирующие моноклональные антитела против гетеродимера CL/RAMP, экспрессированого на поверхности клетки Показана
специфичность данных антител и возможность оценки функционального статуса CL рецептора, а также регуляции его функции в клетках и тканях человека.
Впервые продемонстрирована экспрессия CL рецептора в клетках и тканях человека в норме и при патологиях (на примере опухолевых тканей почек, яичников, лейомиомы и саркомы Капоши)
Разработана и применена концепция системного анализа механизмов комплексной многоуровнево-селективной регуляции экспрессии и функции адреномедуллиновых рецепторов, а также их роли в полноценном функционировании эндотелиальной клетки в норме и при патологии
Практическая значимость исследования.
Разработанные реактивы и методы могут быть использованы для дальнейших исследований биологии эндотелиальных и стволовых клеток человека, экспрессии и функции CL рецептора в нормальных и опухолевых клетках и тканях человека, а также для диагностики раковых, сердечно-сосудистых и других заболеваний
Полученные плазмидные векторы могут быть использованы в области биотехнологии, а полученные поликлональные антитела против CL рецептора человека - как для научно-исследовательских работ, так и для применения в области диагностики и практической медицины
Разработанные моноклональные антитела против гетеродимеров CL/RAMP могут являться эффективным методом коррекции патологий, связанных с функцией адреномедуллиновых рецепторов, как например патологический ангиогенез и гиперпроницаемость эндотелия
Изученная роль AM в биологии ЭКМР человека и полученные данные о механизмах, регулирующих экспрессию и функцию адреномедуллиновьк рецепторов, представляют собой большой интерес при поиске эффективных методов противоопухолевой терапии и сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с ангиогенезом и дисфункцией эндотелия в тканях человека
Полученные результаты расширяют понимание комплексной регуляции адреномедуллиновых рецепторов и позволяют оценить возможность применения ингибиторов/активаторов действия AM для трансляционных исследований и терапии заболеваний, связанных с избыточной или недостаточной экспрессией самого пептида, либо его рецепторов, а также проводить предварительные исследования по воздействию различных веществ на экспрессию, транспорт и функцию CL рецептора в эндотелиальных клетках, как источнике его локализации in vivo в тканях человека.
Полученные данные свидетельствуют о необходимости продолжения исследований фармакологии адреномедуллиновых рецепторов как в эндотелиальных клетках опухолей, так и в самих опухолевых клетках, а также выявления различий рецептора, экспрессированного в нормальном и опухолевом эндотелии
На основе разработанных технологий получения поликлональных и моноклональных антител против CL рецептора человека, определения трехмерной субхромосомной структуры генов и векторных плазмид, содержащих промотор CALCRL гена человека, разработаны методы их использования для диагностики раковых и других заболеваний, а также оформлено и получено два патента на изобретение
Апробация диссертационной работы. Результаты исследований доложены на конференциях Xth Hamburg Symposium on Tumor Markers, Hamburg, Germany, 1999, Xlth International Congress of Histochemistry and Cytochemistry, York, United Kingdom, 2000, Annual ICRF Colloquium, Warwick, United Kingdom, 2000, Introduction to Molecular and Cellular Research, San-Diego, USA, 2000, 8th IFPA Meeting, Melbourne, Australia, 2002, "Angiogenesis basic mechanisms and therapeutic implications", Ascona, Switzerland, 2002, 5th Imperial College School of Medicine Symposium "Vascular endothelium Role in disease pathogenesis and as a therapeutic target", London, Umted Kingdom, 2002,676th Biochemical Society Meeting Edinburgh, United Kingdom, 2002, 6th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, Москва и Санкт-Петербург, Российская Федерация, 2003, Special FEBS 2003 Meeting on Signal Transduction, Brussels, Belgium, 2003, The 40th American Association for Cancer Research Annual Meeting, New Orleans, USA, 2003, Jomt International Symposium on CGRP, Amylin and Calcitonin 4* Symposium on Adrenomedullin and Proadrenomedulhn N-20 Peptide, Zurich, Switzerland, 2004, XXXIV Congress of Nordic Federation of Obstetrics of Obstetrics and Gynaecology, Helsinki, Finland, 2004, XI European Placenta Group Meeting, Glasgow, Umted Kingdom, 2005, Xlth Biennial International Gynecologic cancer Society Meetmg, Santa Monica, USA, 2006, The 24* European Conference on Microcirculation From Vascular Biology to Clinical Microcirculation, Amsterdam, Netherlands, 2006, The 9th International Workshop on Kaposi's Sarcoma Associated Herpesvirus (KSHV) and Related Agents, Cape Cod, USA, 2006, The Physiological Society 2006 Main Meetmg, London, Umted Kingdom, The 21st Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (ISH2006), Fukuoka, Japan, 2006
Публикации: основные материалы работы изложены в одной монографии, руководстве по эмбриологии, двух главах книг, 13 статьях в международных журналах, 21 материалах международных научных конференций, двух оформленных патентах на изобретение
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, общие выводы и указатель цитируемой литературы (189 источников). Работа иллюстрирована 61 рисунком и 10 таблицами
