Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Фагоцитоз как клеточно-биологический феномен 13
1.2. Нуклеотидные Р2Х7 рецепторы 27
1.3. С038/НАД+-гликогидролаза 36
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 48
2.1. Моделирование перитонита 50
2.2. Осмотр животных 51
2.3. Морфологическая оценка биоптатов брюшины 51
2.4. Выделение перитонеальных макрофагов 52
2.5. Идентификация и жизнеспособность макрофагов 52
2.6. Регистрация блеббинга плазматической мембраны 54
2.7. Детекция клеток, экспрессирующих Р2Х7 рецепторы 54
2.8. Регистрация экспрессии CD38 55
2.9. Определение АДФ-рибозилциклазной активности CD38 56
2.9.1. Определение содержания белка 56
2.9.2. Флуориметрический анализ АДФ-рибозилциклазной активности 57
2.10. Определение функциональной активности макрофагов 57
2.10.1. НСТ-тест 57
2.10.2. Спектрофлуориметрическая оценка функциональной активности макрофагов 58
2.11. Идентификация апоптотических макрофагов 60
2.11.1. Оценка апоптоза макрофагов методом TUN EL 60
2.11.2. Детекция апоптоза макрофагов методом Annexin V 60
2.12. Статистическая обработка результатов 61
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 63
3.1. Осмотр животных 63
3.2. Морфологическая оценка брюшины 66
3.3. Идентификация и жизнеспособность макрофагов 67
3.4. Блеббинг макрофагальной мембраны 69
3.5. Экспрессия Р2Х7 рецепторов и CD38 на перитонеальных макрофагах мышей 70
3.6. Активность АДФ-рибозилциклазы перитонеальных макрофагов мышей 72
3.7. Спонтанная и индуцированная активность макрофагов 73
3.8. Функциональная активность макрофагов 77
3.9. Апоптоз макрофагов 79
ЗЛО. Влияние FasL на функциональную активность и апоптоз макрофагов..84
3.11. Модуляция функциональной активности макрофагов 86
3.11.1. Воздействие через пуринергическую систему 86
3.11.2. Воздействие через систему пурин-изменяемых эктоферментов (CD38) 90
3.11.3. Воздействие через систему регуляции внутриклеточного кальция (рианодиновые рецепторы) 93
3.11.4. Воздействие через внутриклеточные флавопротеины 94
3.11.5. Сочетанное влияние модуляторов пуринергической, сопряженных с ней систем и индуктора апоптоза на функциональную активность
макрофагов мышей 95
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 101
Выводы 127
Практические рекомендации 128
Список литературы 129
- Фагоцитоз как клеточно-биологический феномен
- Детекция клеток, экспрессирующих Р2Х7 рецепторы
- Блеббинг макрофагальной мембраны
- Воздействие через систему регуляции внутриклеточного кальция (рианодиновые рецепторы)
Введение к работе
Проблема лечения гнойного перитонита, несмотря на более чем вековую историю, еще далека от своего окончательного решения и до настоящего времени не перестает привлекать внимание хирургов и исследователей. Летальность при перитоните различной этиологии, даже при использовании? всего арсенала современных методов лечения, колеблется от 6,7 до 76 %. Актуальность инфекций, вызванных грамположительными микроорганизмами, возрастает во всем мире в связи с эндогенной' интоксикацией и антибиотикорезистентностью возбудителей хирургической инфекции. Среди аэробных микроорганизмов при внебольничных-интраабдоминальных инфекциях преобладают грамположительные кокки [163].
Наиболее значимые изменения' при воспалении связаны с усиленной активацией и последующей гибелью макрофагов, клеток с наиболее развитой фагоцитирующей функцией, патологические изменения в системе которых носят тяжелый характер [7].
К сожалению, на сегодняшний день не выяснены некоторые аспекты патогенеза перитонита, что существенно снижает эффективность его лечения. Несмотря на многочисленные исследования в области морфологии и патофизиологии фагоцитов [1, 3, 8, 13, 32, 34], остаются непонятными некоторые механизмы активации, функционирования и гибели макрофагов, а также ограничены сведения о возможности патогенетической терапии их функций [5, 6, 7, 22, 27] при состояниях, связанных с нарушением активности фагоцитов.
