Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1. Строение и физиологическая роль митохондрий 10
1.2. Митохондриальный геном 11
1.3. Функции митохондрий 15
1.4. Роль митохондрий при сердечно-сосудистых заболеваниях 18
1.5. Факторы риска атеросклероза и митохондрии 26
1.6. Мутации митохондриального генома, ассоциированные с атеросклерозом коронарных и сонных артерий 30
1.7. Исследования, посвещенные изучению связи мутаций митохондриального генома с атеросклерозом 32
1.8. Новые митохондриальные объекты терапии 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Дизайн исследования 39
2.2. Общеклиническое обследование 40
2.3. Инструментальные методы обследования 41
2.4. Лабораторные методы исследования 43
2.4.1. Биохимическое исследование 43
2.4.2. Генетическое исследование 44
2.4.3. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови 44
2.4.4. Полимеразная цепная реакция 45
2.4.5. Электрофорез в агарозном геле 47
2.4.6. Пиросеквенирование ДНК 48
2.4.7. Определение уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома 50
2.5. Статистическая обработка данных 51
Глава 3. Результаты исследования 52
3.1. Сравнительная характеристика групп больных 52
3.2. Уровни гетероплазмии мутаций митохондриального генома 54
3.3. Оценка взаимосвязи классических факторов риска атеросклероза с мутациями митохондриального генома 58
3.3.1. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у мужчин и женщин 59
3.3.2. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов до 45 лет и после 45 лет 61
3.3.3. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов с наличием и отсутствием артериальной гипертонии 64
3.3.4. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов с наличием и отсутствием курения в анамнезе 66
3.3.5. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов в зависимости от наличия гиперлипидемии 69
3.3.6. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов в зависимости от наличия отягощенного семейного анамнеза 73
3.4. Взаимосвязь липопротеида(а) с мутациями митохондриального генома 76
3.5. Оценка выраженности атеросклеротического поражения коронарных артерий 77
3.6. Сравнительная характеристика пациентов с атеросклерозом сонных артерий 79
3.7. Оценка порогового уровня гетероплазмий мутаций митохондриального генома 83
3.8. Распределение мутаций митохондриального генома, превышающих пороговый уровень среди пациентов 86
3.9. Оценка диагностической значимости мутаций митохондриального генома как генетического биомаркера коронарного атеросклероза 89
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 91
Заключение 101
Практические рекомендации 101
Выводы 102
Список литературы 103
- Функции митохондрий
- Мутации митохондриального генома, ассоциированные с атеросклерозом коронарных и сонных артерий
- Инструментальные методы обследования
- Оценка взаимосвязи классических факторов риска атеросклероза с мутациями митохондриального генома
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Атеросклероз представляет собой полиэтиологическое заболевание, в развитии и прогрессировании которого играет роль взаимодействие генетических, фенотипических, средовых и социально-экономических факторов[AndreassiM.G., 2003]. Данные последних исследованийсвидетельствуют о том, что в развитии атеросклероза имеетзначение не только генетическая предрасположенность, но и приобретенные соматические мутации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) также могут вносить значительный вклад в патогенез заболевания. В течение длительного времени мутациям митохондриального генома не уделялось должноговнимания, хотя они могут играть важную роль в формировании атеросклеротических поражений артерий,вызывая различные дефекты в белковой цепи некоторых дыхательных ферментов, приводя к развитию митохондриальной дисфункции[Andreassi M.G., 2003]. Митохондриальная дисфункция способствует избыточному образованию активных форм кислорода, которые вызывают эндотелиальную дисфункцию, пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов, приводят к развитию воспалительной сосудистой реакции, апоптозу гладкомышечных клеток и макрофагов, внося, тем самым, вклад в развитие и прогрессирование атеросклеротического поражения [Madamanchi N.R. еt al., 2007].
Количество исследований, посвященных изучению связи мутациймитохондриального генома и атеросклеротическим поражением артерий, невелико [Sazonova M.A. et al., 2009; Weakley S.M. et al., 2010; Mueller E.E. et al., 2011; Sobenin I.A. et al., 2013].
В исследовании при изучении 40 мутаций в образцах митохондриальной ДНК (мтДНК), выделенных из пораженных атеросклерозом и нормальных участков интимы аорты 10 молодых людей, погибших вследствие несчастных случаев, обнаружено, что уровни гетероплазмии десяти мутаций мтДНК (A1555G, С3256T, G12315A, T3336C, G13513A, C5178A, G15059A, G14459A, G14846A, 652insG) были значительно выше в участках аорты, пораженных атеросклерозом [Sazonova M. et al., 2009].
