Введение к работе
Актуальность проблемы
Вспомогательные репродуктивные технологии, возникшие 20 лет назад на стыке двух наук - медицины и биологии, отчасти позволили решить проблему бесплодия человека. Однако она по-прежнему остается актуальной в связи с высокой частотой потери беременностей в стимулированных лечебных циклах при эндокринном бесплодии.
Ключевым патогенетическим механизмом гиперпролактинемии и гипе-рандрогении является измененный гормональный статус женщины, что оказывает непосредственное воздействие на дифференцировку, пролиферацию и гибель клеток фолликула и эндометрия.
В ходе фолликулогенеза ооцит развивается в условиях локального микроокружения. В составе фолликулярной жидкости идентифицировано большое количество гуморальных факторов (цитокины, факторы роста, гормоны), осуществляющих паракринную регуляцию. По мере развития фолликула, созревание ооцита поддерживается активностью стероидогенеза в гранулёзных клетках, а прогрессивное снижение уровня эстрогенов ведет к атрезии фолликула. Атретические изменения, начавшиеся в клетках гранулёзы, затрагивают ооцит, что приводит к нарушению процесса оплодотворения яйцеклеток и /или предимплантационного развития эмбриона [A. Peter et al., 2003, А. Mikkelsen et al., 2005].
Одним из современных подходов к пониманию патогенеза различных заболеваний является изучение процессов регуляции клеточной гибели (апоптоза), составляющей важный компонент эмбриогенеза. Гормоны и факторы роста (ФР) регулируют экспрессию генов, кодирующих белки с проапопто-тическими и антиапоптотическими свойствами. Повышенная или пониженная концентрация тех или иных гормонов и ФР может служить причиной появления признаков апоптоза в гранулёзных клетках, и вызывать атрезию фолликула, либо инициировать апоптоз ооцита напрямую.
По некоторым данным атрезия доминантного фолликула тесно ассоциирована с апоптозом гранулёзных клеток посредством системы взаимодействий
FasR/FasL. Начальным этапом в этом процессе является активация FasR гранулёзных клеток. Считается, что взаимодействие между ооцитом, на мембране которых находится FasL, и гранулёзными клетками обеспечивает апоптоз последних и, следовательно, приводит к атрезии фолликула [J.K. Рш et al., 2002, Q. Chen et al., 2005, G. Onalan et al., 2005].
В настоящее время остается практически не изученной роль периферических бензодиазепиновых рецепторов (ПБР) в регуляции функциональной активности клеток репродуктивной системы. Вместе с тем, интенсивный сте-роидогенез, протекающий в этих клетках, подразумевает существенный вклад ПБР в регуляцию физиологических и патологических процессов в репродуктивной системе [V. Papadopoulos et al., 1998, М. Castedo et al., 2002].
В связи с вышеизложенным, существует необходимость комплексного изучения взаимосвязи интенсивности апоптоза и экспрессии ПБР в гранулёзных клетках человеческих фолликулов в условиях нормального и патологического стероидогенеза. Это позволит получить сведения и представления, определяющие новые подходы к решению проблемы диагностики и лечения репродуктивных расстройств.
Все вышеизложенное и определило основную цель работы, заключающуюся в изучении особенностей гуморального микроокружения, экспрессии ПБР и реализации программы апоптоза гранулёзных клеток антральных фолликулов у женщин с гиперпролактинемией и гиперандрогенией.
Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
-
Исследовать уровень андрогенов, эстрогенов, ЭФР, ИФР-1, оФРФ и СЭФР в сыворотке крови и фолликулярной жидкости при трубно-перитонеальной форме бесплодия (контроль), гиперпролактинемии и гиперандрогении.
-
Оценить уровень апоптоза гранулёзных клеток фолликулов, растворимых медиаторов апоптоза в фолликулярной жидкости при трубно-перитонеальной форме бесплодия (контроль), гиперпролактинемии и гиперандрогении.
-
Изучить уровень экспрессии ПБР в гранулёзных клетках фолликулов при трубно-перитонеальной форме бесплодия (контроль), гиперпролак-тинемии и гиперандрогении.
-
Оценить вклад изменений паракринной регуляции апоптоза и экспрессии ПБР в патогенез нарушений развития фолликула при гиперпролак-тинемии и гиперандрогении.
Научная новизна
В работе впервые описаны новые механизмы регуляции стероидогенеза и выживаемости гранулёзных клеток in vivo в норме, при гиперпролакгинемии и гиперандрогении, ассоциированные с изменением локализации ПБР и развитием процессов апоптоза при фолликулогенезе.
Разработана оригинальная методика получения суспензии гранулёзных клеток из кумулюсного слоя фолликулов.
