Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА, 1. Аналитический обзор литературы 16
1.1. Современные представления об этиологии и патогенезе гастроэзофагеальной рефлюксной болезни 16
1.2. Современные представления о взаимосвязях между микрофлорой желудочно-кишечного тракта и заболеваниями пищеварительной системы 20
1.3. Естественные барьеры желудочно-кишечного тракта организма
человека и пути преодоления их патогенной микрофлорой 24
1.3.1. Естественные защитные барьеры желудочно-кишечного тракта... 25
1.3.2. Факторы патогенности Helicobacter pylori и их воздействие на
организм человека 31
1.3.3. Факторы патогенности наиболее распространенных
энтеробактерий и их воздействие на организм человека 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Материалы исследования 51
2.1.1. Общая характеристика обследованных 51
2.2. Методы исследования 55
2.2.1. Методы клинического исследования 55
2.2.2. Методы лабораторного исследования 56
2.2.3. Метод реакции коагглютинации с использованием стандартного набора диагностикумов для выявления антигенов Helicobacter pylori, шигелл, сальмонелл, кампилобактерий, иерсиний, CagA и VacA токсинов, шига-подобного и холероподобного токсинов 57
2.2.4. Морфологические методы исследования...' 62
2.2.5. Инструментальные методы диагностики 64
2.2.5 А. Фиброэзофагогастродуоденоскопия 64
2.2.5.2. Компьютерная рН-метрия желудка и пищевода 67
2.2.6. Лучевые методы исследования 72
2.2.6.1. Ультразвуковое исследование 72
2.2.6.2. Рентгенологические методы исследования 73
2.2.7. Методы многомерного статистического анализа полученных
данных 74
ГЛАВА 3. Частота выявления антигенов helicobacter' pylori, энтеробактерии и cag a, vac а токсинов и шигаподобного, холероподобного токсинов 76
3.1. Частота выявления антигенов Helicobacter pylori, энтеробактерий и CagA, VacA токсинов и шигаподобного, холероподобного токсинов у больных ГЭРБ и в группе контроля 76
3.2. Частота выявления антигенов Helicobacter pylori, энтеробактерий и CagA, VacA токсинов и шигаподобного, холероподобного токсинов у больных ГЭРБ 81
3.2.1. Частота выявления антигенов и CagA, VacA токсинов Helicobacter pylori 81
3.2.2. Частота выявления антигенов и шигаподобного, холероподобного
токсинов энтеробактерий 84
ГЛАВА 4. Клинические особенности и рн-метрические характеристики у больных гэрб при наличии cag а, vac а токсинов helicobacter pylori. и шигаподобного, холероподобного токсинов энтеробактерий 89
4.1. Особенности клинических проявлений ГЭРБ при наличии CagA, VacA токсинов Helicobacter pylori и шигаподобного, холероподобного токсинов энтеробактерий 90
4.2. Показатели суточного рН-мониторирования при наличии CagA, VacA токсинов Helicobacter pylori и шигаподобного, холероподобного токсинов энтеробактерий 109
ГЛАВА 5. Эндоскопические изменения слизистой оболочки пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки при наличии cag a, vac а токсинов helicobacter pylori и шигаподобного, холероподобного токсинов у больных гэрб 119
5.1. Особенности эндоскопической характеристики эзофагогастродуоденальной зоны желудочно-кишечного тракта у больных ГЭРБ при наличии CagA, VacA токсинов Helicobacter pylori и шигаподобного, холероподобного токсинов энтеробактерий 119
5.2. Особенности результатов ультразвукового исследования органов брюшной полости у больных ГЭРБ при наличии CagA, VacA токсинов Helicobacter pylori и шигаподобного, холероподобного токсинов энтеробактерий 125
Заключение 134
Выводы 146
Практические рекомендации 147
Список литературы 148
Приложение 169
- Современные представления об этиологии и патогенезе гастроэзофагеальной рефлюксной болезни
- Метод реакции коагглютинации с использованием стандартного набора диагностикумов для выявления антигенов Helicobacter pylori, шигелл, сальмонелл, кампилобактерий, иерсиний, CagA и VacA токсинов, шига-подобного и холероподобного токсинов
- Частота выявления антигенов Helicobacter pylori, энтеробактерий и CagA, VacA токсинов и шигаподобного, холероподобного токсинов у больных ГЭРБ и в группе контроля
- Особенности клинических проявлений ГЭРБ при наличии CagA, VacA токсинов Helicobacter pylori и шигаподобного, холероподобного токсинов энтеробактерий
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Активное изменение социально-экономической структуры современного общества, проявляющееся стремительной урбанизацией, нарастанием темпа жизни и негативного стрессорного влияния окружающей среды, резким ухудшением питания прямо сказывается на состоянии здоровья населения и вносит свои коррективы в общую картину заболеваемости в мире. Все более заметен рост частоты гастроэнтерологической патологии, среди которой особое место занимают гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ) (Трухманов А.С., 2001, Ивашкин В.Т., Шептулин А.А., 2003).