В исследовании с участием 191 пациента (84 мужчин, средний возраст 65,0±9,4 лет), из которых у 45 больных были клинические проявления ишемической болезни сердца (ИБС),была показана ассоциация между уровнем гетероплазмии мутации митохондриального генома С3256Т в лейкоцитах крови и атеросклеротическим поражением сонных артерий [Sobenin I.A. еt al., 2012].
В австрийском исследовании было установлено, что распространенность мутации митохондриального генома T16189C была значительно выше среди пациентов с ИБС(n=482) по сравнению со здоровыми лицами (n=481): 21,6% и 11,8% соответственно, р<0,0001 [Mueller E.E. et al., 2011]. Однако в этой работе использовался качественный, а не количественный метод оценки мутаций митохондриального генома.
Таким образом, исследования, посвященныеданной проблеме,немногочисленны, в связи с чем, изучение роли мутаций митохондриального генома в развитии атеросклероза коронарных и сонных артерий представляется актуальным.
Цель исследования.
Изучить связь мутаций митохондриального генома с наличием и выраженностью атеросклеротического поражения коронарных и сонных артерий.
Задачи исследования.
1. Оценить уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома (С3256Т, G12315A, G13513A, G14846A) в лейкоцитах цельной крови у пациентов с наличием и отсутствием коронарного атеросклероза.
2. Изучить связь между митохондриальными мутациями и тяжестью атеросклероза коронарных артерий.
3. Исследовать возможную связь мутаций митохондриального генома с классическими факторами риска атеросклероза.
4. Оценить уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома (С3256Т, G12315A, G13513A, G14846A) в лейкоцитах цельной крови у пациентов с различной степенью атеросклеротического поражения сонных артерий.
Научная новизна.
В работе был использован метод количественной оценки мутантного аллеля митохондриального генома на основе технологии пиросеквенирования для определения уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома. Впервые проведено исследование мутаций митохондриального генома у пациентов с наличием и отсутствием коронарного атеросклероза, верифицированного данными коронарной ангиографии. Установлено, что уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома С3256Т, G13513A выше у пациентов с коронарным атеросклерозом. Выявлена отрицательная связь мутации G12315Ac атеросклерозом коронарных артерий. Впервые изучена взаимосвязь изучаемых мутаций с выраженностью коронарного атеросклероза, установлена прямая связь мутации С3256Т состепенью атеросклеротического поражения коронарных артерий. Выявлена прямая зависимость между наличием атеросклероза сонных артерий и уровнем гетероплазмии мутаций митохондриального генома С3256Т, G14846A и обратная - с мутацией G12315A. Впервые было показано наличие прямой связи между мутацией митохондриального генома G14846A и уровнем липопротеида(а)[Лп(а)].
Практическая значимость работы.
В работе использована методика количественной оценки мутантного аллеля митохондриального генома. Показана связь уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома G13513A и С3256T с коронарным атеросклерозом, мутаций С3256Т, G14846A - с атеросклерозом сонных артерий.Учитывая полученные данные, мутации митохондриального генома могут быть использованы в качестве информативных генетических маркеров предрасположенности к атеросклерозу коронарных и сонных артерий.
Понимание точных механизмов, с помощью которых мутации митохондриального генома способствуют развитию атеросклероза, откроет новые мишени для разработки лекарственных препаратов.
Мутации митохондриального генома не связаны с классическими факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), такими как пол, курение, артериальная гипертония, ожирение, отягощенный семейный анамнез по ССЗ.
Впервые показана положительная связь между уровнем гетероплазмии мутации G14836A и уровнем Лп(а), что требует дальнейшего изучения.
Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в научную и практическую работу отдела проблем атеросклероза и отдела сердечно-сосудистой патологии НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ.
Апробация диссертации состоялась 11 ноября 2013 года на заседании межотделенческой конференции НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации результатов диссертационных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 220 отечественных и зарубежных источников. Диссертация содержит 31 таблиц, 23 рисунков.
