Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Биологическая активность фуллеренов и теоретические предпосылки для их местного применения при раневом процессе (обзор литературы) 12
1.1 Общие закономерности раневого процесса 12
1.2 Основные направления местного медикаментозного лечения ран 25
1.3 Биологическая активность фуллеренов.. 29
1.3.1 Проблема доставки фуллеренов к биологическим объектам 31
1.3.2 Основы биологического действия фуллеренов 33
1.3.3 Токсикология фуллеренов 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 45
2.1 Лабораторные исследования 46
2.2 Экспериментальные исследования 47
2.3 Биохимические исследования 50
2.4 Морфологические исследования 52
2.5 Методы статистической обработки данных 52
ГЛАВА 3. Исследование антиоксидантных свойств комплекса фуллерена С60 с N-поливинилпирролидоном 53
ГЛАВА 4. Общерезорбтивное действие комплекса фуллерена С60 с N-поливинилпироллидоном 59
4.1 Морфофункциональные изменения во внутренних органах при внутрибрюшинном введении Сбо/ПВП 60
4.2 Морфофункциональные изменения во внутренних органах при внутривенном введении Сбо/ПВП 80
ГЛАВА 5. Влияние комплекса с60/пвп на течение раневого процесса 88
ГЛАВА 6. Биоактивное фуллеренсодержащее губчатое раневое покрытие для местного лечения ран 95
6.1 Разработка биоактивного фуллеренсодержащего губчатого раневого покрытия 95
6.2 Исследование эффективности биоактивного фуллеренсодержащего губчатого раневого покрытия на модели условно асептических кожно-плоскостных ран 99
6.3 Исследование эффективности губчатого биоактивного фуллеренсодержащего раневого покрытия при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов 103
Заключение 108
Выводы 115
Практические рекомендации 116
Литература 118
Приложение 137
- Основные направления местного медикаментозного лечения ран
- Экспериментальные исследования
- Морфофункциональные изменения во внутренних органах при внутрибрюшинном введении Сбо/ПВП
- Исследование эффективности биоактивного фуллеренсодержащего губчатого раневого покрытия на модели условно асептических кожно-плоскостных ран
Введение к работе
Актуальность. Проблема лечения ран остается одной из самых актуальных в современной медицине. Общее число больных и пострадавших с гнойно-деструктивными процессами мягких тканей и их осложнениями составляет 30-35 % [30, 41, 79]. Наиболее часто такие процессы наблюдаются при механической травме, в том числе, при огнестрельных ранениях, вызванных снарядами с высокой кинетической энергией, а также при термической и электротравме [52, 64]. Данные виды патологии отличаются длительными сроками заживления ран, высокой частотой неблагоприятных исходов в виде генерализации патологического процесса, инвалидизации, стойкого ограничения трудоспособности [1, 78].
Как замечено академиком A.M. У голевым (1972), «когда врач начинает лечение больных, он независимо от его узких научных интересов пытается восстановить или, по крайней мере, улучшить нарушенный процесс и, следовательно, понять сам процесс и составляющих его звеньев». С нашей точки зрения, оптимизация раневого процесса является одной из наиболее актуальных проблем военно-полевой и гнойной хирургии. Современные достижения патофизиологии и более глубокие представления об основных звеньях патогенеза воспаления, возникающего после травмы, позволили усовершенствовать содержание комплексной местной медикаментозной коррекции расстройств в тканях, окружающих рану [79, 193].
В последние годы активно изучается роль процессов вторичной альтерации в патогенезе раневого процесса [64, 76, 148]. Показано, что в основе формирования вторичных повреждений тканей в зоне воспаления, особенно в случае огнестрельных, гнойных ран, лежит активация процессов перекисного окисления липидов и нарушение функционирования системы эндогенной ан-тиоксидантной защиты [75, 176, 185]. Образующиеся при этом свободные радикалы и перекиси, нарастающий протеолиз и местный ацидоз усиливают деструкцию клеток, дистрофические процессы и приводят к увеличению объ-
ема повреждения, формированию вторичных некрозов, усилению микроцир-куляторных расстройств [9]. В связи с этим перспективным и патогенетически обоснованным направлением местного медикаментозного лечения ран различной этиологии следует считать совместное применение антиоксидантов с антибактериальными, некролитическими, антиферментными и другими препаратами, которые за счет синергетического действия на основные звенья раневого процесса способны предупредить его осложненное течение и сократить сроки заживления ран [11, 53, 66, 78]. Такое комплексное медикаментозное воздействие на раневой процесс достигается использованием раневых покрытий, мазевых и гидрогелевых композиций, физико-химические свойства которых позволяют совместить в одной лекарственной форме различные комбинации фармакологически активных веществ и, создавая их депо в раневой полости, обеспечивать длительный лечебный эффект [10, 20, 51].