Сравнительно недавно были высказаны предположения о новых механизмах, играющих критическую роль в активации и функционировании макрофагов в ответ на праймирующие стимулы, с участием сигнальных молекул (пуринергические рецепторы, НАД+-метаболизирующие ферменты, протеинкиназы) [33, 45, 57, 84, 128, 144, 154]. Значительный интерес имеет
изучение механизмов, ответственных за дизрегуляцию механизмов фагоцитоза, в том числе ассоциированных с нарушением активности клеточных сигнальных систем [98, 152]. В настоящее время существуют немногочисленные сведения об особенностях экспрессии указанных сигнальных молекул на клетках моноцитарно-макрофагальной природы, роли Р2Х7 рецепторов и НАД+-гликогидролазы/СБ38 в регуляции внутриклеточного гомеостаза кальция при воспалении [54, 74, 80, 94]. Однако до- сих пор отсутствует информация о взаимосвязи между пуринергической сигнализацией и активностью НАД+-гидролаз (в частности, АДФ-рибозилциклазы/С038) в клетках макрофагальной. природы в норме и при патологических состояниях, кроме того, нет сведений о возможностях фармакологической коррекции функций макрофагов за счет направленной модуляции указанных сигнальных систем.
Цель исследования
Изучение рецепторных и пострецепторных механизмов пуринергической регуляции активности перитонеальных макрофагов при остром экспериментальном воспалении (перитонит) для патогенетического обоснования новых стратегий фармакологической коррекции острого воспаления.
Задачи
Оценить экспрессию Р2Х7 рецепторов и АДФ-рибозилциклазы/СБ38 на перитонеальных макрофагах при остром перитоните.
Изучить характер изменения пуринергической рецепции и АДФ-рибозилциклазной активности и функциональной активности макрофагов при остром перитоните.
3. Исследовать Р2Х7-опосредованную регуляцию активности АДФ-
рибозилциклазы/С038 перитонеальных макрофагов в норме и при остром
перитоните.
Оценить особенности развития апоптоза и некроза, влияние индукторов апоптоза на Р2Хт-опосредованную регуляцию активности АДФ-рибозилциклазы/С038 перитонеальных макрофагов в норме и при остром перитоните.
Патогенетически обосновать новую технологию коррекции функциональной активности перитонеальных макрофагов за счет направленной модуляции экспрессии и активности, пуринергических рецепторов и АДФ-рибозилциклазы/С038.
Научная новизна
Впервые описаны новые механизмы регуляции функциональной активности и выживаемости перитонеальных макрофагов в норме и при остром экспериментальном воспалении, ассоциированные с пуринергической сигнализацией, АДФ-рибозилциклазной активностью и внутриклеточными рианодиновыми рецепторами.
Впервые установлены особенности функционирования рецепторных и пострецепторных механизмов внутриклеточной сигнальной трансдукции, ассоциированных с активностью пуринергических РгХ7 рецепторов перитонеальных макрофагов, в норме и при развитии острого экспериментального воспаления, а также взаимосвязь АДФ-рибозилциклазной активности перитонеальных макрофагов с их чувствительностью к апоптогенным стимулам.
Впервые разработан и использован метод регистрации функциональной активности перитонеальных макрофагов по кинетике аутофлуоресценции клеток.
Впервые описаны физиологические эффекты лиганда Fas-рецептора в перитонеальных макрофагах, заключающиеся в регуляции активности АДФ-рибозилциклазы и НАД(Ф)Н-оксидазы.
Впервые идентифицированы новые патогенетически обоснованные подходы к модуляции активности макрофагов при остром
воспалении: антагонисты и лиганды пуринергических рецепторов, лиганд и субстрат С038/НАД+-гликогидролазы, модуляторы рианодиновых каналов, ингибиторы внутриклеточных флавопротеинов и индукторы апоптоза.