Функции митохондрий
Митохондрии - это единственные органеллы, имеющие собственный геном. Митохондриальная ДНК человека (рисунок 1) представляет собой двухцепочечную кольцевую молекулу размером 16569 пар нуклеотидов, в которой расположены 37 генов, продукты которых участвуют в процессе выработки энергии в дыхательной цепи митохондрий. В их число входят 13 структурных генов, кодирующих субъединицы комплексов окислительного фосфорилирования, а также гены 22 транспортных РНК (тРНК) и двух рибосомальных РНК (рРНК), принимающих участие в синтезе белка непосредственно в митохондриях [Anderson S. еt al., 1981; Chan D.C. еt al., 2006]. В частности, под контролем митохондрального генома кодируются семь субъединиц АТФ-синтетазы, три субъединицы цитохромоксидазы и одна субъединица убихинол-цитохром-с-редуктазы [Kogelnik М.А. et al., 1998]. Дыхательная цепь расположена во внутренней мембране митохондрий и состоит из пяти сопряженно функционирующих ферментных комплексов, насчитывающих 86 субъединиц. Субъединицы, в основном, кодируются ядерными генами, но семь субъединиц первого ферментного комплекса (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6), один - третьего (цитохром В), три - четвертого (СОI, СОII, СОIII) и две - пятого (АТФаза 6 и 8) кодируются структурными генами мтДНК [Kogelnik М.А. et al., 1998].
Митохондриальная ДНК человека [Madamanchi N.R., 2007]. Митохондриальный геном отличается нестабильностью, в течение онтогенеза в нем возникают соматические мутации. Скорость мутирования мтДНК примерно в 10-17 раз выше, чем ядерной ДНК (яДНК) [Wallace D.C., 1987], что определяется совокупностью таких факторов, как особенности структурной организации митохондриального генома, функциональное состояние рибонуклеотидредуктазы, ошибки репликации, отсутствие защитных гистонов, неэффективная система репарации, близкое прилежание мтДНК к мембране, мутации ядерных генов, кодирующие белки, действующие в митохондриях, однако наиболее значительный вклад вносят активные формы кислорода [Тодоров И.Н., 2009].
Мутации мтДНК могут происходить как в соматических, так и в половых клетках. Последствия их различны, мутации в соматических клетках приводят к снижению производства энергии в клетке. Мутации, возникающие в половых клетках, могут передаваться следующим поколениям и приводить к развитию новых полиморфизмов или митохондриальных заболеваний. Митохондриальная ДНК передается преимущественно через цитоплазму яйцеклетки, то есть наследуется по материнской линии [Мазунин И.О. и др., 2010]. Разнообразие клинических симптомов митохондриальных заболеваний формируется за счет таких факторов, как гетероплазмия, пороговый эффект и эффект «бутылочного горлышка» («генетической воронки»). Существование множества копий мтДНК в клетке может приводить к возникновению гетероплазмии - состоянию, при котором в одной митохондрии, клетке или органе сосуществуют несколько вариантов мтДНК: мутантной и не мутантной, в отличие от гомоплазмии, когда все мтДНК идентичны [Kmiec B. еt al., 2006]. Митохондриальные мутации могут накапливаться в течение жизни индивида.
Пенетрантность и экспрессивность митохондриальных мутаций варьируют в широких пределах и зависят от многих факторов, но, главным образом, от генотипа и уровня гетероплазмии [Wonnapinij P. еt al., 2008].
При делении клетки митохондрии распределяются между дочерними клетками случайным образом вследствие митотической сегрегации, в результате чего дочерние клетки могут различаться уровнем гетероплазмии [Wonnapinij P. еt al., 2008]. Предполагается, что в дочерних (соматических) клетках скорость сдвига в сторону мутантных мтДНК, либо мтДНК дикого типа определяется составом нуклеоида родительской клетки. Если материнская клетка содержит гетероплазматические нуклеоиды, то колебание уровня гетероплазмии дочерних клеток остается незначительным, однако, если нуклеоиды гомоплазматические – уровень гетероплазмии дочерних клеток различается весьма значительно и зависит от отбора и генетического дрейфа [Gilkerson R.W. еt al., 2008, 2009]. Уровень гетероплазмии мутации мтДНК определяет тяжесть митохондриального заболевания. Для манифестации заболевания необходимо, чтобы количество мутантной мтДНК превысило определенный уровень – это явление получило название «порогового эффекта» [Lightowlers R.N., 1997]. Митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии. Зрелые яйцеклетки содержат около 100000 копий мтДНК [van Blerkom J. еt al., 2008]. Несмотря на большое число копий мтДНК в яйцеклетке, уже в следующем поколении мтДНК может быть представлена новыми вариантами, это проявление эффекта «бутылочного горлышка» («генетической воронки») [Cree L.M., 2008]. После оплодотворения происходит череда зиготических делений без деления митохондрий, в результате чего количество митохондрий уменьшается вдвое с каждым клеточным делением. Поскольку количество митохондрий, характерное для зрелой яйцеклетки, происходит из весьма ограниченного набора митохондрий первичных половых клеток, вновь образовавшиеся митохондрии будут, очевидно, гомогенными по составу [Мазунин И.О. и др., 2010]. Роль «генетической воронки» в эволюции заключается, вероятно, в поддержании гомоплазмии мтДНК, минимизируя гетероплазмию [Cummins J.M. et al., 2001]. В связи с тем, что миотохондриальные болезни в ряде случаев могут быть обусловлены повреждением ядерного генома, передача заболевания будет соответствовать менделевским законам наследования. В тех же случаях, когда развитие болезни обусловлено мутациями мтДНК, наследование будет соответствовать митохондриальному типу, то есть передаваться по материнской линии [Мазунин И.О. и др., 2010]. Если патология развивается при одновременном повреждении генов ядерного и митохондриального геномов, наследование будет носить сложный характер и определяться различными факторами [Мазунин И.О. и др., 2010].