Важность изучения ГЭРБ обусловлена широкой распространенностью заболевания, частым доминированием симптомов гастроэзофагеального рефлюкса (ГЭР) в клинической манифестации болезней органов, пищеварения, значительным ухудшением- качества жизни больных, развитием тяжелых осложнений болезни. ГЭРБ свойственны, как типичные симптомы, так и нетипичные клинические проявления, которые затрудняют собственно диагностику и приводят к гипердиагностике некоторых заболеваний, например ишемической болезни сердца (ИБС) и бронхиальной астмы (БА) (Ковалева Н.А., 2000, Рощина Т.В., 2003, Пасечников В.Д., Ивахненко О.И., Слинько Е.Н., Морозов СВ., Цодикова О.М. и др., 2004). Особую значимость ГЭРБ приобрела в последние годы, когда было осмыслено клиническое значение пищевода Баррета - осложнения ГЭРБ, увеличивающего риск развития аденокарциномы пищевода (Годжелло Э.А., 2002, Ивашкин В.Т., Шептулин А.А., Баранская Е.А., 2003, Falk G.W., 2003).
Очевидная констатация факта увеличения числа больных, страдающих ГЭРБ, в соотношении с пептической язвой, дали основание провозгласить на 6-ой объединенной европейской неделе гастроэнтерологов
8 (Бирмингем, 1997 г.) лозунг «XX век - век язвенной болезни, XXI век - век гастроэзофагеальной рефлюксной болезни». Важным этапом в решении данной проблемы представляется введение понятия «Гастроэзофагеальный рефлюкс» в Международную классификацию болезней 10-го пересмотра в 1997г. (МКБ-10,1997, Маев И.В., Вьючнова Е.С., Щекина М.И., 2004).
ГЭРБ часто сочетается с другими заболеваниями желудочно-кишечного тракта (в 48% случаев), такими как: хронический гастрит (ХГ), язвенная болезнь (ЯБ), хронический панкреатит (ХП), хронический холецистит (XX) (Ивашкин В.Т., 2002, Гнусаев С.Ф., Иванова И.И., Апенченко Ю.С., 2003). Кроме того, ГЭР может выступать одним из проявлений целой группы функциональных расстройств желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) - снижения эвакуаторной функции желудка, дуоденогастрального рефлюкса, дуоденостаза и др. (Шептулин А.А., 2003, Троян В.В., 2004). Изменение моторной функции, кислотно-основного баланса верхних отделов ЖКТ влияет на кислотность проксимальных отделов тонкого и толстого кишечника, приводит к моторной дисфункции. Нарушение процессов эвакуации, расщепления и всасывания пищи приводит к изменению экологии ЖКТ, что создает благоприятные условия для размножения условно-патогенных микроорганизмов. Повышается риск заселения ЖКТ патогенной микрофлорой с последующим проникновением её во внутренние среды организма, что чревато развитием интоксикации и иммуннопатологических реакций с развитием воспалительного процесса в слизистой оболочке (СО), а также возможного отрицательного влияния на течение ГЭРБ (Вахрушев ЯМ., Потапова Л.О., 2004, Конев Ю. В., 2005).
Вопросы микроэкологии ЖКТ многие годы привлекают внимание специалистов различных областей медицины, что обусловлено обнаружением новых свойств микрофлоры, тесно связанной с организмом человека (Парфенов А.И., Осипов Г.А., Ручкина И.Н., 2003). Известно, что микроэкологическая система организма человека - это очень сложный динамичный комплекс, включающий в себя разнообразные по
9 количественному и качественному составу ассоциации микроорганизмов и продуктов их биохимической активности (метаболитов) в определенных условиях среды обитания (Коршунов В.М., Володин В.В., Ефимов- Б.А., 2000).
Отдельное место в изучении роли в патогенезе кислотозависимых заболеваний ЖКТ занимает Helicobacter pylori. Интенсивные эпидемиологические исследования показывают, что носителем бактерии является почти каждый второй человек и передача микроба чаще осуществляется от человека к человеку. Инфекция Helicobacter pylori считается важнейшим этиопатогенетическим фактором язвенной болезни (ЯБ), хронического гастрита (тип В), ассоциированного с микробом в 75-92% случаев, дуоденита (гастродуоденита), MALT-лимфомы и рака желудка. Международным агентством по изучению рака (IARC) бактерия в 1994 г. официально отнесена к канцерогенам I класса (Васильев Ю.В., 2002, Исаков В.А., Домарадский И.В., 2003). Длительная персистенция Helicobacter pylori в желудочно-двенадцатиперстном регионе сопровождается общим, системным воздействием на организм человека, связанным с циркуляцией множества биологически активных субстанций (токсины, цитокины, лейкотриены, простагландины и др.), а также с возможным развитием аутоиммунных реакций (Ющук Н.Д., Маев И.В., Гуревич К.Г., 2003). Предположительно, Helicobacter pylori может в определенной степени потенцировать развитие атеросклероза и его основных проявлений (ИБС, ишемический инсульт), быть причиной функциональной патологии сосудов (синдром Рейно), железодефицита, аутоиммунных заболеваний, системной патологии соединительной ткани (аутоиммунный тиреоидит, склеродермия, ревматоидный артрит, синдром Шегрена), кожных заболеваний (хроническая крапивница, розовые угри). (Gunn М., Stephens J.C., Thompson J.R., et al, 2000, Shiotani A., Okada K., YanaokaK., etal.,2001).