В то же время, несмотря на большое количество известных химических соединений, обладающих способностью ингибировать свободнорадикальные процессы, арсенал эффективных антиоксидантных средств для местного лечения ран не велик [58]. Это связано с тем, что часть известных широко используемых препаратов являются жирорастворимыми веществами, что резко ограничивает возможность их применения в первой фазе раневого процесса [23, 51, 65]. Поэтому актуальной задачей современной медицинской науки является поиск новых химических соединений, сочетающих в себе выраженную антиоксидантную активность и способность растворяться в полярных растворителях.
В данных условиях обращают на себя внимание сообщения о биологических свойствах наночастиц, а именно фуллерена С60. Проведенные рядом авторов исследования позволяют утверждать, что в связи с уникальными химическими и физическими свойствами производные фуллерена СбО являются перспективным материалом для создания высокотехнологичных медицинских материалов и лекарственных препаратов [63, 98]. Установлено, что производные фуллерена Сбо проявляют антиоксидантную, мембранотропную,
иммунотропную, противовирусную, фотодинамическую активность, способны инактивировать ферменты [135, 170]. Экспериментально показано стимулирующие влияние фуллеренсодержащих мазевых композиций на основе вазелина на процессы посттравматической регенерации кожных ран [37].
Однако неспособность фуллеренов растворяться в полярных растворителях [94, 111, 169] затрудняет исследование их репаративных свойств и создание современных эффективных средств лечения ран на их основе. Кроме того, остается открытым вопрос токсикологии производных фуллерена Ceo-Ряд авторов отмечают отсутствие как острого, так и хронического токсического действия фуллеренов на организм при различных способах введения [157, 159, 164]. Другие, наоборот, в своих работах указывают на выраженные токсические эффекты фуллеренов на клетки кожи человека и головного мозга рыб [161, 171]. Не менее важными являются сообщения о возможности накопления фуллеренов в тканях печени и селезенки при внутривенном введении [100]. Несмотря на то, что авторы этих исследований отрицают возможность включения фуллеренов в процессы метаболизма, последствия депонирования их во внутренних органах требуют дополнительных исследований.
Отмеченные обстоятельства определили необходимость комплексного исследования биологических свойств водорастворимого комплекса Сбо с N-поливинилпирролидоном (ПВП), а именно, изучение антиоксидантных свойств, возможности или отсутствия его токсичности, общерезорбтивных свойств, влияния на течение раневого процесса.
Цель исследования: патофизиологическое обоснование местного применения комплекса фуллерена Сбо с N-поливинилпирролидоном при раневом процессе и разработка на его основе биоактивного раневого покрытия для лечения ран различной этиологии.
Задачи исследования:
1. Изучить антиоксидантные свойства водных растворов комплекса
фуллерена Сбо/ПВП;
Исследовать морфофункциональные изменения в тканях внутренних органов и динамику биохимических показателей крови при парентеральном введении комплекса Сбо/ПВП;
Изучить влияние комплекса Сбо/ПВП на течение раневого процесса;
Разработать биоактивное фуллеренсодержащее губчатое раневое покрытие для лечения ран различной этиологии, способное оказывать комплексное воздействие на раневой процесс - как в первой, так и во второй его стадиях, и экспериментально изучить его эффективность на моделях условно асептических кожно-плоскостных ран и гранулирующих ран после глубоких ожогов.
Научная новизна:
Путем определения антирадикальной активности и супероксидпроду-цирующей активности тканевых макрофагов исследованы антиоксидантные свойства комплекса Сбо/ПВП.
Исследование общерезорбтивных свойств комплекса Сбо/ПВП показало, что морфологические изменения в тканях внутренних органов, влияние на активность мембранных ферментов связаны с негативным действием N-поливинилпирролидона. Установлено, что фуллерен Сбо в составе комплекса проявляет цитопротективную активность, уменьшая отрицательное действие ПВП.
Выявлено стимулирующее влияние комплекса Сбо/ПВП на течение раневого процесса.
Разработано биоактивное фуллеренсодержащее губчатое раневое покрытие, обладающее высокой сорбционной, антисептической, антиоксидант-ной, антиферментной активностью, способное оказывать комплексное воздействие на основные звенья патогенеза раневого процесса как в первой, так и во второй его стадиях (приоритетная справка №2007119822 от 28.05.07).
Экспериментально установлена эффективность местного применения биоактивного фуллеренсодержащего губчатого раневого покрытия при лечении условно асептических кожно-плоскостных ран и гранулирующих ран после глубоких ожогов.