Мутации митохондриального генома, ассоциированные с атеросклерозом коронарных и сонных артерий
Митохондриальный биогенез и регулирование митохондриальных функций является результатом сложного процесса, который включает в себя скоординированную экспрессию митохондриальных и ядерных генов [Camara A.K. et al., 2010]. Большая часть мтДНК кодирует белки дыхательной цепи. Ядерная ДНК кодирует часть митохондриальных белков и регулирует многочисленные митохондриальные функции. Например, комплексы I и III кодируются яДНК и мтДНК, тогда как комплекс II кодируется только яДНК. Некоторые субъединицы IV комплекса, в зависимости от типа тканей, также могут быть закодированы мтДНК [Kogelnik A.M. et al., 1998].
По литературным данным, с атеросклерозом ассоциируется 17 мутаций митохондриального генома. Эти мутации локализуются в 6 генах тРНК, генах субъединицы 12S рРНК, генах второй и пятой субъединиц НАДН- дегидрогеназы. Мутации G1541A, A1555G расположены в гене 12S рРНК, приводящие к снижению функции рибосом. Ассоциированы с такими заболеваниями, как кардиоэнцефаломиопатия, ИБС, глухота [Jaksch M. et al., 2000, 2001; Lu J. et al., 2000]. Мутация C1624T локализована в гене тРНК–Val, при её наличии происходит замена цитозина на урацил в позиции 25 тРНК-Val, вследствие чего происходит изменение вторичной структуры тРНК, что приводит к снижению активности тРНК–Val. Данная мутация ассоциирована с гипертрофической кардиомиопатией [Pohjoismki J.L. et al., 2010; Rorbach J. et al., 2008]. Мутации C3256T, A3243G, A3260G расположены в гене тРНК–Leu, приводят к снижению ее активности. Асоциированы с синдромом MELAS [Connolly B.S. et al., 2010; Jeppesen T.D. et al., 2003; Nomiyama T. et al., 2004]. Мутации A4269G, A4300G, A4317G расположены в гене тРНК–Ile, вызывают дефект тРНК–Ile, приводя к снижению ее активности, при наличии данных мутаций развиваются такие заболевания, как несемейная дилатационная и гипертрофическая кардиомиопатия, глухота, эпилепсия, фатальная детская кардиомиопатия [Arbustini E. et al., 1998; Degoul F. et al., 1998; Tomari Y. et al., 2003; Taylor R. et al., 2003]. Мутация A4833G расположена в гене субъединицы НАДН-дегидрогеназы, приводит к снижению функции фермента. Способствует развитию инсулин-зависимого сахарного диабета [Kong Q.P. et al., 2006]. Мутации A8296G, G8363A возникают в гене тРНК–Lys, вызывают дефект тРНК–Lys, приводя к снижению её активности [Bornstein B. et al., 2005]. Ассоциированы с такими заболеваниями, как энцефаломиопатия, нейросенсорная тугоухость, гипертрофическая кардиомиопатия, синдром MERR [Santorelli F.M. et al., 1996]. Мутация T9997C расположена в гене тРНК–Gly, при наличии которой наблюдается дефект тРНК–Gly, приводящий к снижению ее активности [Raha S. et al., 1999]. Вызывает развитие гипертрофической кардиомиопатии у детей [Turner L.F. et al., 1998]. G12192A – мутация гена тРНК–His, приводящая к снижению ее активности, вызывает дилатационную гипертрофию [Mimaki M. et al., 2003; Shin W.S. et al., 2000]. T12297C, G12315A – мутации, расположенные в гене тРНК-Leu, приводят к снижению ее активности. Ассоциированы с ткими заболеваниями, как ИБС, офтальмоплегия, птоз, нейросенсорная тугоухость, пигментная ретинопатия [Fu K. et al., 1996; Grasso M. et al., 2001]. Мутация G14846A ведет к изменению аминокислотного состава цитохрома В, который является частью комплекса III дыхательной цепи. При мутировании меняется аминокислота глицин на серин, что создает дополнительный сайт фосфорилирования белковой цепи [Andreu A.L., 1998].