Роль Helicobacter pylori в патогенезе ГЭРБ и на сегодняшний день, остается предметом изучения и споров среди гастроэнтерологов. Ряд авторов отмечают, что излечение инфекции Helicobacter pylori при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки сопровождается развитием рефлюкс-эзофагита, и выделяют протективное действие бактерии на слизистую оболочку пищевода (Аруин Л.И., Исаков В.А., 2000).
В качестве факторов защиты слизистой оболочки ЖКТ рассматривают неиммунологические (механические, гуморальные, клеточные)- и иммунологические факторы. К неиммунологическим факторам защиты относятся соляная кислота (НС1), пищеварительные протеазы, молочная кислота, жирные кислоты (Калинина Е.В., 2007). А также кишечная моторика, микробы-комменсалы, лизоцим, лактоферрин, гликокаликс, слизистая муфта, эпителий кишечника, слизь, фагоциты. Кишечник представляет собой самый большой иммунный орган человека с обширной площадью контакта (около 400 кв. м) с многочисленными антигенами внешней среды (компоненты пищи, вирусы, бактерии, паразиты) (Митрохин С.Д., 2004). Около 80% всех иммунокомпетентных клеток (ИКК) организма локализовано именно в слизистой оболочке (СО) кишечника. Примерно 25% СО кишечника состоит из иммунологически активной ткани и клеток (Воеводин Д.А., Розанова Г.Н., Стенина М.А., 2005, Александрова В.А., 2006).
Нарушения иммунной системы ЖКТ могут привести к развитию дисбиоза - нарушению микробиоценоза* различных биотопов организма человека, выражающегося в нарушении соотношения анаэробы/аэробы, популяционных изменениях их метаболической активности и являющегося этиопатогенетическим механизмом многих заболеваний (Шендеров Б.А., 2001, Ключарева А.А., 2003). Важной особенностью дисбиоза в организме человека является его системный характер, т.е. процесс не ограничивается местом локализации (Циммерман Я.С., 2005). Нарушения спектра микрофлоры ЖКТ сопровождаются авитаминозами, аллергозами,
снижением иммунитета, что приводит к повышенному риску поражения организма человека патогенными микроорганизмами, в частности, широко распространенными возбудителями кишечных инфекций (Гриневич В.Б., Захарченко М.М., 2003, Суворов А.Н., 2004).
Кишечные заболевания распространены широко и повсеместно в связи с чем представляют собой актуальную проблему медицинской науки и практического здравоохранения (Лобзин Ю.В., 2003). Клиническая симптоматика при поражении патогенными микроорганизмами определяется специфическим действием одного или нескольких токсинов, продуцируемых конкретными штаммами бактерий. Наличие токсин-продуцирующих свойств у ряда микроорганизмов определяет патогенность того или иного штамма бактерий, способствует обострению, прогрессированию, декомпенсации хронических заболеваний ЖКТ (Simanenkov V.I., Suvorov A.N., BovaevaD.L, Solovyova O.I., 2004).
Актуальность и в то же время разрозненность изучения вышеуказанных проблем определяют целесообразность проведения исследований на стыке двух медицинских дисциплин - внутренних и инфекционных болезней.
Цель исследования:
Определить клинико-патогенетическое значение и роль специфических антигенов и токсинов Helicobacter pylori, энтеробактерий в развитии гастроэзофагеальной рефлюксной болезни.
Задачи исследования:
1. Определить наличие липополисахаридных антигенов Helicobacter pylori и основных энтеробактерий (шигелл, сальмонелл, иерсиний, кампилобактерий), а также их токсинов (высокомолекулярных белков CagA, VacA токсинов и шига-подобного, холероподобного токсинов) в сыворотке крови и копрофильтрате у больных ГЭРБ.
12 .
2. Исследовать ассоциации между клиническими проявлениями ГЭРБ
и обнаружением у больных специфических бактериальных антигенов и их
токсинов.
3. Установить корреляции между наличием токсинов Helicobacter
pylori, энтеробактерий и моторно-эвакуаторными нарушениями в
эзофагогастродуоденальной зоне у больных ГЭРБ.
4. Выявить характер и степень эндоскопических изменений слизистой
оболочки пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки по данным
фиброэзофагогастродуоденоскопии у больных ГЭРБ при наличии
специфических антигенов и токсинов бактерий.