Впервые особенности экспрессии ПБР в гранулёзных клетках фолликулов идентифицированы в качестве маркера стероидогенной активности, определяющей характер патофизиологических изменений при эндокринном бесплодии у женщин.
Впервые описаны физиологические эффекты ФР в фолликулярной жидкости, заключающиеся в инициации и регуляции прогрессии апоптотической гибели гранулёзных клеток: увеличение концентрации митогенных и проапоптотических факторов и снижение концентрации факторов выживаемости.
Идентифицированы патогенетически обоснованные критерии прогноза апоптоза в гранулёзных клетках: соотношение ИФР-1/ЭФР, изменение концентрации оФРФ и СЭФР в фолликулярной жидкости, локализация ПБР в гранулёзных клетках.
Впервые показана патогенетическая роль изменения локализации ПБР в развитии апоптоза, установлено, что ПБР могут являться маркерами стероидной активности гранулёзных клеток фолликула.
Разработана гипотетическая причинно-следственная взаимосвязь влияния уровня стероидных гормонов, соотношения проапоптотических факторов
(sFasR/sFasL), митогенных факторов (ЭФР, оФРФ) и факторов выживаемости и их соотношений (ИФР-1, СЭФР, ИФР-1/ЭФР, Е2Я), а также экспрессии и особенностей локализации ГОР на жизнеспособность клеток фолликула яичников.
Обосновано, что регистрация апоптоза гранулёзных клеток по окрашиванию клеток FITC-меченным Annexin V и ПЙ может быть использована в качестве маркера жизнеспособности клеток гранулёзы.
Теоретическая и практическая значимость работы состоит в том, что обнаруженные закономерности дизрегуляции инициации и прогрессии апоптоза и редислокации ГОР в гранулёзных клетках позволят разработать новые диагностические методы определения жизнеспособности ооцита, определяющие эффективность лечебного цикла ЭКО при эндокринопатиях.
Исследование экспрессии ГОР в гранулёзных клетках может применяться для оценки пролиферативной активности и эффективности стероидогенеза в гранулёзных клетках фолликула.
Полученные результаты могут быть применены в клинической медицине, патологической физиологии, клеточной и молекулярной биологии.
Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в научный процесс НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, в диагностическую деятельность РЛДЦ ИХМИ г. Красноярска, в учебный процесс кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, кафедры патологической физиологии, кафедры лабораторной диагностики НПО ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого МЗ и СР РФ, а также кафедры фундаментальных основ клинической медицины ГОУ ВПО СибГМУ МЗ и СР РФ. Основные положения, выносимые на защиту 1. Одним из важных звеньев патогенеза бесплодия при пшерпролактинемии и гиперандрогении является измененный состав фолликулярного микроокружения с доминированием митогенных (ЭФР, оФРФ) и проапоптотиче-ских факторов (sFasR/sFasL);
-
Информативным методом в оценке жизнеспособности гранулёзных клеток кумулюса фолликулов яичников женщин, стимулированных в программе ЭКО, является экспресс-диагностика флуоресцирующего комплекса Annexin V с фосфатидилсерином клеточной мембраны.
-
Ообенности экспрессии ПБР в гранулёзных клетках фолликулов соответствуют характеру изменения стероидогенной активности. ПБР экспресси-руются в гранулёзных клетках антральных фолликулов с преимущественной диффузной локализацией в цитоплазме. Развитие эндокринопатии сопровождается изменением субклеточной локализации ПБР: при гиперпро-лактинемии выявлена преимущественно перинуклеарная локализация; при гиперандрогении - гранулярная локализация.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены и обсуждены:
- на расширенном заседании НИИ молекулярной медицины и патобиохимии
ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого МЗ и СР РФ
(Красноярск, 2002 - 2008);
на заседании кафедры клинической лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого МЗ и СР РФ (Красноярск, 2008);
на второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и при патологии, посвященная 80-летию со дня рождения профессора Михаила Григорьевича Колпакова (Новосибирск, 2002);
на заседании НИИ педиатрии в лаборатории мембранологии ГУ Научный центр здоровья детей РАМН (Москва, 2003);
на X Российско-Японском международном медицинском симпозиуме (Якутск, 2003);
на XIX европейском симпозиуме по репродукции и эмбриологии человека (Мадрид: Испания, 2003);
- на XI международном симпозиуме российско-японского медицинского
обмена (Ниигата: Япония, 2004).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных'работ: из них в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, - 3, в тезисах докладов на съездах и конференциях всероссийского и международного уровней - 3.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы (26 отечественных и 149 иностранных источников). Текст диссертации иллюстрирован 7 таблицами, 67 рисунками в виде фотографий, диаграмм и концептуальных схем.