Теоретическая и практическая ценность:
Проведенные исследования антирадикальной активности и влияния на супероксиданионпродуцирующую активность тканевых макрофагов обуславливают целесообразность применения комплекса С60/ПВП в качестве антиоксидантного препарата.
Выявленные морфологические и биохимические изменения при парентеральном введении Сбо/ПВП подтверждают данные о негативном действии ПВП и свидетельствуют о цитопротективной активности фуллерена Сбо-
Результаты исследования антиоксидантной активности, влияния на раневой процесс комплекса Сб(/ПВП позволяют патогенетически обосновать возможность его местного применения при лечении ран различной этиологии.
Разработанное биоактивное фуллеренсодержащее раневое покрытие на основе желатиновой губки, обладающее высокой сорбционной, антиоксидантной, антисептической и антиферментной активностью, способствует оптимизации раневого процесса при лечении неинфицированных ран и гранулирующих ран после глубоких ожогов и сокращает сроки их заживления. Раневое покрытие показано для местного лечения неинфицированных и инфицированных ран, в том числе гнойных, огнестрельных, ожогов, пролежней и трофических язв.
Основные положения, выносимые на защиту:
Фуллерен Сбо в составе комплекса с N-поливинилпирролидоном проявляет антиоксидантную активность, которая имеет максимальные значения в водных растворах с 3-6 % содержанием Сбо/ПВП.
Парентеральное введение комплекса Сбо/ПВП вызывает дистрофические явления, нарушения микроциркуляции и реакцию со стороны тканевых
макрофагов (набухание, образование гигантоклеточных гранулем типа инородных тел) во внутренних органах, особенно в селезенке, печени и миокарде. Указанные изменения связаны с действием N-поливинилпирролидона. Фуллерен Сбо в составе комплекса Сбо/ПВП снижает негативное действие ПВП.
3. Водорастворимый комплекс Сбо/ПВП оказывает стимулирующее
влияние на течение раневого процесса. Усиление репаративных процессов
под действием комплекса происходит в первой фазе раневого процесса и со
кращает срок заживления неинфицированных ран.
4. Биоактивное фуллеренсодержащее губчатое раневое покрытие с им
мобилизованными в его составе комплексом Сбо/ПВП, антисептическим (ди-
оксидин) и антиферментным (Е-аминокапроновая кислота) препаратами яв
ляется эффективным средством местного лечения неинфицированных ран и
гранулирующих ран после глубоких ожогов. Его применение предупреждает
осложненное течение раневого процесса и сокращает сроки заживления ран
на 20 %.
Реализация работы. По теме исследования опубликовано 16 печатных работ. Подана заявка для получения патента на изобретение: "Губчатый биоактивный препарат для местного лечения ран" (приоритетная справка №2007119822 от 28.05.2007). Получен патент на полезную модель: «Гидроге-левое лечебное покрытие» (патент № 73198 от 09.01.2008). Зарегистрировано 12 рационализаторских предложений. Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры патологической физиологии ВМедА.
Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования доложены в докладах на итоговых научных конференциях курсантов и слушателей ВМедА (2005, 2006, 2007, 2008), на 1-й Международной научно-практической конференции "Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике" (Санкт-Петербург, 2005), в работе Российской школы-конференции молодых ученых и преподавателей «Биосовместимые наноструктурные материалы и покрытия медицинского
назначения» (Белгород, 2006), на Международной выставке-конгрессе по развитию и исследованию нанотехнологий и наноматериалов в Санкт-Петербурге и Северо-Западном ФО (Санкт-Петербург, 2008), на Экофоруме «Окружающая среда и здоровье» (Санкт-Петербург, 2008).
Результаты работы представлены в виде постерных докладов на Международных Салонах промышленной собственности - "Архимед 2005 и 2007", 10-й Международной выставке-конгрессе РЕСТЕК "Высокие технологии. Инновации. Инвестиции" (Санкт-Петербург, 2005), 7-й Международной специализированной выставке "Экспо-Химия" (Санкт-Петербург, 2005) и на 36-м Международном конгрессе по военной медицине (Санкт-Петербург, 2005), на 8-ом международном конгрессе «Фуллерены и атомные кластеры» (Санкт-Петербург, 2007).
Объем и структура диссертации. Материалы диссертационного исследования представлены на 141 странице машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных лабораторных и экспериментальных исследований, выполненных на 30 кроликах, 160 крысах, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Работа содержит 31 рисунок и 13 таблиц. Список литературы включает 195 источников, из них 89 отечественных и 106 иностранных авторов.
Основные направления местного медикаментозного лечения ран
Современные представления о патогенезе раневого процесса, знание основных закономерностей, определяющих его течение, позволили сформулировать патогенетически обоснованные принципы местного медикаментозного лечения ран.