Научная новизна исследования:
Впервые проведено скрининговое обследование больных с эндоскопически позитивной формой1 ГЭРБ для определения роли Helicobacter pylori, энтеробактерий и их токсинов в патогенезе заболевания с использованием малоинвазивного теста экспресс-диагностики (реакции коагглютинации). Выявлено, что у больных ГЭРБ антигены и токсины Helicobacter pylori и энтеробактерий в сыворотке крови и копрофильтрате обнаруживаются достоверно чаще, чем у здоровых лиц. Определена при наличии токсинов Helicobacter pylori, а также наиболее распространенных энтеробактерий частота встречаемости некоторых функционально-морфологических параметров верхних отделов желудочно-кишечного тракта.
Особенностями клинической картины при наличии токсинов Helicobacter pylori является большая частота встречаемости рефлюксного и абдоминального синдромов, пищеводных и внепищеводных проявлений ГЭРБ с определением положительных корреляций (р<0,05) с наличием в сыворотке крови больных ГЭРБ высокомолекулярных белков CagA, VacA токсинов. По результатам рН-метрического исследования отмечается увеличение частоты, продолжительности патологических кислых
13 гастроэзофагеальных рефлюксов и при эндоскопическом исследовании увеличение частоты встречаемости рефлюкс-эзофагита, заброса желудочного содержимого в пищевод с положительными корреляциями (р<0,05) с наличием в сыворотке крови больных ГЭРБ высокомолекулярных белков CagA, Vac А токсинов.
При наличии шига-подобного, холероподобного токсинов чаще встречаются клинические проявления со стороны пищеварительной системы и при эндоскопическом исследовании увеличение степени рефлюкс-эзофагита с положительными корреляциями (р<0,05) с наличием в сыворотке крови больных ГЭРБ высокомолекулярных белков шига-подобного токсина.
Личное участие:
В получении научных результатов, излагаемых в диссертационной работе, осуществлялась на всех этапах работы. Автором определены основные направления диссертационного исследования, которые реализованы в процессе углубленного изучения и анализа клинического и лабораторного материала. Автором выполнены сбор и анализ клинических данных, биологических сред для проведения иммунологических исследований, реакции коагглютинации, проведено суточное рН-мониторирование.
Практическая ценность:
По результатам исследования определена необходимость обследования больных ГЭРБ при длительно сохраняющихся симптомах заболевания на фоне продолжительной малоэффективной стандартной терапии, при развитии диспепсических нарушений на наличие специфических антигенов, токсинов Helicobacter pylori и основных энтеробактерий. Показана целесообразность использования в качестве информативного скринингового теста экспресс-диагностики реакции
14 коагглютинации, позволяющей обнаружить липополисахаридные антигены Helicobacter pylori, шигелл, сальмонелл, иерсиний, кампилобактерий и высокомолекулярные белки - CagA, VacA токсины, шига-подобный, холероподобный токсины в различных биологических средах организма.
Предложено, учитывая малую инвазивность и доступность метода, широко использовать результаты- исследования на наличие CagA и VacA токсинов Helicobacter pylori при решении ' вопроса о необходимости проведения эрадикационной антибиотикотерапии, а также для контроля эффективности лечения; как в стационарных, так и в амбулаторных условиях.
Положения, выносимые на защиту:
У больных с эндоскопически позитивной формой ГЭРБ антигены Helicobacter pylori и основных энтеробактерий, а также их токсины выявляются достоверно чаще, чем у здоровых лиц.
Циркуляция в организме CagA, VacA токсинов Helicobacter pylori ассоциируется с клиническим течением ГЭРБ в виде выраженного рефлюксного и абдоминального синдромов, коррелирует с наличием внепищеводных проявлений ГЭРБ, увеличением частоты и длительности патологического кислого гастроэзофагеального рефлюкса, выраженностью воспалительных изменений слизистой оболочки пищевода.
Наличие шига-подобного, холероподобного токсинов у больных ГЭРБ коррелирует с большей частотой- встречаемости жалоб со стороны пищеварительной системы и выраженностью воспалительных изменений слизистой оболочки пищевода.
Реализация исследования:
Результаты исследования используются в научной и диагностической работе кафедры и клиники пропедевтики внутренних болезней и кафедры и клиники инфекционных болезней с курсом тропических болезней Воєнно-
15 медицинской академии им. СМ. Кирова, г.Санкт-Петербург, научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи Российской Академии медицинских наук, г.Москва.
Апробация и публикация материалов исследования: По материалам диссертационного исследования опубликовано 7 печатных работ, в том числе 1 в журнале, рекомендованном ВАК, зарегистрировано 14 рационализаторских предложений. Основные положения работы представлены в материалах 8-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Гастро-2006» (Санкт-Петербург, 2006), доложены и обсуждены на пленарном заседании гастроэнтерологической секции научного терапевтического общества им. СП. Боткина (Санкт-Петербург, 2007).
Объем и структура работы:
Диссертация изложена на 185 страницах и состоит из введения, пяти глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений, иллюстрирована 40 таблицами. Указатель литературы включает 185 источников, из них 137 отечественных и 48 иностранных источников.