Мутация G13513A возникает в гене субъединицы 5 НАДН-дегидрогеназы, вызывая дефект белковой цепи фермента, приводя к снижению его функции [Chol M. et al., 2003]. Ассоциирована со следующими заболеваниями молочнокислый ацидоз, MELAS синдром, болезнь Лебера [Shanske S. et al., 2008].
В исследовании, выполненном в ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ, при изучении мутации митохондриального генома G14459А в образцах ДНК, выделенных из пораженных атеросклерозом и нормальных участков интимы аорты 10 молодых людей, погибших вследствие несчастного случая, обнаружено, что уровень гетероплазмии значительно выше в атеросклеротически измененных участках аорты [Sazonova M. et al., 2009]. Мутация G14459А вызывает дефект шестой белковой субъединицы фермента дыхательной цепи митохондрий, способствуя изменению работы НАДН-дегидрогеназы. Ассоциация данной мутации с атеросклеротическим поражением, возможно, связана с тем, что уменьшение количества нормально функционирующих ферментов в митохондриях приводит к окислительному стрессу клеток интимы сосудов человека.
В клиническом исследовании, выполненном в ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ с участием 191 больных, была показана ассоциация между уровнем гетероплазмии мутации С3256Т в лейкоцитах крови и атеросклеротическим поражением каротидного бассейна, а также наличием ИБС. У лиц, перенесших инфаркт миокарда, был отмечен более высокий уровень гетероплазмии по полиморфизму С3256Т по сравнению с лицами без инфаркт миокарда в анамнезе [Sobenin I.A. еt al., 2012]. Еще в одной работе, выполненной в ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ, проведен анализ уровня гетероплазмии мутации 652insG митохондриального генома человека. Полученные результаты показывают значительную гетероплазмию данной мутации, не только между различными участками интимы аорты, но и между лейкоцитами крови больных атеросклерозом и здоровых доноров.
Был определен пороговый уровень гетероплазмии мутации 652insG митохондриального генома и он равен 20% [Сазонова М.А. и соавт., 2010г].
В другом исследовании сравнивали частоту встречаемости мутации T16189C мтДНК у пациентов с ИБС (n=482) и сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа) (n=505) со здоровыми европейцами (n=1481), проживающими в Австрии. По сравнению с контрольной группой, распространенность мутации T16189C была значительно выше среди пациентов с ИБС (11,8% против 21,6%), а также у пациентов с СД 2 типа (11,8% против 19,4%) [Mueller E.E. et al. 2011]. Ассоциация мутации T16189C с ИБС, но не с СД 2 типа, оставалась весьма значительной после внесения поправки на возраст, пол и индекс массы тела. Данное исследование впервые показало ассоциацию мутации T16189C митохондриального генома с ИБС у лиц европейского населения. Ассоциация мутации Т16189С с ИБС предположительно является результатом изменения белков, связанных с этим регионом, что впоследствии приводит к нарушению репликации мтДНК [Poulton J. еt al., 2002].
Инструментальные методы обследования
Коронарографию проводили в лаборатории рентгенэндоваскулярных методов диагностики и лечения в амбулаторных условиях научно-диспансерного отдела НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова (руководитель - д.м.н. Ю.Г. Матчин). Коронарография выполнялась на аппарате Allura Xper FD-10 (Philips, Нидерланды). Изображение левой коронарной артерии регистрировалось в ортогональных стандартных проекциях, изображение правой коронарной артерии – в двух стандартных проекциях. Скорость регистрации изображения составляла 15 кадров в секунду. Автоматический количественный анализ ангиограмм проводился на цифровой системе “Xcelera” (Philips, Нидерланды). Для автоматического количественного анализа ангиограмм выбирался конечный диастолический кадр проекции с визуализацией максимальной степени стенозирования.