В I фазе раневого процесса патогенетически целесообразным является применение противовоспалительных, обезболивающих, антисептических, антибактериальных, антиферментных, протеолитических, антиоксидантных, дегидра-тационных средств [55, 58, 65, 66]. При этом обязательным условием использования препаратов указанных фармакологических групп является их гидрофиль-ность [23, 66].
Для проведения дегидратации широкое распространение получили водные гипертонические растворы (10% раствор NaCl и 20-40% растворы глюкозы), 30% раствор мочевины, 10-15 % растворы диметилсульфоксида [23]. В настоящий момент наиболее распространенными материалами, обладающими гиперос-молярной активностью, являются водорастворимые полимеры - полиэтиленок-сиды (ПЭО). На основе ПЭО созданы многокомпонентные мазевые композиции «Левосин», «Левомеколь», 5 % диоксидиновая мазь и др. [22]. Другим эффективным методом дегидратации является вульнеросорбция -использование сорбентов [26, 38, 66]. Применение сорбентов обеспечивает отток биологически активных веществ и микробных токсинов, за которыми следует тканевая жидкость. В результате уменьшается воспалительная реакция и отек. Возникающий ток тканевой жидкости наружу препятствует застою экссудата в ране и проникновению бактерий во внутреннюю среду организма. В клинической практике наиболее эффективными считаются сорбенты на основе углерода («Днепр», «Волна») [39, 85], полисахаридов («Дебризан») [51], поливинилового спирта («Гелевин») [3]. Кроме того, хорошими сорбирующими свойствами обладают губчатые перевязочные материалы на основе коллагена, желатина, хитозана, альгинатов [32, 42, 68].
Несмотря на широкий выбор сорбирующих и дегидратационных препаратов, в случаях, когда рану покрывает струп или раневой экссудат является достаточно густым, их активности оказывается недостаточно. При таких вариантах раневого процесса считается целесообразным применение кератолитиче-ских и протеолитических препаратов [17, 31], к которым относятся салициловая и бензойная кислоты [40, 58], трипсин и его производные, катепсин, коллагена-зы, стрептокиназа, аспераза [19]. Однако в связи с кратковременностью действия данных препаратов в ранах была предложена их иммобилизация на различных полимерах [17, 18]. Разработано большое количество раневых покрытий с протеолитическими ферментами - «Профезим», «Лизосорб», «Коллавин», «Те-раглим» и др. [51]. Среди мазей, содержащих ферменты, наиболее известной является «Ируксол» [44].
Для подавления раневой инфекции разработаны и используются различные антисептические и антибактериальные препараты. Из антисептических средств широкое применение нашли йодопирон, фурацилин, фурагин, борная кислота, хлоргексидин, 3 % перекись водорода, диметилсульфоксид -ДМСО 30-50 %, диоксидин 0,5-1 % , этоний 0,02-0,05 % , йодинол 1 % [23, 25, 31, 41, 55]. Наличие синегнойной и кишечной палочки оказывает тормозящее действие на раневой процесс. Преодоление синегнойной инфекции возможно локальным применением полимиксина М [65, 66], борной кислоты в виде присыпки или 3-4 % раствора, 1 % раствора уксусной кислоты, мафе-нида (сульфамилон, наполтан), 5 % диоксидиновой мази [30, 74]. Кишечная палочка и протей, высеваемые из отделяемого ран в 52 %, хорошо поддаются лечению ампициллином в сочетании с канамицином, левомецитином или ко-листином, тетраолеаном или неомицином, тетрациклином с левомецитином [31]. Активное действие на данные инфекции оказывают неграм, производные оксихинолина, сульфаниламиды [66].
Известно, что процесс свободнорадикального перекисного окисления липидов является одним из универсальных механизмов повреждения клеточных мембран различных тканей и органов. Некротические и воспалительные изменения поврежденных тканей сопровождаются усилением свободнорадикального перекисного окисления. Образующиеся при этом свободные радикалы и перекиси усиливают деструкцию клеток, дистрофические и некротические процессы, приводя к увеличению объема повреждения, формированию вторичных некрозов тканей, усилению микроциркуляторных расстройств [64, 120]. Использование в лечебных целях антиоксидантов стабилизирует собственную многокомпонентную систему антиоксидантной защиты и тормозит развитие свободнорадикального перекисного окисления липидов, клеточных и капиллярных мембран, предотвращая повреждение клеток и тканей, ограничивая распространение воспалительных изменений и вторичного некроза тканей. При этом значительно усиливается фагоцитарная активность макрофагов и повышается неспецифический иммунитет [9, 76]. Применение антиоксидантов при лечении огнестрельных ран через 1 час после ранения уменьшает количество иссекаемых тканей при первичной хирургической обработке в 1,3-1,85 раза [86].