Современные представления об этиологии и патогенезе гастроэзофагеальной рефлюксной болезни
Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь — это комплекс характерных симптомов с наличием воспалительных изменений дистальной части пищевода, возникающих вследствие повторяющегося заброса в пищевод желудочного и /или дуоденального содержимого; желудочно-пищеводный рефлюкс без сопутствующего воспаления также входит составной частью в ГЭРБ (Ивашкин В.Т., Трухманов А.С., 2000).
Распространенность ГЭРБ среди взрослого населения составляет до 40%. Исследования, проведенные в России, показали, что изжогу — основной симптом заболевания испытывают 48,5% мужчин и 51,4% женщин. Из них часто жалуются на изжогу 3,7% женщин и 1,2% мужчин (Маев И.В., Балашова Н.Н., 2003). Российские исследования, проведенные в рамках программы ВОЗ MONICA ("Мониторинг заболеваемости и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний и уровней их факторов риска") в Новосибирске, показали, что изжогу испытывают 61,7% мужчин и 63,6% женщин, причем 10,3% и 15,1% - часто или постоянно. Исследования также показали, что изжогу испытывают 46% жителей Санкт-Петербурга, 46% жителей Красноярска, 37% - республики Тыва (Ивашкин В.Т., Шептулин А.А., Трухманов А.С., Склянская О.А., Коньков М.Ю., 2006).
В США изжогу 1 раз в месяц испытывают 44% взрослых американцев, 1 раз в неделю - 20%, а ежедневно от изжоги страдают 7% опрошенных. В странах Западной Европы изжогу хотя бы один раз в течение каждого месяца испытывают до 40-50% взрослого населения. Ежедневно в промышленно развитых странах симптомы ГЭРБ испытывают 4-10% населения, еженедельно — 30%, ежемесячно — 50%. У 30-50% пациентов, периодически испытывающих изжогу, выявляются эндоскопические признаки рефлюкс-эзофагита. В Японии только эндоскопически позитивная форма ГЭРБ выявляется у 16,5% популяции (Allescher H.D., 2002).
Мужчины болеют в основном в возрасте от 35 до 44 лет, женщины — от 25 до 34 лет. Определяются возрастные особенности в частоте выявления ГЭРБ. Так, с 18 лет частота заболевания увеличивается, а с 75 лет снижается (Шептулин А.А., 2000).
ГЭРБ является полиэтиологическим заболеванием, к предрасполагающим факторам которого относят стресс, ожирение, беременность, курение, грыжу пищеводного отверстия диафрагмы (ГПОД), прием некоторых медикаментов и некоторые факторы питания (Калинин А.В., 2003, Шептулин А.А., 2003, El-Serag Н.В., Johanson J.F., 2002, Fass R., 2003). И актуальной задачей современных исследований является поиск причин мультисистемности проявлений гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (Grossi L., Ciccaglione A.F., Marzio L., 2001, Веселов B.B., Шуман Мохамад Али Трад, 2003). ГЭРБ развивается вследствие: - снижения функции антирефлюксного барьера, которое может происходить за счет первичного снижения давления в нижнем пищеводном сфинктере, в результате увеличения числа эпизодов его спонтанного расслабления, из-за полной или частичной его деструктуризации, например, при грыже пищеводного отверстия диафрагмы; - нарушения клиренса пищевода: химического - вследствие уменьшения нейтрализующего действия слюны и бикарбонатов пищеводной слизи, объемного - из-за угнетения вторичной перистальтики и снижения тонуса стенки грудного отдела пищевода; - повреждающих свойств1 рефлюксата (соляная кислота, пепсин, желчные кислоты); неспособности слизистой оболочки пищевода противостоять повреждающему действию забрасываемого содержимого; - нарушения опорожнения желудка; - повышения внутрибрюшного давления.
Таким образом, с патофизиологической точки зрения ГЭРБ - это кислотозависимое заболевание, развивающееся на фоне первичной дисфункции верхних отделов пищеварительного тракта (Ивашкин В.Т., Шептулин А.А., Трухманов А.С., Склянская О.А., Коньков М.Ю., 2006).
На течение ГЭРБ в определенной степени влияет интенсивность желудочной кислотопродукции, способствуя с одной стороны, манифестации клинических проявлений ГЭРБ, а с другой — значительной частоте рецидивов после прекращения лечения. Большое значение в развитии и прогрессировании ГЭРБ играет качественный состав рефлюксата, количество в нем хлористоводородной кислоты, пепсина, желчных кислот, трипсина, лизолецитина и других ингредиентов. В значительной степени тяжесть заболевания зависит от концентрации хлористоводородной кислоты в рефлюктате.