Личный вклад соискателя
Научные результаты, обобщенные в^ диссертационной работе Малиновской Н.1 А., получены самостоятельно. Диссертантом выполнено лично:
- определение цели, разработка конкретных задач работы и плана их
выполнения;
составление протоколов исследований;
набор экспериментального материала;
моделирование перитонита у экспериментальных животных;
осмотр контрольных и экспериментальных животных;
проведение гистологического исследования препаратов париетальной брюшины мышей (под контролем зав. каф: патологической анатомии ГОУ ВПО КрасГМА Росздрава Зыковой Л. Д.), клеточно-биологических исследований (подсчет клеточности и жизнеспособности, цитодифференцировка, детекция блеббинга, НСТ-тест) и флуориметрических исследований АДФ-рибозилциклазной активности CD38 и функциональной активности макрофагов (под контролем доц. каф. квантовой электроники ГОУ ВПО СФУ Салмина В. В.);
проведение иммуноцитохимических исследований (удостоверение о краткосрочном повышении квалификации по программе «Клиническая иммунология с курсом иммуногистоцитохимии» №89, ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России, Санкт-Петербург, 2006 г.);
статистическая обработка материала исследований и интерпретация результатов;
- написание автореферата и текста диссертации.
Практическая значимость работы
Установлено, что Р2Х7-рецепторы и CD38 являются маркерами активации клеток мононуклеарно-макрофагального ряда.
Доказано участие Р2Х7 рецепторов и С038/АДФ-рибозилциклазы в регуляции функциональной активности макрофагов и индукции клеточной смерти, что позволяет рассматривать эти молекулы в качестве мишеней для фармакологической коррекции нарушенных функций фагоцитов.
Разработан и внедрен новый оригинальный метод регистрации функциональной активности клеток макрофагальной природы.
Дано патогенетическое обоснование новых технологий модуляции функциональной активности макрофагов в норме и при воспалении за счет регуляции экспрессии Р2Х7 рецепторов, экспрессии и АДФ-рибозилциклазной активности CD38, активности рианодиновых каналов.
Положения, выносимые на защиту
Регуляция функциональной активности перитонеальных макрофагов осуществляется с участием сигнального пути, утилизирующего пуринергические рецепторы Р2Х7 подтипа, АДФ-рибозилциклазу/С038 и внутриклеточные кальцивые депо, регулируемые рианодиновыми рецепторами.
Экспрессия и активность пуринергических рецепторов Р2Х7 подтипа и CD38 перитонеальных макрофагов увеличиваются при развитии острого экспериментального перитонита.
Реализация механизмов запрограммированной и патологической гибели макрофагов при воспалении утилизирует АДФ-рибозилциклазную активность CD38 и пуринергическую сигнализацию.
Изменения внутриклеточной сигнализации перитонеальных макрофагов при развитии острого экспериментального перитонита затрагивают как рецепторный (пуринергическая регуляция), так и пострецепторный (НАД+-гликогидролаза, активность рианодиновых рецепторов) уровни; молекулы, участвующие в реализации этой
сигнализации, являются патогенетически обоснованными мишенями для фармакологической коррекции.
Внедрение результатов исследования
Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в работе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, а также при проведении практических занятий и семинаров у студентов КрасГМА. Результаты внедрены в учебный процесс кафедр биохимии и хирургических болезней № 2.
Подготовлены методические рекомендации «Внутриклеточная сигнализация в макрофагах: методы исследования1 и фармакологической модуляции», учебное пособие «Биохимия регуляций: пуринергические сигнальные каскады».
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на> заседании НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, заседании кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГОУ ВПО КрасГМА Росздрава (2007), на межгородской конференции молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии», г. Санкт-Петербург (2005 г., устный доклад «Метаболические осцилляции НАД(Ф)Н и запрограммированная клеточная гибель макрофагов при остром воспалении», диплом III степени), V Сибирском физиологическом съезде, г. Томск (2005 г., стендовый доклад «Аутофлуоресценция и апоптоз перитонеальных макрофагов при остром воспалении», сертификат участника), I Всероссийской молодежной медицинской конференции студентов и молодых ученых «Экстремальные и терминальные состояния», г. Омск (2006 г., устный доклад «Апоптоз и метаболические осцилляции НАД(Ф)Н перитонеальных макрофагов при остром экспериментальном перитоните», диплом Ш степени).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами и рисунками и состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего-167 источников (35 отечественных и 132 иностранных). Работа иллюстрирована 17 таблицами и 40 рисунками.