В данный момент арсенал антиоксидантных средств не велик [58]. Известно, использование дибунола [9, 86], диэтона [45], мексидола [27], альфа-токоферола (витамин Е), витамина А, желчных кислот, липоевой кислоты [58]. Большие перспективы связаны с разработкой антиоксидантов на основе супер-оксиддисмутазы [29, 34]. Следует отметить, что липофильность некоторых антиоксидантов является их значительным недостатком, так как делает невозможным их применение в первой фазе раневого процесса [23, 51, 65]. В связи с этим предпринимаются попытки создания водорастворимых форм липофильных ан-тиоксидантов, например, альфа-токоферола [126].
Для преодоления высокой протеолитической активности в раневой среде, обусловленной высвобождением гидролитических ферментов, а также для снижения антибиотикорезистентности гноеродной микробной флоры полезно местное использование естественных и синтетических ингибиторов протеиназ [73]: кислоты аминокапроновой, контрикала, тзалола, трасилола.
Необходимость использования препаратов предупреждающих процессы вторичной альтерации также подтверждается высокой эффективностью пара-вульварных новокаиновых блокад с совместным введением глюкокортикойдов, ингибиторов протеаз и антибактериальных средств [66].
Экспериментальные исследования
В лабораторных условиях на базе кафедры синтетического каучука и элементоорганических соединений СПб Технологического института и Отдела нейрофармакологии Института экспериментальной медицины РАМН проведена разработка биоактивного фуллеренсодержащего губчатого раневого покрытия для местного лечения ран, исследовано влияние фуллерена Сбо в составе комплекса с N-поливинилпирролидона на физические свойства им-плантатов на основе водорастворимых полимеров - ПВС(поливиниловый спирт)-желатиновых и ПВС-коллагеновых пластин.
Биоактивное фуллеренсодержащее губчатое раневое покрытие для местного лечения ран изготавливали на основе желатиновой губки, в составе которой, помимо комплекса Сбо/ПВП, были иммобилизованы антибактериальный препарат - диоксидин, антиферментный и гемостатический препарат -Е-аминокапроновая кислота, пенообразователь - сульфанол, дубящий компонент - глутаровый альдегид.
Губчатый препарат получали методом механического диспергирования воздуха в исходный раствор в течение 10 мин с помощью аппарата-мешалки (скорость 2000 оборотов в мин). Полученную вязкую пену с кратностью, равной 4 (отношение конечного к исходному объему) разливали в полиэтиленовые формы и подвергали лиофильной сушке в течение суток в аппарате "LabConco". После высушивания происходило образование мелкоячеистой плотно-эластичной и упругой губки. Определены ее адсорбционная способность, плотность и набухаемость. Губчатое фуллеренсодержащее раневое покрытие упаковывали в двойную полиэтиленовую упаковку и стерилизовали гамма-облучением (ГОСТ ИСО 11737-2-2003 - 2,5 Мрад, ОАО "Медполимер", Санкт-Петербург). Влияние фуллерена Сбо в составе комплекса с N-поливинилпирролидона на физические свойства имплантатов на основе водорастворимых полимеров1 - ПВС-желатиновых и ПВС-коллагеновых пластин оценивали с помощью измерения прочности на разрыв и эластичности на машине РМИ-5. Всего проведено более 200 лабораторных опытов.
Общее количество животных, использованных в экспериментальной части работы составило 30 кроликов породы шиншилла, весом 3-4 кг, 160 крыс-самок линии Вистар, весом 180-200 г. Содержание экспериментов на животных представлено на таблице 2. Эксперименты на кроликах проводили под местной инфильтрацион-ной анестезией 0,5 % раствором новокаина. Эксперименты на крысах выполняли под эфирным наркозом (полуоткрытый контур). Кроликов выводили из опыта с помощью передозировки эфирного наркоза, крыс - путем декапита-ции.
После операций животные находились под динамическим наблюдением в условиях вивария. Содержание животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения научных исследований с использованием экспериментальных животных» (Распоряжение Президиума АН СССР № 120002496 от 02.04.80 г.) и с приказом МО РФ от 19 июня 2003 г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики». Результаты экспериментов оценивали по клиническому течению послеоперационного периода (активность, поведение, отношение к пище, мочеотделение, состояние послеоперационной раны).