Метод реакции коагглютинации с использованием стандартного набора диагностикумов для выявления антигенов Helicobacter pylori, шигелл, сальмонелл, кампилобактерий, иерсиний, CagA и VacA токсинов, шига-подобного и холероподобного токсинов
Лабораторные исследования выполнялись на базе лаборатории клиники кафедры пропедевтики внутренних болезней и кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской Академии имени С.М.Кирова по стандартным методикам на автоматических анализаторах «Spectrum» и «Technicon». Всем пациентам проводился общеклинический анализ крови (полный морфологический анализ крови-с окраской мазка периферической крови по Райту). В биохимическом анализе крови определяли общий холестерин, гепатоселективные ферменты (ACT, АЛТ, ЛДГ5), показатели нарушения желчеобразования (билирубин, щелочная фосфатаза), патологии поджелудочной железы (амилаза, трипсин, ингибитор трипсина), мальабсорбции (общий белок, его фракции, электролиты). Для оценки наличия воспалительного процесса определялись содержание сиаловых кислот (метод Гесса) и С-реактивного белка (преципитация в капиллярах).
В сыворотке крови иммунологическим методом реакции непрямой гемагглютинации с шигеллезным, сальмонеллезным, иерсиниозным и псевдотуберкулезным антигенами определяли антитела к данным антигенам, используя метод Манчини — простой радиальной иммунодиффузии на геле агар (Diana Nicoll, Stephen J. McPhee, Michael Pignone, William M. Detmer, Tony M. Chou with Associate Authors, 2004, Мак Нелли П.Р., 2005).
На базе бактериологической лаборатории научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи Российской Академии медицинских наук г.Москва осуществляли исследование биологических сред (копрофильтрат, сыворотка крови) полуколичественным иммунологическим методом реакции коагглютинации (РКА)? с целью выявления антигенов Helicobacter pylori и энтеробактерий, а также их токсинов. Для этого использовали стандартный набор диагностикумов для мультианализа - одновременного выявления термостабильных липополисахаридных антигенов наиболее распространенных возбудителей кишечных инфекций (шигелл Флекснера 2а, їв, Зонне; сальмонелл серогрупп В, С, СІ, С2, D, Е; кампилобактерий C.jejuni, coli, lari; иерсиний Y.pseudotuberculosis I, III, Y. enterocolitica 3,4,6,7,8,9) и Helicobacter pylori методом РКА на стекле. Также в копрофильтрате и сыворотке крови методом реакции коагглютинации на планшете с помощью тест-систем определяли термолабильные высокомолекулярные белки - антигены CagA, VagA токсинов Helicobacter pylori, шига-подобного и холероподобного токсинов энтеробактерий (Белая Ю.А., Белая О.Ф., Петрухин В.Г., 2004).
Принцип реакции коагглютинации основан на способности белка А золотистого стафилококка соединяться с Fc- фрагментом иммуноглобулинов IgGi классов; (Белая KD.А., Вахрамеева М.С., Белый Ю.Ф., Белая О.Ф., Петрухин В:Г., 2004);
Собранные пробы, сыворотки крови, копрофильтрата до исследования в РКА, хранились в замороженном: состоянии, транспортировка проб в, лабораторию, научно-исследовательского института: эпидемиологии и микробиологии им. Н:Ф. Гамалеи: Российской Академии медицинских наук г.Москва осуществлялась ві плотно закрытых пластиковыми пробками флаконах в- условиях сохранения температурного режима. Каждая? проба имела четкие несмываемые надписи и сопроводительное письмо с указанием фамилии; больного, номера истории болезни, даты рождения, даты заболевания., предположительного диагноза, даты взятия и вида пробы.
В качестве материала для-исследованшгиспользовали кал в количестве 1-2 г., сыворотку крови в количестве не менее 1,5 см?.. При; оформленном стуле добавляли 4-5 объемов ФСБ р№ 7,2--7,4 (фосфатно-солевой буфер: натрий фосфорнокислый двузамещенный - 16,2 г, калий фосфорнокислый однозамещенный - 4,9 г, натрий хлористый — 8,6 г, дистиллированной воды; де 1 литра)- гомогенизировали, отстаивали в течение 10-15 минут и надосадочную жидкость использовали . для- постановки: РКА;, При использовании сыворотки: крови проводили осаждение циркулирующих иммунных комплексов- (ЦИК) с использованием полиэтиленгликоля: (ПЭР); Для этого к 2,5 см? сыворотки крови добавляли 2,5 см3 боратного буфера рН 8,6 (буры 8j6-r, борной кислоты 6,82т, дистиллированной воды до 1 литра) ИЇ 4,5 см свежеприготовленного 5% раствора ПЭР 6000іна дистиллированной воде, перемешивали, выдерживали 2.часапри+4 С, центрифугировали при 2000 оборотах в. минуту в течение. 30 минут, декантировали, к осадку добавляли 0,5 см ФСБ, встряхивали. Подготовленные пробы кала;,. ЦИК перед постановкой реакции разводили дополнительно соответственно 1:5 и 1:20 в ФСБ.
Частота выявления антигенов Helicobacter pylori, энтеробактерий и CagA, VacA токсинов и шигаподобного, холероподобного токсинов у больных ГЭРБ и в группе контроля
В первую очередь были изучены частота определения наличия антигенов патогенных бактерий и их токсинов у больных ГЭРБ (67 человек) и в группе контроля (52 человека) методом РКА. По полученным данным количество случаев выявления в биологических средах специфических антигенов Helicobacter pylori, шигелл, сальмонелл, иерсиний, кампилобактерий, CagA и VacA токсинов, шигаподобного и холероподобного токсинов у больных с ГЭРБ статистически достоверно выше, чем в группе контроля, что представлено в таблице №8.