Оценка поражения коронарного русла проводилась на основе ангиографической симптоматологии по двум методикам: 1) с учетом числа пораженных магистральных артерий (1; 2; 3), имеющих сужение просвета более 70% по диаметру; 2) по суммарному индексу стенозов (индекс Gensini), учитывая степень уменьшения просвета 15 основных сегментов коронарных артерий (Рекомендации Американской Ассоциации Сердца, 1975): ствол левой артерии, проксимальные, средние и дистальные сегменты трех магистральных артерий, септальные, первая и вторая диагональные ветви передней нисходящей артерии, артерии тупого края, задне-боковая и задне-нисходящая артерии. Одним баллом оцениваются сужение просвета артерии до 50% по диаметру; 2 - на 50 - 74%; 3 - на 75 - 99% и 4 - окклюзия сосуда. Сумма баллов, полученная при оценке поражения коронарного русла, представляет собой коронарный индекс стенозов для каждого больного.
Инструментальные методы исследования проводили в отделе новых методов исследования НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова (руководитель - д.б.н., проф. А.Н. Рогоза).
Дуплексное сканирование экстракраниального отдела брахиоцефальных артерий проведено 178 пациентам (92%). Исследование брахиоцефального ствола, правой и левой общих сонных артерий, внутренних и наружных сонных артерий, позвоночных и подключичных артерий проводилось по стандартной методике в В-режиме с цветовым допплеровским картированием потоков линейным датчиком 7 Мгц ультразвуковой системы «АСUSON 128 ХР 10», а также на аппарате Philips iU 22 и Philips Ewiser. У всех больных оценивали наличие атеросклеротических бляшек с оценкой степени стенозирования. Атеросклеротическая бляшка определялась как «фокальная» структура, выступающая в просвет артерии не менее, чем на 0,5 мм или на 50% от величины толщины интима-медиа прилегающих участков артерии, либо имеющая толщину, измеренную как расстояние между линиями раздела «медиа - адвентиция» и «просвет артерия - интима» более 1,5 мм (по данным Международного консенсуса по ТИМ 2004-2006 годов) [Touboul P.J. et al., 2007].
Биохимическое исследование. Кровь для исследования брали из локтевой вены утром через 12-14 ч после последнего приема пищи. Определяли концентрацию ОХС, ТГ, холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛВП), в сыворотке крови ферментативным колориметрическим методом в лаборатории клинической биохимии липидного обмена (руководитель – д.б.н., проф. В.Н. Титов). Содержание ХС ЛНП рассчитывали по формуле Фридвальда (1972): ХС ЛНП = ОХС - ХС ЛВП - ТГ/2,2 (ммоль/л). Определение концентрации Лп(а) сыворотки крови выполняли в лаборатории проблем атеросклероза (рук. - д.б.н., проф. С.Н.Покровский) Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием моноспецифических поликлональных антител барана против Лп(а) человека [Афанасьева О.И. и др., 1995]. Также оценивали концентрацию глюкозы крови натощак. 2.4.2. Генетические исследования проводились в лаборатории медицинской генетики НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ (руководитель - д.м.н., проф. А.Ю. Постнов). Для данного клинического исследования было выбрано 4 мутации G13513A, G14846A, C3256Т и G12315A (таблица 2), для которых повышенный уровень гетероплазмии был связан с атеросклеротическим поражением по данным аутопсии [Sazonova M. et al., 2009]. Для исследования мутаций митохондриального генома (С3256Т, G12315A, G13513A, G14846А) кровь собирали в пробирки, содержащие этилендиаминтетраацетат в качестве антикоагулянта. Кровь замораживали и хранили при -20оС до проведения анализа. Выделение тотальной ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. Кровь размораживали, тщательно перемешивали и отбирали 700 мкл в пробирку типа «эппендорф» объемом 1,5 мл и добавляли 700 мкл Т10Е1-буфера (10мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1мМ ЭДТА), содержимое перемешивали на вортексе. Далее проводили осаждение клеточного осадка центрифугированием в течение 2 мин при 13400 об/мин на центрифуге «Mini Spin». Удаляли супернатант, клеточный осадок расуспендировали на вортексе, затем добавляли 1 мл Т10Е1-буфера и повторяли осаждение клеток центрифугированием. Удаляли весь супернатант. Повторяли отмывку несколько раз. К полученному клеточному осадку добавляли 400 мкл буфера для протеиназы К (10мМ Трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl), содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 100 мкг/мл протеиназы К. Протеиназу К добавляли перед выделением. Полученную смесь инкубировали при 50оС в термостате течение 60омин. Далее пипетированием ресуспендировали осадок и инкубировали при температуре 500С 18 часов. Спустя 18 часов к клеточному осадку добавляли равный объем (400 мкл) смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт. Далее путем вортексирования перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут на микрофуге при 13400 об/мин. Верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку, добавляли 400 мкл хлороформа. Перемешивали на вортексе, путем центрифугирования разделяли фазы в течение 10 минут при 13400 об/мин. Верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку и добавляли равный объем изопропилового спирта. Покачиванием осаждали ДНК. Центрифугировали 1 минуту при 13400 об/мин. К осадку добавляли 1 мл 70% этанола, аккуратно перемешивали, центрифугировали 1 минуту при 13400 об/мин. Супернатант удаляли, а осадок высушивали на воздухе при комнатной температуре. Осадок ДНК растворяли в 100 мкл Т10Е1-буфера, инкубировали при 65оС в течение 10 мин.