Изучение влияния комплекса фуллерена Сбо/ПВП на течение раневого процесса проведено на модели кожно-плоскостных условно асептических ран спины крыс. В исследовании использовали комплекс СбсДІВП в виде крупнодисперсного порошка с содержанием Сбо 0,5 %. Для воспроизведения модели у крыс под эфирным наркозом выстригали шерсть в проекции будущей раны и по трафарету до фасции иссекали квадратный участок кожи размером 2,0 х 2,0 см. Рану осушали, осуществляли гемостаз и обрабатывали антисептиком. Животные были разделены на 2 группы (по 10 в каждой). Крысам 1 группы проводили аппликацию на раны мелкодисперсного порошка комплекса Сбо/ПВП. У животных 2 группы (контроль) раны покрывали мелкодисперсным порошком ПВП (препарат «Э»нтеродез»). Критериями эффективности служили скорость, срок полного заживления и гистоморфологическая картина ран на 7, 10, 14 и 21 сутки.
Исследование эффективности губчатого биоактивного фуллеренсодер-жащего раневого покрытия с разной концентрацией фуллерена (0,05 %, 0,1 % и 0,5 %) проведено на модели кожно-плоскостных условно асептических ран (50 крыс). Животные были разделены на 5 групп по 10 в каждой. Для воспроизведения модели кожно-плоскостной раны животным под эфирным наркозом по трафарету иссекали квадратный участок кожи до фасции размером 1,0 х 1,0 см. Раны обрабатывали 3 % раствором перекиси водорода. В качестве контроля служили раны, заживление которых происходило без лечения. В опытных группах на раны наносили соответствующие раневые покрытия. Фиксацию раневых покрытий осуществляли наложением контурной марлевой асептической повязкой. Перевязки выполняли через день.
Исследование эффективности фуллеренсодержащего губчатого раневого покрытия с 0,05 % содержанием Сбо при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов выполнены на 15 кроликах. Глубокий ожог моделировали специальным устройством. В качестве обжигающей поверхности использовали медную пластину размером 2,0 х 2,0 см с температурой нагрева 180С. Ожог наносили контактным способом в течение 10 сек. Через сутки под местной анестезией выполняли некрэктомию ожогового струпа, обработку раны 3 % раствором перекиси водорода, аппликацию раневого покрытия и его фиксацию с помощью асептической повязки. Критериями эффективности служили скорость заживления ран, сроки полного заживления и гистоморфо-логическая картина ран на 7, 10, 14 и 21 сутки.
Скорость заживления ран оценивали планиметрическим методом по Л.Н. Поповой [65] . При контрольных измерениях на рану накладывали стерильную пленку целлофана и на нее наносили контуры раны. Рисунок переносили на миллиметровую бумагу и подсчитывали площадь. Уменьшение площади раневой поверхности в процентном отношении к начальным размерам раны определяли по формуле (S=(S-Sn) х 100/S), где Sn - величина площади раны при данном измерении, S - начальная площадь раны. Скорость заживления определяли по формуле (V= S1-S2/ Т), где S1 - уменьшение площади раневой поверхности в процентах при предшествующем измерении, S2 - уменьшение площади раневой поверхности в процентах при данном измерении, Т - число дней между измерениями.
Морфофункциональные изменения во внутренних органах при внутрибрюшинном введении Сбо/ПВП
Изучение общерезорбтивных (общетоксических) свойств различных водорастворимых форм фуллерена Сбо является важной задачей в исследовании их влияния на биологические системы [63, 157, 164]. Это обусловлено, во-первых, недостаточным количеством данных литературы об исследовании токсических свойств комплекса Сбо/ПВП; во-вторых, противоречивостью опубликованных результатов, что связано с формой водорастворимого фуллерена, используемого в эксперименте, и непосредственно с технологией синтеза, так как при этом применяются достаточно токсичные вещества, и при недостаточной очистке от них в опыте возможно получение спорных результатов. В-третьих, как уже упоминалось, разные формы водорастворимого фуллерена могут иметь свои особенности распределения и проявления активности в организме, т.е. оказывать различное токсическое действие на живые системы. Кроме того, обращают на себя внимание публикации о негативном действии ПВП при парентеральном введении [16, 67, 144]. ПВП, являясь синтетическим полимером, плохо элиминируется из организма и куму-лируется в печени, костном мозге, почках, строме лёгких, сердца, половых органах с локализацией в цитоплазме макрофагов, а также внеклеточно, приводя к развитию тезаурисмозов. Отмечено, что ПВП вызывает выраженные расстройства кровообращения в сердце и печени в ранние сроки после введения препарата.
Исходя из важности вышеперечисленных обстоятельств с помощью морфологических и биохимических методов нами были изучены общерезор-бтивные свойства комплекса Сбо/ПВП.