Анализ частоты выявление бактериальных антигенов и токсинов в биологических средах (сыворотке крови, копрофильтрате) проводился с учетом частоты встречаемости специфических антигенов и токсинов микроорганизмов отдельно в сыворотке крови (СК) и копрофильтрате (КФ), полученные данные представлены в таблице сравнения №9. При наличии антигенов и токсинов Helicobacter pylori и энтеробактерий в КФ можно предполагать о транзиторном бактериальном носительстве без проникновения патогена во внутренние среды организма, при определении их в СК - о нарушении защитных барьеров СО ЖКТ и попадании антигенов и токсинов микроорганизмов во внутренние среды организма.
Таким образом, одновременное определение в сыворотке крови- и копрофильтрате антигенов Helicobacter pylori отмечалось у 4 (5,97%) больных ГЭРБ, CagA и VacA токсинов - у 2 (2,99%) пациентов. Среди энтеробактерий одновременное обнаружение специфических антигенов в сыворотке крови и копрофильтрате отмечалось в следующем количестве: сальмонелл — у 6 (8;96%), иерсиний — у 1 (1,49%) больных ГЭРБ; в копрофильтрате определен холероподобный; токсин только у 1 (1,49%) пациента. Т.е. преобладает частота встречаемости бактериальных антигенові и токсинов в сыворотке крови,, чем в копрофильтрате, что подтверждает данные о высокой проникающей способности липополисахаридных антигенов и высокомолекулярных белков - токсинов (Єупотницкий М;В;,. 2005).
Таким- образом,, количественное соотношение выделенных патогенных микроорганизмов Helicobacter pylori : сальмонеллы : иерсиний : шигеллы : кампилобактерии в: группе больных ГЭРБ составило 4 (67,16%) : 3.(46,27%) : 2 (35,82%) : Г (25,37%) :: 1 (17,91%), в группе контроля данное! соотношение представлено как 7 (13,46%) : 3 (5,77%) : 2 (3,85%)- 2 (3 85%) : 1(1,92%);
Отмечается- статистически достоверное процентное увеличение случаев выявления специфических антигеновшатогенных бактерий-втруппе больных ГЭРБ в сравнении с группой здоровых лиц: Helicobacter pylori в 6-раз, шигелл в-7 раз .сальмонелл в 8 раз,, кампилобактерии и иерсиний в 9 раз: при уменьшении долевого соотношения Helicobacter pylori и энтеробактерий, что позволяет говорить о большей, частоте встречаемости липополисахаридных антигенов; возбудителей кишечных инфекций у больныхГЭРБ.
Наиболее, важным для нас представлялось изучить наличие токсинемии, указывающей на степень- активности штаммов выявленных микроорганизмов, частоту определения» у больных ГЭРБ токсинов Helicobacter pylori (GagA, VacA) и энтеробактерий (шигаподобного и холероподобного токсинов), являющихся факторами патогенносте бактерий. Роль токсинов в патогенезе вышеуказанных инфекций доказана и привлекает все большее внимание исследователей, как маркеры патогенности болезнетворных микроорганизмов. Так, токсин VacA является фактором адгезии и внедрения в мембрану эпителиальных клеток GO; VacA токсин создает каналы для получения питательного субстрата бактериями. Токсин CagA - маркер «острова патогенносте» Helicobacter pylori, после внедрения в клетку CagA токсин фосфорилируется и активирует продукцию цитокинов клетками эпителия (Дудик Т.В., 2001, Rokkas Т., Ladas S., Triantafyllou К., Liatsos С. et al., 2001). Шигаподобный и холероподобный токсины способствуют адгезии, инвазии возбудителя в энтероциты и оказывают цитотоксическое, нейротоксическое, энтеротоксическое действие. Способностью вырабатывать шигаподобный и холероподобный токсины обладает ряд бактерий, принадлежащих к различным родам семейства- Enterobacteriaceae (Бондаренко В.М., Рябиченко Е.В., Веткова Л.Г., 2004, Dantzer R., 2001).
По результатам проведенных исследований у больных ГЭРБ определены токсины Helicobacter pylori и энтеробактерий в следующем-соотношении: CagA, VacA токсины : шигаподобный токсин : холероподобный токсин 4 (59,70%) : 2 (28,36%) : 1 (13,43%), в группе контроля 7 (13,46%) : 3 (5,76%) : 1 (1,92%) со статистически достоверным процентным увеличением выявлениям токсинов Helicobacter pylori в 4 раза, шигаподобного токсина в 5 раз, холероподобного токсина в 7 раз.