ПЦР проводили по схеме: денатурация ДНК при 94С в течение 4 мин. Затем проводили 35 циклов амплификации, включающей в себя денатурацию ДНК (94С/30 секунд), отжиг праймеров (56С/30 секунд для C3256T, G13513A, G14846A и 50С/30 секунд для G12315A) и элонгацию (синтез второй цепи) 72С/1 мин. По окончании 35 циклов осуществляли заключительную элонгацию 72С/7 мин. Для каждого запуска амплификатора вместе с пробами ставился отрицательный контроль, по составу идентичный анализируемым пробам, но вместо раствора ДНК содержащий стерильную воду. Таким образом, при отсутствии амплификации в отрицательном контроли, делали вывод об отсутствии контаминации остальных образцов чужеродными фрагментами ДНК.
Оценка взаимосвязи классических факторов риска атеросклероза с мутациями митохондриального генома
Явления гетероплазмии были обнаружены для всех изучаемых мутаций мтДНК лейкоцитов крови в большинстве образцов крови, уровни гетероплазмий мутаций представлены в таблице 8. Таблица 8. Уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома у обследованных пациентов (n=193).
Все исследуемые мутации расположены в кодирующей области митохондриального генома. Для всех мутаций распределение уровней гетероплазмии значительно отличалось от нормального (тест Колмогорова-Смирнова с коррекцией по Лиллиефорсу, p 0,001). Мы проанализировали связь между уровнем гетероплазмии исследуемых мутаций и наличием КА (таблица 9). Уровень гетероплазмии по мутации С3256Т был выше среди больных с КА 8,6% (7,7; 9,6) по сравнению с лицами без КА 8,1% (6,8; 9,1), p=0,01 (рисунок 6). Уровень гетероплазмии по мутации G13513A был достоверно выше среди больных с КА 5,4% (3,5; 8,6) по сравнению с лицами без КА 4,7% (3,2; 6,8), p=0,03 (рисунок 7), тогда как уровень гетероплазмии по мутации G12315A был значимо выше у лиц без КА 19,2% (15,4; 25,0) по сравнению с 15,5% (11,6; 23,2) в группе с КА, р=0,004 (рисунок 8). По мутации G14846A различий по группам выявлено не было. Для оценки возможной взаимосвязи изучаемых мутаций митохондриального генома с возрастом был проведен корреляционный анализ по Спирмену. С возрастом выявлена слабая позитивная связь для мутации G14846A (рисунок 9). Для других мутаций митохондриального генома взаимосвязи с возрастом не установлено.
При проведении корреляционного анализа не установлено взаимосвязи мутаций митоходриального генома с полом, курением, артериальной гипертонией, с отягощенным семейным анамнезом по ССЗ, как по отцовской, так и по материнской линии.
С наличием гиперлипидемии отмечена прямая положительная связь мутации C3256T (r=0,18, р=0,01) (рисунок 10) и обратная для мутации G12315A (r= -0,2, р=0,005) (рисунок 11). Для других мутаций зависимости выявлено не было. Рисунок 10. Взаимосвязь уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома С3256Т и гиперлипидемии. Рисунок 11. Взаимосвязь уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома G12315A и гиперлипидемии.Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у мужчин и артериальная гипертония и ожирение отличий между группами выявлено не было. Уровень Лп(а) был выше при наличии КА, а концентрация ОХС, ХС ЛНП была ниже среди больных с КА. Более высокий уровень гетероплазмии мутаций G13513A и C3256T отмечен среди мужчин с КА, в то время как уровень гетероплазмии G12315A был достоверно выше среди пациентов без КА.