Благодарности:
Автор благодарит профессора, зав. кафедрой хирургических болезней № 2 ГОУ ВПО КрасГМА Росздрава А. Г. Соколовича и зав. отделения гнойной хирургии КГУЗ «Краевая больница» А. В. Степаненко за помощь в постановке модели экспериментального перитонита, доцента, зав. кафедрой микробиологии ГОУ ВПО КрасГМА Росздрава О. В. Перьянову за предоставление микробиологического материала для моделирования
перитонита. Автор признателен ст. лаборанту О. Ф. Мусаевой и лаборанту 3. Г. Сафиной за приготовление и окраску гистологических препаратов брюшины мышей и профессору, зав. кафедрой патологической анатомии ГОУ ВПО КрасГМА Росздрава Л. Д. Зыковой за помощь в описании препаратов брюшины. Автор благодарен доценту кафедры квантовой электроники ФГОУ ВПО СибФУ В. В. Салмину, сотрудникам кафедры квантовой электроники ФГОУ ВПО СибФУ и ассистенту кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГОУ ВПО КрасГМА Росздрава О. Л. Лопатиной за помощь в разработке и постановке спектрофлуориметрического метода. Автор выражает свою признательность сотрудникам НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО КрасГМА Росздрава Ю. А. Успенской и С. В. Михуткиной за помощь в разработке протоколов методов TUNEL, Annexin V, подсчета клеточности, жизнеспособности и детекции блеббинга.
Фагоцитоз как клеточно-биологический феномен
Тканевые макрофаги и их предшественники (моноциты, промоноциты и монобласты) образуют систему мононуклеарных фагоцитов. Макрофаги -долгоживущие мононуклеарные клетки костномозговой природы, цитоплазма- которых характеризуется умеренно развитым синтезирующим аппаратом и развитым комплексом лизосом. Для них характерна развитая клеточная периферия, которая обеспечивает фагоцитоз, пиноцитоз, секрецию и перемещение в пространстве. Перитонеальные макрофаги имеют неправильную сферическую форму, почковидное ядро, заметный клеточный центр и гранулы в цитоплазме, которые окрашиваются нейтральным красным. Более крупные клетки имеют больше гранул и неправильную форму [1, 32].
Роль макрофагові в иммунитете исключительно важна - они обеспечивают фагоцитоз, переработку и представление антигена лимфоцитам. Макрофаги вырабатывают ферменты, некоторые белки сыворотки, кислородные радикалы, простагландины и лейкотриены, цитокины (интерлейкины, фактор некроза опухолей и другие). Функции макрофагов можно условно разделить на неспецифические и специфические (иммунологические). К последним относят процессинг и презентацию антигенов, специфическую активацию макрофагов и цитотоксическую функцию. Кроме перечисленных, макрофаги выполняют следующие неспецифические функции: локомоторные (миграция и хемотаксис), прикрепление и распластывание, эндоцитоз (фагоцитоз и пиноцитоз), секреторную и регуляторную, цитотоксическую, регенеративную. Фагоцитирующая функция, наиболее выражена у макрофагов и патологии макрофагального звена носят тяжелый характер. Макрофаги играют важную роль в системе межклеточных взаимодействий при воспалении, активируют фибробласты, что способствует развитию фиброзных процессов в очаге хронического воспаления, выделяют фактор, стимулирующий пролиферацию клеток капилляров и факторы, регулирующие биосинтез белка в других клетках (например, сывороточного амилоида в гепатоцитах) [7, 16,23,30,31,34].
Выявлена двойная роль мононуклеарных фагоцитов в патогенезе стафилококк-индуцированной инфекции. С одной стороны, отсутствие макрофагов приносит благоприятный результат при острых повреждениях, но, с другой стороны, снижается клиренс бактерий моноцитами/макрофагами, что заканчивается выживанием стафилококков [163].
Популяция макрофагов функционально и морфологически гетерогенна, что отображает стадию жизненного цикла, на которой находится клетка. С функциональной точки зрения макрофаги могут пребывать в нескольких состояниях: резидентные (покоящиеся) - популяция макрофагов из определенных анатомических областей организма без какой-либо индукции и в отсутствии признаков эндогенного воспаления, воспалительные -макрофаги, рекрутированные из пула циркулирующих моноцитов, индуцированные - макрофаги, накапливающиеся в определенных областях под влиянием каких-либо экспериментальных воздействий, активированные - макрофаги с измененными свойствами и функциями (по сравнению с резидентными). Индуцированные и активированные макрофаги, в отличие от резидентных отвечают «метаболическим взрывом» не только на фагоцитоз, но и на другие стимулы [3, 8, 32].