Таким образом, отмечается статистически достоверное увеличение циркуляции в биологических средах организма больных ГЭРБ специфических антигенов и токсинов Helicobacter pylori, энтеробактерий, что подтверждает наличие сложных микробиотических процессов взаимодействия микроорганизмов, заселяющих различные отделы ЖКТ, которые могут оказывать влияние на ряд функционально-морфологических нарушений пищеварительной системы. Обнаружение в биологических средах организма бактериальных токсинов подтверждает факт жизнеспособности и патогенности микроорганизма, в то время как выявление только антигенов можно расценить как факт наличия неактивной формы бактерии (вегетативной у Helicobacter pylori) или транзиторного бактерионосительства (у энтеробактерий).
Особенности клинических проявлений ГЭРБ при наличии CagA, VacA токсинов Helicobacter pylori и шигаподобного, холероподобного токсинов энтеробактерий
При наличии токсинов энтеробактерий также выявлено статистически достоверное преобладание: клинических симптомов в; виде нарушения моторики верхних отделов: пищеварительной системы (изжоги, отрыжки: воздухом, привкуса кислого и; горечи во рту) с нарушением- пассажа» пищевого комка по пищеводу (дис- , одинофагии), а также большая частота встречаемости явлений кишечной- диспепсии (метеоризм, неустойчивый стул, болевые ощущениявразличных отделах живота);
По результатам: непараметрического корреляционного анализа выявлены положительные корреляции (р 0;05) между частотой встречаемости жалобсо стороны; пищеварительной системы, и токсинемией: между частотой встречаемости привкуса: кислого и горечи во- рту и наличием токсиновt Helicobacter pylori (Z=2,66 и Z=2,81; соответственно); шигаподобного токсина (Z=3,17 ш Z=2,51( соответственно);: отрыжки; воздухом - наличием TOKCHHOB Helicobacter pylori и-шигаподобного токсина (Z=2,95 и Z=2,78 соответственно); тошнотььи рвоты - токсинов Helicobacter pylori (Z=2,83 H;Z=4,29 соответственно) и шигаподобноготоксина =2,08-и Z=2,72.cooTBeTCTBeHHo).
Частота встречаемости болевых ощущений: в области живота коррелировала (р 0,05) с наличием токсинов Helicobacter pylori (Z=2,8 г) ш шигаподобного токсина (Z=2,29); одинофагии - с наличием? токсинов Helicobacter pylori (Z=3,97) и шигаподобного токсина (Z=2,72); дисфагищ- с наличием токсинов Helicobacter pylori (Z=4,74) и шигаподобного токсина (Z=3,25).
Отмечалась прямая зависимость (р 0;05) частоты встречаемости запоров от наличия шигаподобного токсина (Z=3,33), запоров и послабления стула от наличия токсинов Helicobacter pylori (Z=2,78 и Z=2,86 соответственно). Частота встречаемости чувства тяжести и вздутия в животе коррелировала (р 0,05) с наличием токсинов Helicobacter pylori (Z=2,79- и Z=3,00 соответственно) и шигаподобного токсина (Z=2,31 и Z=2,59 соответственно). Таким образом, наличие токсинов Helicobacter pylori и энтеробактерий приводит к большей выраженности жалоб со стороны пищеварительной системы. При анализе внепищеводных проявлений ГЭРБ оценивалось наличие и частота встречаемости жалоб со стороны органов сердечно-сосудистой (ССС) и дыхательной систем (ДС).
Выявлено статистически достоверное (р 0,05) увеличение частоты встречаемости внепищеводных проявлений ГЭРБ со стороны сердечнососудистой системы в группе с токсинами Helicobacter pylori в сравнении с группой без токсинемии. По результатам непараметрического корреляционного анализа выявлена прямая зависимость (р 0,05) частоты встречаемости перебоев сердцебиения и учащенного сердцебиения от наличия токсинов Helicobacter pylori (Z=2,37 и Z=2,96 соответственно).
Механизм развития нарушений со стороны сердечно-сосудистой системы, согласно литературным данным связан с рефлекторным действием ГЭР (Ковалева Н.А., Пасечников В.Д., Алферов В.В. и др., 2004). Возможно цитотоксическое действие CagA, VacA токсинов Helicobacter pylori оказывает раздражающее влияние на СО верхних отделов ЖКТ и провоцирует возникновение ГЭР, что показано выше, который в свою очередь приводит к развитию внепищеводных проявлений ГЭРБ в виде нарушений со стороны сердечно-сосудистой системы.
Отмечается тенденция к увеличению частоты встречаемости внепищеводных проявлений ГЭРБ со стороны сердечно-сосудистой системы (учащенное сердцебиение, боль за грудиной) в группе больных ГЭРБ, где выявлены токсины энтеробактерии в сравнении с группой без токсинемии. Таким образом, при наличии и отсутствии токсинов энтеробактерии, внепищеводные проявления со стороны сердечнососудистой ситемы не имеют статистически значимых различий и корреляционных связей.
Обращает внимание наличие перебоев в работе сердца при отсутствии бактериальных токсинов1 в сравнении с группой больных с токсинемией; что возможно связано с другиммеханизмом рефлекторного раздражения ССС.