Общерезорбтивные свойства комплекса Сбо/ПВП исследовали при различных вариантах системного введения - внутрибрюшинном и внутривенном. При внутрибрюшинном варианте введения комплекса Сбо/ПВП проводили гистологические исследования тканей внутренних органов (головной мозг, легкие, сердце, печень, селезенка, почки) и биохимические исследования активности мембранных ферментов - сахаразы, мальтазы, аминопептида-зы М, щелочной фосфатазы, глицил-Ь-лейциндипептидазы в полых (тонкая кишка) и паренхиматозных органах (печень, почка) брюшной полости, изучена динамика содержания в тканях указанных органов общего белка. В эксперименте при внутривенном введении препарата оценивали морфологические изменения в тканях внутренних органов (головной мозг, легкие, сердце, печень, селезенка, почки) и исследовали изменения основных биохимических показателей сыворотки крови (креатинин, глюкоза, общей белок, аланинами-нотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (ACT), гамма-глутаматтранспептидаза (ГГТП)).
В ходе исследования проводили оценку общего состояния животных (особенности поведения, двигательная активность, состояние волосяного и кожного покровов, видимых слизистых оболочек). Различное введение растворов комплекса Сбо/ПВП не вызывало изменений в состоянии животных. Масса тела экспериментальных животных во всех группах имела устойчивую положительную динамику. Потребление животными жидкости и пищи нарушено не было.
Общерезорбтивное действие Сбо/ПВП при внутрибрюшинном введении исследовано в опытах на 70 крысах линии Вистар весом 180-200 грамм. Животные были разделены на 7 групп. Крысы 1-й группы являлись интакт-ными и служили контролем. Крысам 2, 3 и 4 групп внутрибрюшинно соответственно вводили по 1 мл 10 % водного раствора ПВП, 10 % водного раствора комплекса Ceo /ПВП и 25 % водного раствора комплекса Сбо/ПВП. Животных 2-4 групп выводили из опыта на 3 сутки после введения препаратов. Крысам 5, 6 и 7 групп вводили те же препараты в аналогичной дозе и выводили из опыта на 7 сутки. Результаты исследования активности мембранных ферментов и динамики содержания общего белка в тканях тонкой кишки, печени и почек приведены в таблице 5. Физиологическая роль исследованных мембранных ферментов представлена в приложении 5. Известно, что активность данных ферментов находится в определенном интервале нормы и, при различных видах патологии (гипоксия, ишемия органа и др.), ее показатели могут существенно изменяться, указывая на повреждение клеточных структур [80]. Представляем дифференцированную трактовку выявленных изменений по каждому ферменту. Сахараза. Из таблицы 5 видно, что у интактных животных активность этого фермента в слизистой тонкой кишки составила 3,2±0,7 мкмоль/мин на грамм ткани, что соответствует показателям нормы у крыс. Установлено, что введение 10 % вводного раствора ПВП, 10 % водного раствора комплекса Сбо/ПВП и 25 % водного раствора комплекса Сбо /ПВП изменяет активность сахаразы в тонкой кишке на 3 сутки - до уровня 3,9±0,4, 3,3±0,4, 3,8±0,5 и на 7 сутки - до уровня 3,6±0,5, 4,3±0,3, 5,1±0,4 соответственно. В печени и почки активность данного фермента не определялась. Таким образом, введение растворов ПВП и комплекса Сбо/ПВП на 3 сутки после аппликации не вызывало достоверных изменений активности сахаразы. На 7 сутки отмечено достоверное увеличение активности фермента до 5,1 ±0,4 только при введении 25 % водного раствора комплекса Сбо /ПВП против 3,2±0,4 у интактных животных. В других опытных группах на 7 сутки после аппликации показатель находился в интервале нормы. Мальтаза. Из таблицы 5 видно, что у интактных животных активность этого фермента в слизистой тонкой кишки составляет 30,9±4,8 мкмоль/мин на грамм ткани, в печени - 1,1±0,3, в почках - 27,0±5,2, что соответствует показателям нормы у крыс.
Исследование эффективности биоактивного фуллеренсодержащего губчатого раневого покрытия на модели условно асептических кожно-плоскостных ран
Как видно из таблицы 12 и рисунка 30, наиболее выраженный раноза-живляющий эффект выявлен при использовании раневого покрытия с содержанием фуллерена 0,05 %. Процент уменьшения площади раневого дефекта по отношению к исходной при использовании данного покрытия на 7 сутки составил - 65,4±1,7 %, на 10 сутки - 9б,5±0,7 %, на 12,4±0,2 сутки отмечено полное заживление ран. Процент уменьшения площади раневого дефекта при использовании покрытия с 0,1 % и 0,5 % содержанием фуллерена на 7 сутки составил соответственно 46,2±0,9 % и 36,3±1,1 %, на 10 сутки - 75,3±0,4 % и 65,1±2,1 %, на 14 сутки 92,4±1,3 % и 73,8±1,8 %, а полное заживление ран происходило на 16,4±0,2 и 20,5±0,4 сутки соответственно. Динамика заживления ран при аппликации раневого покрытия без включения фуллеренов была сравнима с 0,5 % фуллеренсодержащим раневым покрытием и составила на 7 сутки - 38,5±0,8 %, на 10 сутки - 66,9±0,9 %, на 14 сутки -75,2±2,7 %, полное заживление ран наблюдали к исходу 20,2±0,5 суток. В контрольной группе показатели уменьшения площади ран на 7 сутки — 34,9±1,6, на 10 сутки - 62,9±1,3, на 14 сутки - 71,2±0,9, полное заживление ран регистрировали на 20,8±0,2 сутки.