Активация фагоцитов— результат преобразования внешнего стимула в реакцию эффекторных органелл. Активация различается- не только степенью возбуждения индивидуальных клеток, но и масштабом охвата клеточной популяции в целом. В норме активировано небольшое количество фагоцитов. Появление раздражителя резко меняет этот показатель, отражая подключение фагоцитов к реакциям, корригирующим внутреннюю среду организма. Активированные макрофаги обычно крупнее резидентных и имеют повышенную тенденцию к фагоцитозу и пиноцитозу. Их метаболическая активность усилена, цитоплазма4 богата лизосомами, митохондриями, свободными рибосомами и пиноцитозными везикулами, в макрофагах хорошо сформирован аппарат Гольджи [9, 81].
К ранним признакам (минуты-часы) активации макрофагов относят «окислительный взрыв», изменения- клеточной мембраны под влиянием активатора, изменения ферментативной активности клеток и их электрических свойств. К промежуточным признакам относятся продукция медиаторов, появление маркеров на поверхности клетки, увеличение способности к фагоцитозу и адгезивных свойств клетки. Поздние признаки (12-24 часа) активации . макрофагов: повышение уровня некоторых внутриклеточных (щелочной фосфодиэстеразы, катепсина) и секретируемых (лизоцима, коллагеназы, эластазы) ферментов, снижение уровня экто-5-нуклеотидазы [24].
Наиболее сильные естественные и синтетические активаторы макрофагов, оказывающие на них праймирующее действие - живые и убитые микроорганизмы (например, St. aureus), их компоненты, некоторые бактериальные продукты (например, совокупность стафилококковых токсинов: энтеротоксинов А и В, эксфолиативных токсинов А и В и токсина-1 СТШ), опсонизированный зимозан, форболовый эфир миристиновой и уксусной кислот, ионы кальция [89].
Учитывая гетерогенность функций, выполняемых клетками мононуклеорно-макрофагального звена иммунитета, методы оценки их функциональной активности также разнообразны и условно разделены Петровым Р. В. с соавторами (1984) на тесты 1-го и 2-го уровней. По данным этих авторов, тесты 1-го уровня являются ориентировочными и направлены на выявление грубых дефектов в иммунной системе; тесты 2-го уровня являются функциональными и направлены на идентификацию конкретной "поломки" в иммунной системе. К тестам 1-го уровня условно можно отнести методы определения абсолютного числа фагоцитов, оценки фагоцитоза (фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, коэффициент фагоцитарного числа, индекс переваривающей способности как показатель завершенности фагоцитоза). Процесс фагоцитоза состоит из нескольких этапов: хемотаксиса, адгезии, поглощения, дегрануляции, киллинга и разрушения объекта. Их изучение имеет определенную значимость, так как существуют патологии, связанные с наличием поломок, практически на каждом этапе [16,33].
К основным тестам- Т уровня можно отнести следующие группы методов:
1) Оценка хемотаксиса (двухфильтровый и радиоизотопный варианты метода Бойдена, хемотаксис под слоем агарозы);
2) Оценка адгезивных свойств (прилипаемость на поверхности стекла или в колонках с бусами, оценка распластывания при фазово-контрастной микроскопии, идентификация молекул адгезии);
Детекция клеток, экспрессирующих Р2Х7 рецепторы
Оценка блеббинга цитоплазматической мембраны проводилась на свежевыделенной суспензии макрофагов. Готовился нативный препарат и сразу же проводилась фазово-контрастная микроскопия (х900) с использованием микроскопа «Люмам Р8» и видеосистемы для анализа изображений-Nikon Coolpix 4500.
По-морфологии цитоплазматической мембраны дифференцировались следующие виды макрофагов: интактные (с визуально неизмененной цитоплазматической мембраной), в состоянии начального (мелкие везикулы на мембране диаметром до 1/3 от радиуса клетки) и терминального (крупные пузыри диаметром более 1/3 от радиуса клетки) блеббинга. Подсчет производился на 100 клеток при анализе не менее 10 полей зрения. Рассчитывалось относительное количество клеток в состоянии начального и терминального блеббинга и индекс блеббинга (отношение количества клеток в состоянии терминального блеббинга к общему количеству клеток в состоянии блеббинга), расценивающийся как параметр выраженности воспалительного ответа макрофагов (А. А. Фурсов, А. Б. Салмина, С. В. Михуткина и др., приоритетная справка № 2007109001 от 12.03.2007).