Далее мы проанализировали распределение факторов риска и мутаций митохондриального генома у лиц моложе 45 лет (таблица 12). Не выявлено отличий между больными с КА и без КА по полу, возрасту, артериальной гипертонии, отягощенному анамнезу по отцовской и материнской линиям. Лиц с курением в анамнезе было существенно больше в подгруппе с КА; тогда как ожирение встречалось чаще в подгруппе без КА. Уровень ОХС, ХС ЛНП был достоверно выше среди пациентов без КА. По таким показателям как ХС ЛВП, ТГ, Лп(а) подгруппы не различались. Уровень гетероплазмии по мутации C3256T был достоверно выше в подгруппе с КА, в то время как по другим мутациям отличий между подгруппами не выявлено.
Среди лиц старше 45 лет в подгруппе с КА (таблица 13) преобладали мужчины – 88 % по сравнению с 53 % в подгруппе без КА. Между подгруппами нет отличий по частоте артериальной гипертонии, ожирению, отягощенной наследственности по отцовской и материнской линиям. Лиц с курением в анамнезе было значительно больше в подгруппе с КА: 65% против 24% при отсутствии КА. Уровень ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП был достоверно выше в подгруппе без КА, в то время как концентрация Лп(а) была выше у больных с КА: 49 (7; 99) мг/дл в сравнении с 19 (5; 61) мг/дл среди пациентов контрольной группы. Уровень гетероплазмии мутации G13513A был достоверно выше среди больных с КА по сравнению с контрольной группой. По другим мутациям подгруппы не различались. Таблица 13. Сравнительная характеристика пациентов старше 45 лет.
Далее мы проанализировали больных без артериальной гипертонии (таблица 15). В подгруппе больных без АГ и с КА преобладали мужчины, средний возраст которых был сопоставим с возрастом мужчин в подгруппе без КА. Подгруппы не различались по ожирению, отягощенному семейному анамнезу, как по отцовской, так и материнской линиям. Среди больных с КА было значительно больше курящих лиц (p 0,001). Концентрация ТГ, Лп(а) была выше при наличии КА. Уровень гетероплазмии по мутациям G13513A, C3256T и G12315A был достоверно выше у больных с КА. Таблица 15. Сравнительная характеристика больных без артериальной гипертонии.
Среди пациентов с артериальной гипертонией (таблица 16) в подгруппе с КА преобладали мужчины 86% против 56% в подгруппе без КА, они были старше мужчин без КА. Курение чаще встречалось при наличии КА (p=0,0005). Подгруппы были сопоставимы по ожирению, отягощенному семейному анамнезу, как по материнской, так и по отцовской линии. Уровни ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, ТГ были достоверно выше в подгруппе пациентов без КА, тогда как концентрация Лп(а) была выше у больных КА. Различий по уровням гетероплазмии всех четырех мутаций среди подгрупп выявлено не было. Таблица 16. Сравнительная характеристика больных с артериальной гипертонией.
В подгруппе некурящих среди больных с КА преобладали мужчины, они были старше мужчин без КА (таблица 17). Среди пациентов без КА больше было женщин 50% против 24 % в подгруппе с КА, по возрасту женщины обеих подгрупп были сопоставимы. По ожирению, отягощенному анамнезу по отцовской линии подгруппы не различались, в то время как отягощенный анамнез по материнской линии встречался только у больных ИБС. По уровню ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, ТГ подгруппы не различались. Концентрация Лп(а) была достоверно выше в подгруппе больных с КА. В сравниваемых подгруппах уровень гетероплазмии мутаций G13513A, С3256T был выше у больных с КА. Уровень мутаций G14846A и G12315A между подгруппами не отличался.
Мы выделили в отдельную группу пациентов без таких факторов риска атеросклероза как курение и артериальная гипертония (таблица 19). Между подгруппами не отмечено отличий по полу, возрасту, отягощенной наследственности по отцовской и материнской линиям, ожирению, уровню ОХС, ТГ. Уровень ХС ЛНП и ХС ЛВП был выше среди пациентов без КА, в то время как высокий уровень Лп(а) был связан с наличием КА. Уровень гетероплазмии мутации C3256T был выше среди больных с КА, а уровень гетероплазмии мутации G12315A был выше у пациентов без КА.