Оценка показателей скорости заживления ран показала, что интенсификация течения раневого процесса на фоне применения ФРП 0,05 % и ФРП 0,1 % происходила в первые 7 суток. Так показатель скорости заживления ран в эти сроки при использовании ФРП 0,05 % и ФРП 0,1 % составил 9,3±0,2 и 6,6±0,1 соответственно, а в контрольной группе, на фоне РП и ФРП 0,5% 5,0±0,2, 5,5±0,1 и 5,2±0,2 соответственно. Показатели скорости заживления на 10 и 14 сутки во всех группах были сравнимы (таблица 12).
Гистоморфологические исследования ран на 3, 10 и 14 сутки позволили отметить следующие особенности регенерации в экспериментальных группах. На 3 сутки во всех группах поверхность ран была покрыта тонким слоем фибрина, определялись признаки воспалительной реакции (инфильтрация нейтрофилами), наблюдалось очищение ран от нежизнеспособных тканей. Однако выраженность воспалительной реакции в группе ФРП 0,05 % была заметно меньшей, отмечалось преобладание макрофагов над нейтро-фильными гранулоцитами и формирование островков хорошо васкуляризи-рованной грануляционной ткани. На 10 сутки на фоне применения ФРП 0,05 % зрелая грануляционная ткань заполняла всю полость раневого дефекта, края раны были покрыты эпителием. В группе, где использовали ФРП 0,1 % грануляционная ткань покрывала все дно раны, а эпителий формировался в приграничной зоне, где происходило его подрастание под струп между фибриноидом и вновь образованной грануляционной тканью. В остальных группах (ФРП 0,5 %, РП и контроль) гистоморфологическая картина свидетельствовала об ослаблении процессов пролиферации фибробластов и ангиогенеза: грануляционная ткань была представлена в виде островков, характеризовалась незрелостью, сниженной пролиферативной активностью фибробластов. На 14 сутки в группе ФРП 0,1 % грануляционная ткань заполняла всю полость раневого дефекта, эпителизация была еще не завершена -эпителий не покрывал дефект полностью. В то же время, под влиянием ФРП 0,5 %, РП и в контрольной группе выявлено фиброзирование грануляционной ткани в глубоких отделах ран, в поверхностных участках обнаружены вертикальные сосуды с многочисленными макрофагами и нейтрофилами между ними, что свидетельствует о замедлении фиброзной трансформации грануляционной ткани, эпителий только наползал с краев раны в виде клина.
Таким образом, проведенное исследование выявило, что наиболее выраженный ранозаживляющий эффект проявляет фуллеренсодержащее раневое покрытие с 0,05 % содержанием Сбо, причем интенсификация хода раневого процесса под его влиянием по сравнению с ФРП 0,1 %, ФРП 0,5 % и РП происходит в первой фазе раневого процесса — фазе воспаления. Данный факт подтверждает влияние фуллерена в составе раневого покрытия на процессы вторичной альтерации, реализующееся благодаря его антиокси-дантной активности, что в комбинации с диоксидином и Е-аминокапроновой кислотой обеспечивает оптимизацию общего хода раневого процесса и его неосложненное течение.
Эффективность губчатого биоактивного фуллеренсодержащего раневого покрытия при местном лечении глубоких ожогов исследовали в эксперименте на 15 кроликах. На спине кроликов моделировали два ожога площадью 4 см2 каждый с помощью специального устройства. В качестве обжигающей поверхности использовали медную пластину размером 2,0 х 2,0 см с температурой нагрева 180С. Ожог наносили контактным способом в течение 10 с. Через сутки под местной анестезией выполняли некрэктомию ожогового струпа, обработку ран 3 % раствором перекиси водорода. На одну из ран проводили аппликацию 0,05 % фуллеренсодержащего раневого покрытия (опыт), на другую - раневого покрытия без включения фуллеренов (контроль). Критериями оценки служили скорость заживления, сроки полного заживления и гистоморфологическая картина ран на 7, 10, 14 и 21 сутки. Скорость заживления ран оценивали планиметрическим методом.