Детекция количества макрофагов; экспрессирующих Р2Х7 рецепторы, осуществлялась согласно стандартному протоколу двойного непрямого метода иммуноцитохимии. Препараты, приготовленные методом толстой капли, высушенные на воздухе и хранящиеся при +4С, фиксировались в парах 10% формальдегида в течение 10 минут при комнатной температуре. Неспецифическая активность блокировалась 30-минутной инкубацией (+37С) клеточной суспензии с 15 мкл 10% раствора инактивированной козьей сыворотки (WGS) в фосфатно-солевом буфере (PBS) во влажной камере. Затем наносили 15 мкл первичных (анти-Р2Х7 антитела кролика,
I Sigma-Aldrich, США) антител в рабочем разведении 1:50 в PBS с 1% WGS. Препараты инкубировались в течение часа в термостате во влажной камере. После инкубации в темноте наносили по 15 мкл вторичных антител (ФИТЦ-меченые антитела овцы к Ig кролика, Имтек, Россия) в рабочем разведении 1:150 в PBS с 1% WGS. Получасовая инкубация осуществлялась при +37С во влажной камере. На всех этапах осуществлялась 2-кратная отмывка препарата 2-минутной инкубацией с раствором PBS. На стекло наносили по 15 мкл монтирующей жидкости (50% глицерин в PBS), накрывали покровным стеклом и микроскопировали при увеличении х450 (микроскоп «Люмам Р8», ОМО, Россия; видеосистема для анализа изображений Nikon Coolpix 4500, Nicon, США). Оценивали количество РгХ7+ макрофагов на 100 клеток при анализе не менее 10 полей зрения и внутриклеточную локализацию РоХ7 рецепторов у РзХ7+ макрофагов.
Детекция числа клеток, экспрессирующих CD38, проводилась на макрофагах согласно стандартному протоколу прямого метода иммуноцитохимии. Препараты, приготовленные методом толстой капли, фиксировались в парах 10% формальдегида. Неспецифическая активность блокировалась инкубацией клеточной суспензии с 10% раствором WGS в PBS. В темноте наносили 15 мкл первичных антител (фикоэритрин-меченые антимышиные антитела, Caltag Laboratories, США) в рабочем разведении 1:50 в PBS с 1% WGS, препараты инкубировались в течение часа в термостате во влажной камере. На всех этапах осуществлялась 2-кратная отмывка препарата 2-минутной инкубацией с раствором PBS. Затем наносили монтирующую жидкость, накрывали покровным стеклом и микроскопировали при увеличении х450 (люминесцентный микроскоп «Люмам Р8», видеосистема для анализа изображений Nikon Coolpix 4500). Оценивалось количество CD38+ макрофагов на 100 клеток при анализе не менее 10 полей зрения и внутриклеточная локализация антигена у CD38+ макрофагов.
Блеббинг макрофагальной мембраны
С учетом того, что динамические изменения плазматической мембраны клетки являются интегральным показателем действия патогенных или активационных факторов [199], мы оценивали блеббинг плазматической мембраны макрофагов перитонеальной полости.
Полученные данные (Рис. 6, 7) свидетельствуют о достоверном (р 0,001) возрастании числа клеток в состоянии начального (в контрольной группе 15,8±1,12%, в экспериментальной - 30,8±2,21%) и терминального блеббинга (контроль - 4,8±0,72%, перитонит - 25,3±1,12%) у экспериментальных животных (п=9) по сравнению с контрольными (п=9).
Кроме того, наблюдалось значительное увеличение индекса блеббинга макрофагов (от 0,23±0,036 в контроле до 0,46±0,019 при перитоните, р 0,001), что свидетельствует о развитии выраженного воспалительного ответа у экспериментальных животных.
Таким образом, у экспериментальной группы мышей развивался выраженный воспалительный ответ, характеризующийся увеличением относительного количества макрофагов в состоянии начального и терминального блеббинга.
Иммуноцитохимическая детекция пуринергических рецепторов подтипа Р2Х7 выявила иммунопозитивный материал в примембранной области перитонеальных макрофагов (Рис. 8). Развитие острого перитонита характеризовалось увеличением количества Р2Х7-экспрессирующих макрофагов (от 3,6±0,41% в контрольной до 8,6±1,25% в экспериментальной группе, р=0,001, п=15) без изменения субклеточной локализации пуринергических рецепторов.
Была выявлена примембранная и цитоплазматическая локализация антигена CD38 (Рис. 9), что соответствует литературным данным о вариантах субклеточной локализации фермента. Количество С038-экспрессирующих макрофагов в контрольной группе животных составило 3,3±0,73% (п=15), тогда как в опытной группе достоверно (р 0.001) выше - 12,9+1,23% (п=15). Интересно, что в контрольной группе животных чаще (в 77,7% случаев) наблюдалась примембранная локализация CD38, тогда как при перитоните в 100% случаев была обнаружена диффузная цитоплазматическая локализация этого антигена.
Таким образом, при перитоните наблюдалось увеличение относительного количества Р2Х7 и CD3 8-позитивных макрофагов с изменением субклеточной локализации CD38.
Воздействие через систему регуляции внутриклеточного кальция (рианодиновые рецепторы)
Для установления взаимосвязи механизмов сигнальной трансдукции, использующих рианодиновые рецепторы как один из механизмов регуляции внутриклеточного кальция, с макрофагальной активностью, определялось влияние модулятора рианодиновых каналов, рианодина (50 мкМ), на параметры макрофагальной активности (Табл. 15).
Известно, что рианодин в низкой (1 мкМ) концентрации активирует, а в высокой концентрации (50 мкМ) ингибирует рианодиновые каналы [151]. Мы обнаружили, что рианодин в концентрации 50 мкМ вызывал разнонаправленные изменения макрофагальной активности (повышение максимальной амплитуды флуоресценции интегральной кривой в контрольной и снижение в экспериментальной группе) при однонаправленном укорочении времени достижения полувысоты интегральной,кривой в контрольной и экспериментальной группах.
Под влиянием рианодина (50 мкМ) между максимальной амплитудой флуоресценции интегральной кривой и временем достижения полувысоты интегральной кривой выявлена отрицательная корреляционная связь умеренной силы в экспериментальной группе (г = -0,54).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о разнонаправленном влиянии рианодина на активацию макрофагов в контрольной и экспериментальной группах.
Мы исследовали влияние дифениленйодониума (DPI), неконкурентного ингибитора флавопротеинов, на максимальную амплитуду флуоресценции интегральной кривой и время достижения полувысоты интегральной кривой (Табл. 16).
Выявлено, что DPI (10 мкМ) вызвал однонаправленные изменения обоих параметров функциональной активности макрофагов: снижение максимальной амплитуды флуоресценции интегральной кривой и укорочение времени достижения полувысоты этой кривой в контрольной и экспериментальной группах. Между этими параметрами при воздействии DPI (10 мкМ) выявлена отрицательная корреляционная связь умеренной, силы (г = -0,50) в экспериментальной группе.
Таким образом, полученные результаты» свидетельствуют об однонаправленном снижении функциональной активности макрофагов под действием DPI в контрольной и экспериментальной группах.
Для установления дополнительных путей воздействия на функциональную активность макрофагов изучалось сочетанное влияние FasL, индуктора альтернативного пути апоптоза, и модуляторов Р?Х7 рецепторов (АТФ, сурамин), рианодиновых каналов (рианодин) и клеточных флавопротеинов (DPI) на функциональную активность макрофагов и воздействие FasL и модуляторов Р2Х7 рецепторов (АТФ, сурамин) на АДФ-рибозилциклазную активность (Табл. 17). Обнаружено однонаправленное повышение активности АДФ-рибозилциклазы и функциональной активности макрофагов в контрольной и экспериментальной группах при сочетанном воздействии АТФ, рианодина и DPI с FasL и разнонаправленное изменение этих параметров при воздействии сурамина с FasL: усиление АДФ-рибозилциклазной и макрофагальной активности в контроле, их ослабление при перитоните. Интересно, что все указанные сочетания вызвали укорочение т/2 в контрольной и удлинение в экспериментальной группе.
![Роль управляемой лапаростомии в лечении распространенного гнойного перитонита [Электронный ресурс]](/i/i/4273/207828.png "Роль управляемой лапаростомии в лечении распространенного гнойного перитонита [Электронный ресурс] Барабаш Владимир Иванович")
